溫 蕊，侯建華，張艷芳，呂 品，馬 宇

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018； 2.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031)

向日葵(HelianthusannuusL.)屬菊科(Composite)向日葵屬(Helianthus)的一年生草本植物，起源于北美洲西南部，按籽粒的用途分為食用型、油用型和中間型3種類型。油用向日葵是世界上重要油料作物[1]，也是我國(guó)五大油料作物之一[2]，主要種植在我國(guó)華北、西北、東北的干旱和半干旱地區(qū)，是這些地區(qū)的主要油料作物，也是這些地區(qū)改良輕度鹽堿地的首選作物[3]。

隨著全球環(huán)境變化的加劇和生態(tài)平衡的破壞，水資源短缺已是全世界各國(guó)共同面臨的一個(gè)嚴(yán)峻問(wèn)題[4]。農(nóng)作物生產(chǎn)正面臨著越來(lái)越嚴(yán)重的干旱威脅，而對(duì)向日葵的消費(fèi)需求卻與日俱增。解決這一問(wèn)題的途徑，除了改善農(nóng)田環(huán)境，提高水分利用效率，使之適應(yīng)其生長(zhǎng)發(fā)育外，還需培育和推廣抗旱性強(qiáng)、具有優(yōu)良農(nóng)藝性狀的向日葵新品種，使之適應(yīng)干旱環(huán)境條件[5]。

種子萌發(fā)期是作物第一生長(zhǎng)發(fā)育階段，萌發(fā)期受干旱直接影響種子發(fā)芽出苗，進(jìn)而影響后期生長(zhǎng)發(fā)育，最終造成作物產(chǎn)量、質(zhì)量的下降。關(guān)于向日葵抗旱性的研究已有報(bào)道[6-8]，但有關(guān)向日葵種子萌發(fā)期抗旱性的研究還鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)采用18%PEG-6000溶液模擬向日葵種子在萌發(fā)期可能遇到的干旱環(huán)境，測(cè)定SOD、CAT、POD、丙二醛(MDA)含量等生理特性和發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率等萌發(fā)特性，并采用模糊隸屬函數(shù)對(duì)參試材料萌發(fā)期的抗旱性進(jìn)行綜合性評(píng)價(jià)，以期為向日葵種質(zhì)資源抗旱性鑒定及抗旱基因的發(fā)掘提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為油用向日葵共計(jì)18份，包括耐旱型自選系K58、K59和干旱敏感型自選系K55及以K55為母本、K58為父本雜交得到的雜種F1通過(guò)單粒傳方法獲得的192個(gè)F5重組自交系株系，在模擬干旱條件下(18%PEG-6000)發(fā)芽率高的10個(gè)株系(株系35>118>28>192>29>184>50>81>88>101)和發(fā)芽率低的5個(gè)株系(株系23>20>53>60>64)，分別取以上15個(gè)株系的F6種子。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子萌發(fā)特性的測(cè)定 按照李龍等[9]方法，選取18個(gè)供試材料各50粒飽滿種子，經(jīng)消毒處理(75%酒精消毒60 s，0.1% HgCl2消毒8 min，蒸餾水漂洗數(shù)次)，置于鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿(9 cm)中，分別加3 ml 18% PEG-6000溶液(模擬干旱)和蒸餾水(對(duì)照)，置于25℃恒溫光照培養(yǎng)箱中(光照周期為光/黑暗：8/16 h)培養(yǎng)10 d，期間每天更換濾紙以保持恒定PEG濃度，每個(gè)處理重復(fù)3次。

種子置床后第2 d開(kāi)始，每天統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽數(shù)，第4 d計(jì)算發(fā)芽勢(shì)(%)(GE)，發(fā)芽結(jié)束后計(jì)算發(fā)芽率(%)(GR)、發(fā)芽指數(shù)(GI)，從每個(gè)培養(yǎng)皿中隨機(jī)選取15株測(cè)量胚芽長(zhǎng)度(cm)(EL)、胚根長(zhǎng)度(cm)(RL)，稱量胚芽鮮重(g)(EFW)、胚根鮮重(g)(RFW)，將稱過(guò)鮮重的胚芽、胚根105℃烘干30 min，85℃烘干8 h后稱量胚芽干重(g)(EDW)、胚根干重(g)(RDW)。計(jì)算公式如下：

(1) 種子發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽率：

發(fā)芽率(GR)=(第7 d發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%；

相對(duì)發(fā)芽率(RGR)=(處理種子發(fā)芽率/對(duì)照種子發(fā)芽率)×100%。

(2) 發(fā)芽指數(shù)、相對(duì)發(fā)芽指數(shù)：

發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑(Gt/Dt)(Dt為發(fā)芽日數(shù)；Gt為相對(duì)應(yīng)的每日發(fā)芽數(shù))；

相對(duì)發(fā)芽指數(shù)(RGI)=(處理發(fā)芽指數(shù)/對(duì)照發(fā)芽指數(shù))×100%。

(3) 種子發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)發(fā)芽勢(shì)：

發(fā)芽勢(shì)(GV)=(第3 d發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%；

相對(duì)發(fā)芽勢(shì)(RGV)=(處理發(fā)芽勢(shì)/對(duì)照發(fā)芽勢(shì))×100%[10]。

(4) 相對(duì)性狀指標(biāo)(%)=滲透脅迫處理下各性狀測(cè)定值/對(duì)照各性狀測(cè)定值×100%。

1.2.2 生理生化指標(biāo)的測(cè)定 丙二醛(MDA)含量測(cè)定參照李合生[10]硫代巴比妥酸(TAB)比色法。超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定采用李合生[10]抑制氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原比色法測(cè)定，以每單位時(shí)間內(nèi)光還原50%氮藍(lán)四唑?yàn)?個(gè)酶活性單位，單位為U·g-1FW。過(guò)氧化物酶(POD)活性測(cè)定參照張憲政[11]愈創(chuàng)木酚法。過(guò)氧化氫酶(CAT)活性采用紫外吸收法測(cè)定。ATP含量測(cè)定按照蘇州科銘生物技術(shù)有限責(zé)任公司的ATP含量試劑盒分別測(cè)定萌發(fā)種子的ATP含量。對(duì)照組與處理組均在種子萌發(fā)試驗(yàn)72 h取樣，迅速研磨樣品得到新鮮酶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 抗旱性綜合評(píng)價(jià)方法

采用隸屬函數(shù)法進(jìn)行抗旱性綜合評(píng)價(jià)。隸屬函數(shù)值的計(jì)算公式(1)所示。

(1)

(2)

(3)

(4)

式中，Xij為i品種第j項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定值；Xjmin為全部品種第j項(xiàng)指標(biāo)的最小值；Xjmax為全部品種第j項(xiàng)指標(biāo)的最大值。μ(Xij)為i品種第j項(xiàng)指標(biāo)的隸屬函數(shù)值。Xj表示全部品種第j項(xiàng)指標(biāo)的平均值，Vj表示第j項(xiàng)指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)差系數(shù)，Wj表示第j項(xiàng)指標(biāo)權(quán)重，D表示各品種的抗旱性綜合評(píng)價(jià)，D值越大，抗旱性越強(qiáng)[12]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2007和SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對(duì)向日葵種子萌發(fā)特性的影響

從表1可以看出，18%PEG模擬干旱脅迫下，相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)發(fā)芽指數(shù)、相對(duì)胚根、胚芽長(zhǎng)度以及相對(duì)胚根、胚芽干重均低于1，表明干旱脅迫顯著抑制了種子的萌發(fā)。

不同供試材料間的比較發(fā)現(xiàn)，株系29、株系88、K59這3個(gè)材料的相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽勢(shì)和相對(duì)發(fā)芽指數(shù)均顯著高于其它材料，表明其對(duì)干旱脅迫的耐受性較強(qiáng)。相對(duì)發(fā)芽勢(shì)較低的株系23、101、184這3個(gè)材料在所有供試材料中的相對(duì)發(fā)芽率也最小。從相對(duì)胚芽長(zhǎng)度、相對(duì)胚根長(zhǎng)度、相對(duì)胚芽干重和相對(duì)胚根干重看(表1)，對(duì)干旱脅迫敏感的有株系81、184和192，對(duì)脅迫較不敏感的有株系29、88和K55。

表1 干旱脅迫下向日葵種子萌發(fā)特性相對(duì)值

注：同列中標(biāo)記不同字母的數(shù)據(jù)在0.05水平上差異顯著。相對(duì)發(fā)芽率：Relative germination rate(RGR)；相對(duì)發(fā)芽勢(shì)：Relative germination energy(RGE)；相對(duì)發(fā)芽指數(shù)：Relative germination index(RGI)；相對(duì)胚根長(zhǎng)：Relative radicle length(RRL)；相對(duì)胚芽長(zhǎng)：Relative germ length(RGL)；相對(duì)胚根干重：Relative radicle dry weight(RRDW)；相對(duì)胚芽干重：Relative embryo bud dry weight(REDW)。

Note： Data with mark different letters in a column significant difference at 0.05 level.

2.2 干旱脅迫對(duì)向日葵種子萌發(fā)期生理特性的影響

由表2可知，干旱脅迫下，供試不同材料間抗氧化保護(hù)酶系和丙二醛含量及ATP含量的差異較大，相對(duì)SOD酶活性變化介于1.22～0.06，相對(duì)CAT酶活性變化介于6.49～0.09，相對(duì)POD酶活性變化介于9.82～0.01，說(shuō)明干旱脅迫下，不同供試材料間抗氧化酶活性變化差異較大，有些明顯增加，如株系88、株系35、株系64、K55等；有些明顯降低，如K55、K58、株系28等。丙二醛含量與ATP含量也表現(xiàn)相同規(guī)律，相對(duì)MDA含量變化范圍為1.86～0.35，最高值為株系35，最低值為株系60；相對(duì)ATP含量變化范圍為14.17～0.08，最高值為株系35、株系88、株系81等，最低值為株系50、株系29、株系184等。

2.3 相關(guān)性分析

12個(gè)測(cè)定指標(biāo)相對(duì)值的相關(guān)分析(表3)表明，相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽勢(shì)與相對(duì)發(fā)芽指數(shù)之間，相對(duì)發(fā)芽指數(shù)與ATP含量相對(duì)值、相對(duì)胚芽長(zhǎng)度與相對(duì)胚芽干重之間均呈極顯著正相關(guān)；SOD酶活性相對(duì)值與POD酶活性相對(duì)值呈極顯著負(fù)相關(guān)。相對(duì)胚芽長(zhǎng)度分別與相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)發(fā)芽指數(shù)之間，相對(duì)發(fā)芽指數(shù)與相對(duì)胚芽干重，CAT酶活性相對(duì)值與ATP含量相對(duì)值之間均呈現(xiàn)顯著正相關(guān)。

從18個(gè)供試材料12個(gè)抗旱性相關(guān)指標(biāo)相關(guān)系數(shù)矩陣(表3)可以看出，所有測(cè)定指標(biāo)間都存在著相關(guān)性，從而使得它們所提供的信息發(fā)生重疊，同時(shí)各指標(biāo)在抗旱性中所起的作用也不盡相同，直接利用這些單個(gè)指標(biāo)進(jìn)行抗旱性評(píng)價(jià)可能具有不可靠性。

表2 干旱脅迫下向日葵種子生理特性的相對(duì)值

注：同列中標(biāo)記不同字母的數(shù)據(jù)在0.05水平上差異顯著。

Note： Data with mark different letters in a column significant difference at 0.05 level.

2.4 向日葵萌發(fā)期抗旱性綜合性評(píng)價(jià)

用隸屬函數(shù)法對(duì)18個(gè)向日葵材料的相對(duì)發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽指數(shù)等7個(gè)萌發(fā)特性和5個(gè)生理指標(biāo)的相對(duì)值進(jìn)行了綜合性評(píng)價(jià)，得到18個(gè)向日葵材料萌發(fā)期的綜合抗旱能力D值(表4)。D值越大表明抗旱性越強(qiáng)。供試18個(gè)材料D值變化范圍為0.36～1.49，其中株系88抗旱性最強(qiáng)，D值為1.49，184的抗旱性最弱，D值為0.36，K55和株系60抗旱性居中，D值分別為0.70和0.71。重組自交系株系88、35、29、64的D值顯著大于親本K55和K58，較大于非親本材料K59，說(shuō)明重組自交系群體出現(xiàn)了超親分離現(xiàn)象。

2.5 12個(gè)指標(biāo)與隸屬函數(shù)綜合評(píng)價(jià)值的相關(guān)分析

相對(duì)發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽指數(shù)、相對(duì)胚根長(zhǎng)度、相對(duì)胚芽長(zhǎng)度、相對(duì)胚芽干重、相對(duì)CAT活性、相對(duì)MDA活性和相對(duì)ATP含量均與隸屬函數(shù)綜合評(píng)價(jià)值顯著相關(guān)，表明這些指標(biāo)均可作為向日葵萌發(fā)期抗旱性篩選鑒定的主要參考指標(biāo)(表5)。

3 討 論

多數(shù)研究結(jié)果表明，干旱脅迫對(duì)植物體的生理生化過(guò)程有著不同程度的影響，而且受供試植物體間基因型的不同，植物體對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)也不盡相同。本研究PEG模擬干旱脅迫下，18個(gè)供試材料SOD、CAT、POD保護(hù)酶活性及MDA和ATP含量與對(duì)照相比有增有減，不同供試材料對(duì)同一生理指標(biāo)和同一材料對(duì)不同生理指標(biāo)對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)均存在顯著差異。ATP作為生命活動(dòng)中能量的重要攜帶者，為植物維持正常的生命活動(dòng)提供了保障。在干旱脅迫下，ATP含量的增加，為各種代謝活動(dòng)的正常進(jìn)行保持了較高的能荷，抗旱性能被直接和間接的增強(qiáng)了，表現(xiàn)出對(duì)于干旱脅迫的適應(yīng)性[13]。

表3 12個(gè)指標(biāo)的相關(guān)性系數(shù)矩陣

注(Note)：*：P<0.5；**：P<0.1。

表4 18個(gè)向日葵材料的隸屬函數(shù)值及抗旱性綜合評(píng)價(jià)

作物抗旱性是一個(gè)受多因素影響、復(fù)雜的數(shù)量性狀[14]。白玉[15]、王賀正[16]等人的研究結(jié)果表明單一的使用某一指標(biāo)的絕對(duì)值來(lái)比較不同品種的抗旱性，不能消除品種間固有差異的影響。本文采用干旱脅迫與其對(duì)照的相對(duì)值進(jìn)行分析，可以消除品種間固有差異，使得供試材料間抗旱性的比較鑒定更為準(zhǔn)確，如本實(shí)驗(yàn)中干旱脅迫下低發(fā)芽率的株系60，其相對(duì)發(fā)芽率顯著高于高發(fā)芽率株系101、株系81和株系192。而且通過(guò)單一的一、二個(gè)指標(biāo)進(jìn)行抗旱或耐旱性篩選，與品種實(shí)際的抗旱能力雖有一定的相關(guān)性，但不完全相關(guān)，甚至有很大的出入，本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果亦說(shuō)明了這一點(diǎn)，如干旱脅迫下低發(fā)芽率株系64，其相對(duì)發(fā)芽率也較低，但綜合抗旱性評(píng)價(jià)較高。利用隸屬函數(shù)法進(jìn)行作物抗旱性的綜合評(píng)價(jià)已有大量報(bào)道[17-19]，且利用隸屬函數(shù)法對(duì)向日葵種子萌發(fā)期抗旱性綜合性評(píng)價(jià)結(jié)果與實(shí)際結(jié)果較為接近。

表5 向日葵種子萌發(fā)期12個(gè)指標(biāo)與隸屬函數(shù)綜合評(píng)價(jià)值的相關(guān)分析

注(Note)：*：P<0.5；**：P<0.1.

圍繞向日葵種子萌發(fā)期抗旱性的研究，人們已經(jīng)從多個(gè)生理或形態(tài)指標(biāo)上進(jìn)行了研究，提出了不同的抗旱性鑒定指標(biāo)[7，20-22]。楊旭東[23]等對(duì)向日葵種子萌發(fā)期的活力指數(shù)、幼苗鮮重、電導(dǎo)率及抗旱指數(shù)等進(jìn)行測(cè)定，并采用灰色關(guān)聯(lián)度的方法進(jìn)行綜合性評(píng)價(jià)。本實(shí)驗(yàn)分析了7個(gè)種子萌發(fā)特性指標(biāo)和5個(gè)種子萌發(fā)生理特性指標(biāo)與綜合指標(biāo)D值的相關(guān)性，其中相對(duì)胚芽干重、發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)及相對(duì)ATP含量與D值呈極顯著正相關(guān)，相對(duì)胚根長(zhǎng)度、胚芽長(zhǎng)度及相對(duì)MDA含量與D值呈顯著正相關(guān)(表5)，這些指標(biāo)均可作為萌發(fā)期抗旱性鑒定指標(biāo)。而相對(duì)胚根干重、相對(duì)SOD、CAT及POD酶活性與向日葵萌發(fā)期抗旱性相關(guān)不顯著(表5)，是否適合作為向日葵萌發(fā)期抗旱性鑒定指標(biāo)，仍需進(jìn)一步研究。本文首次在向日葵種子萌發(fā)期抗旱性鑒定中采用了ATP含量作為抗旱性鑒定的指標(biāo)，進(jìn)一步擴(kuò)充了向日葵萌發(fā)期抗旱性鑒定指標(biāo)體系，為今后的向日葵抗旱育種提供了一定的理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Feng J, Vick B A, Lee M K, et al. Construction of BAC and BLBAC libraries from sunflower and identification of linkage group-specific clone by over go hybridization[J]. Theoretical & Applied Genetics， 2006,113(1)：23-32.

[2] 房冬梅.向日葵SSR分子標(biāo)記遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建[D].呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[3] 裴懷弟，吳科生，王紅梅，等.混合鹽脅迫對(duì)油葵保護(hù)性酶活性、細(xì)胞膜透性及其主要農(nóng)藝性狀的影響[J].干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，2012，30(1)：149-153.

[4] 張秀琴.氣候變化背景下我國(guó)農(nóng)業(yè)水資源管理的適應(yīng)對(duì)策[D].陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2013.

[5] 張燦軍，姚宇卿，王育紅，等.旱稻抗旱性鑒定方法與指標(biāo)研究——Ⅰ鑒定方法與評(píng)價(jià)指標(biāo)[J].干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，2005，23(3):33-36.

[6] 胡樹(shù)平，高聚林，馬 捷，等.油葵不同品種抗旱性能比較[J].干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，2010，28(4)：94-101.

[7] 陳 雪，于海峰，侯建華，等.向日葵芽期、苗期抗旱性鑒定方法研究[J].中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，2009，31(3)：344-348.

[8] 侯建華，于海峰，陳 雪，等.油用向日葵芽期抗旱性SSR分子標(biāo)記研究[C]//中國(guó)作物學(xué)會(huì).2010中國(guó)作物學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集.2010.

[9] 李 龍.普通菜豆種質(zhì)資源抗旱性鑒定與抗旱生理特性研究[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2014.

[10] 李合生.植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M].北京：高等教育出版社，2001.

[11] 張憲政，陳鳳玉，王榮富.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].沈陽(yáng)：遼寧科學(xué)技術(shù)出版社，1994.

[12] 張美俊，楊武德，喬治軍，等.不同糜子品種萌發(fā)期對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)及抗旱性評(píng)價(jià)[J].草地學(xué)報(bào)，2013，21(2)：302-307.

[13] 張明生，謝 波，談 鋒，等.甘薯可溶性蛋白、葉綠素及ATP含量變化與品種抗旱性關(guān)系的研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003，36(1)：13-16.

[14] 張智猛，萬(wàn)書波，戴良香，等.花生抗旱性鑒定指標(biāo)的篩選與評(píng)價(jià)[J].植物生態(tài)學(xué)報(bào)，2011，35(1)：100-109.

[15] 白 玉.谷子萌發(fā)期和苗期抗旱性研究及抗旱鑒定指標(biāo)的篩選[D].北京：首都師范大學(xué)，2009.

[16] 王賀正，馬 均，李旭毅，等.水稻開(kāi)花期抗旱性鑒定指標(biāo)的篩選[J].作物學(xué)報(bào)，2005，31(11)：1485-1489.

[17] 張 娜，趙寶平，張艷麗，等.干旱脅迫下燕麥葉片抗氧化酶活性等生理特性變化及抗旱性比較[J].干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，2013，31(1)：166-171，218.

[18] 冷益豐，張 彪，趙久然，等.轉(zhuǎn)基因玉米種子萌發(fā)期抗旱性鑒定[J].干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，2013，31(1)：177-182.

[19] 翟春梅，王 贊，鄧 波，等.紫花苜蓿苗期抗旱性鑒定指標(biāo)篩選及綜合評(píng)價(jià)[J].干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，2008，26(6)：167-172.

[20] 王婷婷，侯建華，呂 品，等.干旱脅迫對(duì)不同基因型向日葵萌發(fā)的影響研究[J].種子，2015，24(10)：8-11.

[21] 畢經(jīng)偉.向日葵芽苗期抗旱性研究[D].呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[22] 王道杰，桂月靖，楊翠玲，等.油菜抗旱性及鑒定方法與指標(biāo)——Ⅲ.油菜苗期抗旱性及鑒定指標(biāo)篩選[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，21(5)：108-113.

[23] 楊旭東，聶 慧，侯建華，等.PEG模擬干旱脅迫對(duì)向日葵種子萌發(fā)的影響[J].種子，2016，35(5)：71-75.