馮 輝，金明根，金鐵峰

(1.延邊大學附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科，吉林延吉 133000；2.延邊大學腫瘤研究中心，吉林延吉 133002)

在我國，肺癌的發(fā)病率及病死率居于各類惡性腫瘤的首位[1-2]。本課題組前期研究結果發(fā)現，埃茲蛋白(Ezrin)在非小細胞肺癌組織中明顯高表達，且與腫瘤的惡性程度及不良預后呈正相關[3-5]。L1細胞黏附分子(L1-cell adhesion molecule,L1CAM)可以使細胞間黏附性喪失，現已證實其與腫瘤發(fā)生轉移密切相關[6-8]。最新的研究證實Ezrin可與L1CAM緊密結合行使重要功能[9]，但其具體機制不詳。本研究旨在探討Ezrin通過調控L1CAM的表達促進肺癌發(fā)生轉移的機制，為臨床診治肺癌提供新的理論基礎，現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 肺癌細胞系人肺大細胞癌細胞H460、人肺鱗癌細胞EBC-1、人肺腺癌細胞A549、人肺腺癌細胞PC9、人肺腺癌細胞H1299、人肺巨細胞癌細胞95D等(美國ATCC公司)；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司)；胰蛋白酶(美國Santa Cruz 公司)；鼠抗人Ezrin及L1CAM抗體(美國Abcam公司)；電化學發(fā)光(ECL)試劑盒(美國Pierce公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 試驗選取肺癌細胞系H460、EBC-1、A549、PC9、H1299、95D等細胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，3 ℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)、傳代。

1.2.2RT-PCR檢測肺癌細胞系H460、EBC-1、A549、PC9、H1299、95D 細胞Ezrin的表達 用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞，以Triozol充分裂解細胞后，加入氯仿震蕩，加入異丙醇靜置，反應溫度為95 ℃變性，58 ℃退火，72 ℃延伸。行凝膠電泳，最終置于凝膠成像儀分析結果，分析各細胞系Ezrin的表達水平。Ezrin引物序列：上游5′-TGGAGTTGATGCCCTTGGAC-3′;下游 5′-AGTCAGGTGCCTTCTTGTC-3′。

1.2.3Westem blot檢測 通過Western blot 檢測肺癌細胞系H460、EBC-1、A549、PC9、H1299、95D 細胞Ezrin蛋白的表達，將上述細胞系以冷PBS洗2次后提取總蛋白，二喹啉甲酸法(BCA)測定蛋白濃度，8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳垂直電泳進行蛋白分離，轉至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，室溫下?lián)u床封閉[Tris緩沖生理鹽水吐溫(TBST)+5%脫脂奶粉]2 h，加入一抗，4 ℃過夜。洗膜后加入辣根過氧化物酶二抗，孵育2 h。ECL曝光，觀察并拍照。試驗重復3次。

1.2.4應用siRNA沉默高轉移肺癌95D細胞系Ezrin的表達 應用Ezrin小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA，由廣州銳博公司構建)沉默肺癌高轉移細胞系95D的Ezrin的表達。Ezrin siRNA-1正義鏈：5′-AAGGAAUCCUUAGCGAUGAGAdTdT-3′,反義鏈：3′-dTdTUUCCUUAGGAAUCGCUACUCU-5′。Ezrin siRNA-2正義鏈：5′-GGAAUCCUUAGCGAUGAGAdTdT-3′,反義鏈：3′-dTdTCCUUAGGAAUCGCUACUCU-5′。選取Ezrin沉默效率更高的Ezrin siRNA-1進行后續(xù)試驗。通過Western blot檢測沉默有效性。

1.2.5劃痕試驗 應用劃痕實驗對比肺癌高轉移細胞系95D細胞和Ezrin沉默后95D細胞(siEzrin-95D)的遷移能力 將5×105個細胞(95D細胞和siEzrin-95D細胞)接種于10 cm培養(yǎng)皿中，待細胞融合度達到80%，用移液槍槍頭在單層細胞上劃一條直線，用PBS清洗3次。培養(yǎng)48 h后觀察周邊細胞生長程度并拍照，進行比較分析。

1.2.6L1CAM蛋白表達檢測 檢測Ezrin基因沉默前后高轉移肺癌細胞95D和低轉移肺癌細胞H460的L1CAM蛋白表達。同樣應用小干擾RNA沉默95D和 H460細胞的Ezrin的表達，進一步通過Western blot檢測95D、siEzrin-95D、H460、siEzrin-H460細胞的L1CAM蛋白表達情況。

2 結 果

2.1Ezrin促進肺癌細胞遷移 RT-PCR及Western blot結果顯示在高轉移肺癌細胞系95D及PC9中Ezrin 表達均明顯高于低轉移肺癌細胞系H460及EBC-1(圖1)。應用siRNA沉默95D細胞Ezrin基因表達，通過Western blot驗證Ezrin基因沉默有效性(圖2A)后，進一步通過細胞劃痕試驗發(fā)現，與95D細胞相比,siEzrin-95D細胞的遷移能力明顯減弱(P<0.05)，見圖2B、C。

A:RT-PCR檢測各組細胞系中Ezrin的表達；B：Western blot檢測各組細胞系中Ezrin的表達。

圖1細胞系中Ezrin的表達

A:Western blot檢測95D細胞及siEzrin-95D細胞中Ezrin的表達；B：劃痕試驗 95D細胞及siEzrin-95D細胞經處理48 h后細胞遷移情況；C：劃痕試驗結果定量分析

圖2 Ezrin沉默對95D細胞遷移能力的影響

A．Western blot檢測Ezrin基因沉默前后95D細胞和H460細胞L1CAM的表達；B.L1CAM蛋白的定量分析

圖3 siRNA沉默95D細胞和H460細胞Ezrin

后細胞中L1CAM蛋白比較

2.2Ezrin 通過L1CAM信號通路調控肺癌細胞的遷移能力 前面試驗已經證實，沉默95D細胞Ezrin表達后，其細胞遷移能力明顯下降。進一步研究發(fā)現siRNA沉默95D及H460細胞Ezrin表達后，與95D及H460細胞比較，siEzrin-95D及siEzrin-H460細胞中L1CAM的表達明顯下調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

3 討 論

研究發(fā)現，Ezrin在肺癌組織中的表達明顯高于癌旁正常組織，在有淋巴及遠隔轉移的非小細胞肺癌中陽性表達率顯著高于無淋巴轉移者，且與肺癌遠處轉移呈正相關[10]。Ezrin可以通過EGFR信號通路調控非小細胞肺癌的演進[11]。L1CAM在腫瘤的轉移過程中起重要作用[12-13]。通過生物信息學網站檢索發(fā)現Ezrin與L1CAM具有密切的相關性，提示Ezrin基因可能通過調控L1CAM的表達而促進肺癌發(fā)生遠處轉移，但其具體調控機制目前鮮見報道，還有待于深入研究。KUDUMALA等[9]的研究證實Ezrin可以特異地與L1CAM結合，在黑腹果蠅的神經傳導過程中起重要作用。AIKAWA[14]研究表明，L1CAM在靠近細胞膜表面的部位存在Ezrin泛素化結合域，并對其基因表達、轉錄調節(jié)、信號傳遞等一系列生命活動起到重要影響。KIEFEL等[15]在肺癌細胞系的研究中發(fā)現，Ezrin結合到L1CAM蛋白后可以介導并活化核因子kappa B(NF-κB)信號通路，從而促進表皮間質化(MET)的發(fā)生。

本研究結果顯示，Ezrin在高轉移能力肺癌細胞系中的表達顯著高于低轉移能力的肺癌細胞系。通過siRNA沉默抑制肺癌細胞Ezrin的表達后肺癌細胞遷移能力明顯下調，且Ezrin表達水平下調后L1CAM的表達顯著受到抑制。這提示，Ezrin的表達與肺癌細胞的遷移能力具有密切相關性，其機制可能是通過調控L1CAM信號通路而實現的。Ezrin及L1CAM分子有可能成為控制肺癌發(fā)生遠處轉移的重要靶點，該研究結果為臨床診治肺癌，尤其是預防肺癌發(fā)生轉移提供了重要的研究線索。

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