李 茜，張 琛，張建春1,#(1.蘭州大學藥學院，甘肅 蘭州 730000； .中國人民解放軍第一醫(yī)院藥劑科，甘肅 蘭州 730000)

根據(jù)中醫(yī)理論，乳腺增生癥乃內(nèi)傷七情所致，多由肝氣郁結(jié)引起，由氣及血，以致氣血結(jié)聚，治療以疏肝解郁、軟堅散結(jié)為主。乳消平丸可軟堅散結(jié)、疏肝解郁、清熱解毒和消腫療癰，對乳腺增生有良好的治療效果；該藥臨床使用十余年，總效率達到92%，且未見不良反應(yīng)發(fā)生，安全性高。但由于該藥處方中藥材較多，化學成分復(fù)雜，一般采用單一或少數(shù)幾個指標成分進行質(zhì)量評價，不能全面反映其內(nèi)在質(zhì)量。目前，指紋圖譜已成為國內(nèi)外公認的鑒別中藥品種和評價中藥質(zhì)量的最有效手段[1-5]，能夠較好地顯示中藥制劑的整體情況。本研究參考相關(guān)文獻[6-8]，建立了乳消平丸的高效液相指紋圖譜，并測定其中咖啡酸、阿魏酸、甘草苷和甘草酸4種主要有效成分的含量，以實現(xiàn)對乳消平丸更好的質(zhì)量控制。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1290型高效液相色譜儀，包括Agilent 1290LC色譜工作站、G4 204 A四元泵、手動進樣器、G1316C柱溫箱及G4 212 A紫外檢測器(美國安捷倫科技公司)；BP221S 型電子天平(德國賽多利斯公司)；超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；沃特浦實驗室超純水機(四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司)。

1.2 藥品與試劑

咖啡酸(批號：110885—200102)，阿魏酸(批號：110773—200611)，甘草苷(批號：111610—201106)和甘草酸銨(批號：110731—201317)，均購自中國食品藥品檢定研究所。乳消平丸[解放軍第一醫(yī)院自制制劑，批準文號：蘭制字(2011)F01 019號，批號：20160318—20160328]。甲醇和乙腈為色譜純；其他試劑為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～15 min，10%A；16～30 min，15%A；31～40 min，20%A；41～50 min，25%A；51～60 min，30%A)；流速為1 ml/min；檢測波長為360 nm；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液：精密稱取乳消平粉末5 g置于具塞錐形瓶中，加入甲醇20 ml，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min(功率：250 W，頻率：60 kHz)，放冷，再稱定質(zhì)量，用溶劑補足減失質(zhì)量，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.2 混合對照品儲備溶液：精密稱取對照品適量，加甲醇溶解并制成每1 ml含咖啡酸61 μg、阿魏酸91 μg、甘草苷46 μg和甘草酸銨88 μg的混合對照品儲備溶液。

2.2.3 陰性對照溶液：除去處方中的蒲公英、當歸和甘草后，按制備工藝制備陰性樣品，按“2.2.1”項下方法制備成陰性溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關(guān)系考察：分別精密量取混合對照品儲備液各1、2、4、6及8 ml置于10 ml容量瓶中，加甲醇至刻度，即得對照品混合溶液。分別精密吸取上述溶液各10 μl，按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度(μg/ml)為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，應(yīng)用Excel軟件繪制標準曲線，結(jié)果見表1。

表1 咖啡酸、阿魏酸和甘草苷的線性關(guān)系考察結(jié)果Tab 1 Results of linearity of caffeic acid, ferulic acid and liquiritin

2.3.2 穩(wěn)定性試驗：取乳消平丸(批號：20160318)5 g，精密稱定，按“2.2.1”項下方法制成供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件分別在室溫下(25 ℃)放置0、2、4、8、12及24 h后進樣測定，分別以咖啡酸、阿魏酸、甘草苷和甘草酸銨為參照峰計算指紋圖譜中峰的相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時間RSD為0.03%～0.41%，相對峰面積RSD為0.49%～0.97%，且咖啡酸、阿魏酸、甘草苷和甘草酸銨峰面積的RSD分別為1.32%、1.19%、1.18%和1.11%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3 精密度試驗：取乳消平丸(批號：20160319)5 g，精密稱定，按“2.2.1”項下方法制成供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，分別以咖啡酸、阿魏酸、甘草苷和甘草酸銨為參照峰計算指紋圖譜中峰的相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時間RSD為0.57%，相對峰面積RSD為0.01%～0.03%，且咖啡酸、阿魏酸、甘草苷和甘草酸的RSD分別為1.13%、1.02%、1.72%和1.68%，表明精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗：取乳消平丸(批號：20160318)6份，每份約5 g，精密稱定，按“2.2.1”項下方法制成供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，分別以咖啡酸、阿魏酸、甘草苷和甘草酸銨為參照峰計算指紋圖譜中峰的相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時間RSD為0.01%～0.36%，相對峰面積RSD為0.19%～0.92%，且咖啡酸、阿魏酸、甘草苷和甘草酸峰面積的RSD分別為 1.41%、1.47%、1.49%和1.90%，表明重復(fù)性良好。

2.4 指紋圖譜的建立和相似度分析

取10批乳消平丸(批號：20160318—20160327，標記為S1—S10)，按“2.2.1”項下方法制成供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定。采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A版)”，建立乳消平丸指紋圖譜的共有模式，獲得了30個共有峰。計算指紋圖譜中咖啡酸、阿魏酸、甘草苷和甘草酸銨峰的相對保留時間和峰面積比。以共有模式為參照，計算樣品與共有模式之間的相似度，結(jié)果見表2。10批樣品的色譜疊加圖見圖1。

2.5 乳消平丸中4種成分的測定

2.5.1 加樣回收率試驗：取已知含量的同一批乳消平丸樣品(批號：20160318)約2.5 g，共6份，精密稱定，分別精密加入阿魏酸、咖啡酸、甘草苷和甘草酸銨對照品適量，按“2.2.1”項下方法制成供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算加樣回收率，見表3。

表2 10批樣品指紋圖譜的相似度分析結(jié)果Tab 2 Results of similarity analysis on 10 batches of samples in fingerprint chromatography

圖1 10批乳消平丸高效液相色譜疊加圖Fig 1 Stacking chart of HPLC of 10 batches of Ruxiaoping pills

2.5.2 含量測定：取乳消平丸3批(批號：20160318—20160320,標記為S1—S3)，按照“2.2”項下制備供試品溶液、對照品溶液和陰性對照溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定乳消平丸中咖啡酸、阿魏酸、甘草苷和甘草酸銨的含量，見表4，色譜圖見圖2。結(jié)果表明，咖啡酸的出峰時間為10.95 min，阿魏酸為19.37 min，甘草苷為22.46 min，甘草酸銨為24.55 min。供試品溶液中都有顯著峰與對照品相對應(yīng)，且陰性中無此吸收峰，表明對實驗結(jié)果無干擾。

3 討論

乳消平丸主要由瓜蔞、蒲公英、昆布、荔核、海藻、當歸、浙貝母、元胡、穿山甲、天仙子及甘草組成。本方中的瓜蔞、蒲公英、昆布、海藻、浙貝母及荔枝核等清熱解毒、軟堅散結(jié)的藥材為君藥；當歸、元胡及穿山甲可補血活血、通經(jīng)下乳，為臣藥；天仙子平喘、安神，為佐藥；甘草調(diào)和諸藥，為使藥。本研究選取蒲公英、當歸和甘草的主要成分苦咖啡酸、甘草苷、甘草酸和阿魏酸作為含量測定的指標成分[9-13]，研究方法可操作性強，能控制乳消平丸的質(zhì)量。中醫(yī)藥在預(yù)防和治療乳腺增生癥方面，有著獨特的優(yōu)勢與潛力，在內(nèi)科辨證論治的基礎(chǔ)上結(jié)合外治療法不失為治療該病的良法。相信隨著研究的不斷深入，中醫(yī)學對乳腺增生癥的認識及防治將會不斷地豐富和發(fā)展，為中醫(yī)學的發(fā)展及婦女健康保健做出更大的貢獻。

表3 加樣回收率試驗結(jié)果Tab 3 Results of sample recovery tests

表4 3批樣品中咖啡酸、阿魏酸和甘草苷的含量測定結(jié)果Tab 4 Results of content determination of caffeic acid, ferulic acid and liquiritin in 3 batches of samples

1.咖啡酸；2.阿魏酸；3.甘草苷；4.甘草酸；A. 對照品混合溶液；B.供試品溶液；C.陰性對照溶液1.caffeic acid；2.ferulic acid；3.licorice glycosides；4.glycyrrhizic acid；A. contrast the mixture solution；B.test solution；C.negative control solution圖2 乳消平丸的高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatograms of Ruxiaoping Pills

參考文獻

[1]楊燕梅，黃得棟，盧有媛，等.黃管秦艽UPLC指紋圖譜研究[J].中藥材，2016，39(8)：1734-1737.

[2]蘇建，劉永利.清火梔麥膠囊HPLC特征圖譜的建立和3種成分的測定[J].中成藥，2016，38(4)：810-815.

[3]鄭華，蔡雨，蘇志恒，等.濕毒清膠囊高效液相色譜指紋圖譜[J].中國實驗方劑學雜志，2016，22(2)：59-62.

[4]石偉，李家春，楊素德.六味地黃軟膠囊HPLC指紋圖譜研究[J].中國中藥雜志，2014，39(23)：4625-4628.

[5]黃旭東，劉偉，徐新元，等.寧心寶膠囊指紋圖譜研究及4種核苷類成分的含量測定[J].中國藥師，2016，19(3)：488-491.

[6]張德珂，馬傳江.HPLC法同時測定不同產(chǎn)地生白術(shù)中阿魏酸和咖啡酸的含量[J].中國藥師，2016，19(3)：594-595.

[7]范開苒，姜英，程嵐，等.HPLC法同時測定參歸中風康復(fù)顆粒中芍藥苷、阿魏酸含量[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報，2016，18(1)：67-68.

[8]李喆，潘書洋，李超生，等.甘草HPLC指紋圖譜研究[J].中國藥師，2013，16(8)：1105-1108.

[9]謝京晶，于玥，王一濤，等.HPLC法同時測定當歸藥材中6種成分的含量[J].藥物分析雜志，2007，27(9)：1314-1317.

[10] 秦偉瀚，郭延壘，花雷，等.HPLC法測定滇芹中3種苯丙酸類成分的含量[J].云南農(nóng)業(yè)大學學報：自然科學，2017，32(6)：207-210.

[11] 胡偉慧，韓東岐，江坤，等.RP-HPLC法同時測定甘西鼠尾草中12種成分的含量[J].藥物分析雜志，2016，36(3)：486-493.

[12] 任瑩，范姣姣，張鑫.HPLC法測定復(fù)方雙花片中綠原酸、咖啡酸、連翹苷、穿心蓮內(nèi)酯和木犀草素[J].現(xiàn)代藥物與臨床，2017，32(7)：1192-1195.

[13] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.