杜皓云 譯

一、介紹

冠狀病毒亞科的冠狀病毒傳統(tǒng)上分為3個(gè)屬，即α冠狀病毒，β冠狀病毒和γ冠狀病毒。最近增加了另一種新型屬，δ冠狀病毒。在不同的宿主物種中發(fā)現(xiàn)了這類病毒，包括一些哺乳動(dòng)物和鳥類物種。此后，2014年在美國俄亥俄州首次發(fā)現(xiàn)PDCoV/SDCV，并在美國的其他州也發(fā)現(xiàn)了這種病毒。最近在韓國，中國，泰國和老撾等亞洲國家也有發(fā)現(xiàn)PDCoVs。PDCoV是一種有囊膜的正向單鏈RNA病毒。

據(jù)日本農(nóng)業(yè)部報(bào)道，2013年10月-2015年9月，日本已發(fā)生1 000多起PED疫情，幾乎遍布所有地區(qū)。然而，自2014年以來，研究人員對(duì)幾個(gè)豬場的腹瀉糞便樣本進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)樣品中豬流行性腹瀉病毒（PEDV），傳染性胃腸炎病毒（TGEV），其他腸道病毒（輪狀病毒和腸道病毒）呈陰性。之前有研究報(bào)道稱，在PEDV流行的美國一些地區(qū)，患豬的糞便樣本中可同時(shí)檢出PDCoV。此外，已經(jīng)有三個(gè)研究小組證明PDCoV在實(shí)驗(yàn)感染的豬中具有致病性。因此，這些發(fā)現(xiàn)表明PDCoV是除PEDV之外，在日本的多個(gè)豬場引起腹瀉暴發(fā)的主要病原體之一。

本文中研究人員對(duì)2013年至2014年間來自腹瀉豬的大量糞便樣本的PDCoV進(jìn)行了特定PCR檢測，以確認(rèn)PDCoV在日本的流行，此外，研究人員使用新一代測序技術(shù)確定了7個(gè)日本PDCoV毒株的完整基因組序列，并使用這些序列通過比較和遺傳進(jìn)化分析來表明日本PDCoV毒株與其他國家公布的PDCoV毒株之間的遺傳關(guān)系。此外，研究人員對(duì)YMG/JPN/2014的日本PDCoV毒株接種剖宮產(chǎn)初乳剝奪的仔豬進(jìn)行了致病性研究。

二、 材料和方法

1.PDCoV的樣品采集。樣品來自在2013年11月—2014年8月期間，日本全國17個(gè)地區(qū)的多個(gè)養(yǎng)豬場發(fā)生腹瀉仔豬或豬。研究人員對(duì)477份糞便樣品進(jìn)行了PDCoV的特異性PCR檢測，樣品中的PEDV，TGEV和其它腸道病毒（輪狀病毒和腸道病毒）特異性PCR檢測結(jié)果呈陰性。將糞便樣品制備成在磷酸鹽緩沖鹽水中稀釋的10%懸浮液，4℃，3 000g 離心 10min。 使 用 QIAamp病毒RNA提取試劑盒提取病毒RNA。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RTPCR）來檢測糞便樣品中的病毒。

2.全基因組測序和進(jìn)化分析。使用 PrimeScripthigh Fidelity RT-PCR試劑盒，用隨機(jī)6聚體引物從72個(gè)PDCoV特異性PCR陽性樣品中合成DNA（cDNA）。從cDNA中產(chǎn)生幾乎完整的基因組，其由8個(gè)重疊的擴(kuò)增子組成（約4 kb長）。將8個(gè)擴(kuò)增子以等量合并，并使用新一代測序技術(shù)進(jìn)行分析。

3.病毒分離。將豬睪丸（ST）細(xì)胞維持在補(bǔ)充有10%胎牛血清（FBS）的生長培養(yǎng)基中。將6孔板中每孔ST細(xì)胞接種200μl 10%腸內(nèi)懸浮液，這些懸浮液含有5 μg/ml胰蛋白酶而不含F(xiàn)BS的生長培養(yǎng)基稀釋。在37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h后移除接種物，并用不含F(xiàn)BS的生長培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，并對(duì)每孔細(xì)胞加入3ml胰蛋白酶培養(yǎng)基。直到觀察到以圓形細(xì)胞為特征的細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），以 5d的間隔在ST細(xì)胞中傳代分離的病毒。用胰蛋白酶培養(yǎng)基連續(xù)稀釋該病毒原液10倍，并以每孔100μl接種于96孔板中生長的ST細(xì)胞中，每次稀釋8個(gè)孔。該平板在37℃，5%CO2下孵育7d。每日監(jiān)測病毒CPE，根據(jù)Reed和Muench描述的方法測定病毒滴度，并表示為TCID50/ml。

4.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。從兩種特定的無特定病原體母豬中獲得了初乳缺乏的新生仔豬，它們對(duì)傳染原非常敏感。將11只小豬（3日齡）隨機(jī)分成兩組：接種日本PDCoV分離株，YMG/JPN/2014的組1和組2（陰性對(duì)照組）。第1組的個(gè)體口服接種2×106TCID50/頭的病毒量。從接種后 0d（DPI）至 8d（DPI）每天收集每只小豬的糞便樣品，然后第8dPI后每3～4d收集每只小豬的糞便樣品。從0dPI至8dPI每隔2d從每只小豬采集血清樣品，在8dPI之后每3～4d采集血清樣品。分別在4和7dPI 從組1中隨機(jī)挑3只和組2中挑1只仔豬處安樂死進(jìn)行病理學(xué)檢查，監(jiān)測每組剩余的仔豬的臨床表現(xiàn)和病毒排放直至27dPI。為了檢查病毒分布情況，從接種PDCoV和對(duì)照的小豬中采集小腸和大腸及其他器官。

根據(jù)上述方法從動(dòng)物收集的10%糞便懸浮液，血清和10%組織勻漿中提取病毒RNA。通過RTPCR確定糞便，血清和各種組織中的病毒含量。

5.PDCoV特異性兔抗血清的制備。研究人員從美國國家獸醫(yī)服務(wù)實(shí)驗(yàn)室獲得美國PDCoV分離株，Michigan/8977/2014株，以產(chǎn)生PDCoV的兔抗血清。

通過間接免疫熒光測定法（IFA），研究人員使用FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體評(píng)估其針對(duì)PDCoV的兔抗血清在接種美國PDCoV分離株的ST細(xì)胞上的特異性。此外，通過IFA評(píng)估與PDCoV特異性兔抗血清的交叉反應(yīng)，但是抗血清不與PEDV和TGEV反應(yīng)。通過IFA評(píng)估與PDCoV特異性兔抗血清的交叉反應(yīng)，但抗血清不與PEDV和TGEV反應(yīng)。

6.免疫組織化學(xué)（IHC）。在 4dPI，7DPI和 27dPI下接種 PDCoV的和對(duì)照小豬的小腸和大腸以及其他器官用10%福爾馬林浸泡，石蠟包埋，切片，并安裝在載玻片上。用PDCoV特異性兔抗血清作為第一抗體用二氨基聯(lián)苯胺作為第二標(biāo)記抗體對(duì)組織進(jìn)行染色。

三、結(jié)果

1.日本PDCoV流行概況。在使用477個(gè)糞便樣品的PDCoV調(diào)查中，根據(jù)PDCoV特異性實(shí)時(shí)RTPCR，72個(gè)樣品（15.1%）呈陽性。表1總結(jié)了各年齡組PDCoV陽性樣本的檢出率。根據(jù)PDCoV的特異性PCR，母豬中幾乎有一半（48.3%）為陽性。育肥豬（120日齡以上）和斷奶仔豬（21～60日齡）分別以10.5%和10.3%顯示次高的陽性率。另外，研究人員的調(diào)查顯示自2014年2月以來，PDCoV在日本一直存在。

2.全基因組測序和進(jìn)化分析。使用新一代測序技術(shù)分析7個(gè)日本PDCoV毒株的完整基因組。表2總結(jié)了7種日本PDCoV毒株的信息。基于完整基因組的進(jìn)化分析表明，2014年在日本檢測到的7種PDCoV毒株與從2013年到2016年在美國和韓國的檢測的PDCoV毒株相關(guān)，來自日本和其他國家的PDCoV毒株的基因組比較分析顯示，日本PDCoV毒株的完整基因組與美國和韓國PDCoV毒株幾乎完全相同（99.7%～100%同一性），這些毒株與包括香港PDCoV毒株的中國PDCoV毒株和泰國，越南和老撾PDCoV毒株相比具有相當(dāng)?shù)牟町悾ū?）。

3.病毒分離。分離的病毒在ST細(xì)胞中有效地繁殖3代。通過RTPCR和免疫熒光測定，將分離株YMG / JPN / 2014 評(píng)估為 PDCoV。該分離株在ST細(xì)胞中另外繁殖4次，當(dāng)用于實(shí)驗(yàn)研究時(shí)其滴度為106TCID50/ml。

4.臨床癥狀和排毒。接種PDCoV的新生仔豬在2～11dPI期間出現(xiàn)急性水樣腹瀉，厭食，毛發(fā)枯燥和嚴(yán)重的虛脫，然后在整個(gè)觀察期間全部恢復(fù)并存活。在PDCoV接種的小豬的糞便和血清樣品中檢測到的PDCoV RNA顯示在圖2中。用日本PDCoV分離株接種

通過使用RT-PCR，在4和7DPI檢查PDCoV接種組的各種組織中的病毒分布（圖3）。在接種PDCoV的組中，病毒主要在從近空腸到直腸的腸組織中檢測到，并且在4dPI時(shí)在腸系膜淋巴結(jié)中以108～1010拷貝/ml的范圍檢測到病毒。此外，4dPI時(shí)，PDCoV特異性PCR還檢測到來自肝臟，2/3的胃，十二指腸樣品和1/3肌肉樣品的超過107的病毒RNA拷貝。在7DPI時(shí)，病毒主要分布在大腸。此外，從腸系膜淋巴結(jié)和2/3遠(yuǎn)端空腸和回腸樣本中檢測到超過107個(gè)病毒基因組拷貝。根據(jù)PDCoV特異性PCR，陰性對(duì)照組中的所有仔豬，血清和組織樣品均為陰性。

5.免疫組織化學(xué)。在4DPI尸檢時(shí)使用PDCoV特異性兔抗血清（表5），IHC染色檢測來自PDCoV接種組的樣品中從近端空腸至結(jié)腸的絨毛細(xì)胞質(zhì)和隱窩腸上皮細(xì)胞PDCoV抗原。PDCoV接種仔豬的平均IHC評(píng)分在空腸近端和盲腸至結(jié)腸低，中腸空腸至回腸高，十二指腸和直腸陰性。在7dPI，病毒主要分布在大腸，從盲腸到結(jié)腸病毒含量低。在27dPI時(shí)，在PDCoV接種組的任何組織中未鑒定到陽性染色。在陰性對(duì)照小豬的所有檢查組織中未檢測到IHC染色。

四、 討論

研究人員的調(diào)查顯示，在2013年-2014年，在日本幾個(gè)縣的腹瀉豬中獲得477個(gè)PEDV，TGEV和其他腸道病毒陰性糞便樣品中，有72個(gè)樣品（15.1%）PDCoV呈陽性。PDCoV陽性樣本的檢出率與2014年1～2月在美國收集的豬樣本調(diào)查中觀察到的相似（22%）。因?yàn)檠芯咳藛T沒有收集腹瀉樣本的豬群的詳細(xì)信息，他們的數(shù)據(jù)不能否認(rèn)這些腹瀉可能是由其他病原體（細(xì)菌和寄生蟲）引起的可能性，但是表明PDCoV會(huì)與這些腹瀉相關(guān)。此外，他們的數(shù)據(jù)還表明，PDCoV可以感染所有年齡組，類似于PEDV。特別是，研究者的調(diào)查顯示了帶PDCoV的母豬為最高的陽性檢測率。事實(shí)上，美國首次發(fā)現(xiàn)PDCoV的報(bào)道顯示，美國的PDCoVs是在患有水樣腹瀉的母豬檢測到的。在臨床觀察中，母豬不僅表現(xiàn)出嚴(yán)重的腹瀉，還表現(xiàn)出嘔吐和厭食。這些發(fā)現(xiàn)表明，老年豬對(duì)PDCoV可能比仔豬更敏感。然而，其假設(shè)將需要在未來進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

利用基因組序列構(gòu)建進(jìn)化樹表明，日本檢測到的7種PDCoV毒株與在2013—2016年來自美國和韓國的毒株相似。日本收集的PDCoV毒株與2004—2016年在其他國家收集的PDCoV毒株的基因組比較分析顯示，來自日本的PDCoV毒株的完整基因組幾乎與來自美國和韓國的完全基因組相同（99.7～100%）。因此，自2014年以來在日本出現(xiàn)的PDCoV毒株與自2013年以來在美國和韓國出現(xiàn)的那些毒株在遺傳上有關(guān)。此外，2014年以來發(fā)生在日本的PDCoV暴發(fā)可能是由于來自其他大型豬業(yè)的PDCoV毒株入侵日本而造成的。

為了測試YMG/JPN/2014毒株的致病性，使用剖宮產(chǎn)初乳剝奪的新生仔豬進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性感染。在臨床觀察中，感染該毒株后少數(shù)仔豬中出現(xiàn)輕度腹瀉，無嘔吐和厭食，但感染后的仔豬在5d后從腹瀉中恢復(fù)。相比之下，用日本PDCoV分離株接種的仔豬在2dPI時(shí)患有嚴(yán)重腹瀉，但是在11dPI時(shí)全部從腹瀉中恢復(fù)，并且存活直至27dPI。因此，PDCoV分離毒以及野毒使仔豬產(chǎn)生了腹瀉。然而，研究中仔豬腹瀉的嚴(yán)重程度和持續(xù)時(shí)間的差異可能是由不同的條件引起的，如接種量或宿主的易感性。

總之，研究人員首先發(fā)現(xiàn)自2014年2月以來PDCoV已在日本出現(xiàn)。他們的分析表明，自2013年底以來，PDCoV可能是導(dǎo)致日本豬群腹瀉的暴發(fā)的病原體。由于該研究中檢測到的PDCoVs與2013年以來在其他豬生產(chǎn)國家（如美國和韓國）出現(xiàn)的毒株有關(guān)，它們可能代表海外入侵，如PEDV入侵日本。