樊爽爽，張雪梅，劉曉賀，劉姣揚(yáng)，明勝利，褚貝貝，楊國(guó)宇，王 江

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生化與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002)

在骨骼肌的生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中，肌肉生長(zhǎng)抑制素 (Myostatin,MSTN) 是一種重要的細(xì)胞因子，參與肌肉生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)控[1]。肌肉細(xì)胞分化復(fù)雜過(guò)程的順利進(jìn)行是由一組特異的成肌調(diào)控因子、生長(zhǎng)因子、激酶等精確調(diào)控來(lái)完成的，這一過(guò)程中生肌調(diào)節(jié)因子(MyoD)、肌細(xì)胞生成素(MyoG)、細(xì)胞周期抑制物(P21)、肌球重鏈蛋白(MHC)等基因發(fā)揮著重要作用[2-6]。MyoD蛋白和生肌決定因子(Myf5)是生肌調(diào)節(jié)因子家族(MyoGenic regulatory factors,MRFs)的成員。自Wyzykowski等[7]首次克隆人MyoD基因， 其在促使平滑肌細(xì)胞、原代培養(yǎng)的成軟骨細(xì)胞等骨骼肌細(xì)胞分化中的作用陸續(xù)被證實(shí)[8]。MyoG蛋白為肌細(xì)胞生成素，是轉(zhuǎn)錄因子MyoD家族的成員之一，在MyoD、Myf5下游表達(dá)，進(jìn)而終止細(xì)胞增殖，是骨骼肌發(fā)育的正調(diào)控因子，具有調(diào)節(jié)成肌細(xì)胞融合形成多核肌管的分化標(biāo)志特征[9-11]。P21作為衰老細(xì)胞衍生的抑制蛋白質(zhì)參與調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞衰老過(guò)程。在成肌細(xì)胞分化過(guò)程中，細(xì)胞周期抑制物P21基因的特征變化是表達(dá)顯著增強(qiáng)，提示細(xì)胞不可逆地退出細(xì)胞周期[12]。有研究表明，體外培養(yǎng)細(xì)胞中，MyoD能夠增加MHC報(bào)道基因的表達(dá)[3-6]。Gasp1(Growth and differentiation factor-associated serum protein-1) 蛋白和Gasp2蛋白是卵泡抑素亞家族成員，具有2個(gè)相似的蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域[13]。通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因分析，Gasp1蛋白被證實(shí)具有抑制成熟的肌肉生長(zhǎng)抑制素生物活性[14]。Gasp1和Gasp2蛋白可以強(qiáng)有力結(jié)合生長(zhǎng)因子TGF1 (Transforming growth factor-1)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(Bone morphogenetic protein-2,Bmp2)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4(Bone morphogenetic protein-4,Bmp4)，但是卻并不抑制它們的信號(hào)通路活性[15]，同時(shí)還可以阻斷MSTN蛋白等配體的活性，進(jìn)而促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)發(fā)育[16-17]。Gasp1和Gasp2基因雖然在編碼蛋白質(zhì)上高度同源，但在人機(jī)體各個(gè)組織中表達(dá)存在差異，進(jìn)而提示兩者可能具有不同的生物學(xué)功能。此外，許多基于小鼠模型的研究指出，Gasp1基因可以直接但不獨(dú)立地結(jié)合成熟的肌肉生長(zhǎng)抑制素、肌肉生長(zhǎng)抑制素前肽，從而抑制肌肉生長(zhǎng)抑制素活性，促進(jìn)細(xì)胞分化[18-19]。目前，關(guān)于Gasp1和Gasp2在骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控中參與的分子機(jī)制研究較少，在豬的骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育及調(diào)控中的作用尚不清楚。為此，研究Gasp基因?qū)2C12細(xì)胞分化的影響，為進(jìn)一步選育優(yōu)良轉(zhuǎn)基因豬肉新品系提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 Q5 PCR高保真擴(kuò)增酶、限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB公司；DNA切膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；質(zhì)粒中提試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司；Trizol、轉(zhuǎn)染試劑Turbofect購(gòu)自Thermo公司；高糖DMEM培養(yǎng)基、孕馬血清購(gòu)自Hyclone公司；胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自Gibco公司；T4 DNA連接酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker、SYBGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒、rTaq酶、E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自TaKaRa公司；嘌呤霉素(Puromycin)購(gòu)自Sigma公司； phiC31質(zhì)粒購(gòu)自SBI公司；EB替代物購(gòu)自上海萊楓生物科技有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)材料 小鼠成肌細(xì)胞(C2C12)、杜長(zhǎng)大三元豬組織為本實(shí)驗(yàn)室保存。采用常規(guī)方法取豬的心臟、肝臟、腎臟、脾臟、十二指腸、直腸、回腸、肌肉等8種組織，在液氮中速凍，保存于-80 ℃冰箱。

1.2 方法

1.2.1 豬組織總RNA的提取及cDNA的合成 用Trizol試劑提取1.1.2中組織的RNA，用微量分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的純度和濃度。 以提取的總 RNA 為模板，取1 μg總RNA，使用TakaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，-20 ℃保存。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 從NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到豬Gasp1和Gasp2基因(GenBank No.：XM_021064627、XM_021083248)的cDNA序列及其相關(guān)信息。根據(jù)豬Gasp1和Gasp2基因的序列采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，克隆引物序列見表1，實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列見表2。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.3Gasp1和Gasp2基因的克隆 以豬肌肉組織cDNA作為模板，用Q5 PCR高保真擴(kuò)增酶進(jìn)行目的基因Gasp1和Gasp2的擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，然后用DNA膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收，回收的PCR產(chǎn)物用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)吸光值，初步確定擴(kuò)增的Gasp1和Gasp2基因的質(zhì)量，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 基因克隆引物

注：F中下劃線部分為BamHⅠ酶切位點(diǎn)，R中下劃線部分為NheⅠ酶切位點(diǎn)。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

1.2.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、NheⅠ分別對(duì)PCR擴(kuò)增的Gasp1和Gasp2基因以及phiC31載體進(jìn)行雙酶切，經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收相應(yīng)大小的目的片段。按T4連接酶說(shuō)明書進(jìn)行目的片段和phiC31載體的連接，連接體系為：純化的Gasp1和Gasp2基因片段6 μL，雙酶切phiC31載體片段1 μL，T4連接酶1 μL，T4連接酶Buffer 2 μL，體系配制完成后，充分混勻各組分，16 ℃反應(yīng)過(guò)夜。第2天將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)100 μg/mL 嘌呤霉素篩選、菌液PCR檢測(cè)和測(cè)序來(lái)鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒。將測(cè)序正確的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，按照QIAGEN試劑盒說(shuō)明書提質(zhì)粒。

1.2.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞 轉(zhuǎn)染前8 h將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C2C12細(xì)胞以 2×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)75%融合度時(shí)，按phiC31、phiC31-Gasp1和phiC31-Gasp2重組質(zhì)粒各2 μg、轉(zhuǎn)染試劑Turbofect 4 μL、DMEM培養(yǎng)基200 μL反應(yīng)體系加入試驗(yàn)組孔中，設(shè)置空白對(duì)照組C2C12、試驗(yàn)組C2C12-phiC31-Gasp1和phiC31-Gasp2及陰性對(duì)照組C2C12-phiC31。6 h左右換液，48 h后加入含有最佳篩選質(zhì)量濃度為4 μg/mL嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，以殺死沒有轉(zhuǎn)染進(jìn)含嘌呤霉素篩選標(biāo)記質(zhì)粒的細(xì)胞。培養(yǎng)2周后，用熒光顯微鏡觀察熒光蛋白表達(dá)。

1.2.6 細(xì)胞增殖速度測(cè)定 當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合度時(shí)，將試驗(yàn)組C2C12- phiC31-Gasp1和phiC31-Gasp2、陰性對(duì)照組C2C12-phiC31細(xì)胞，接種到96孔板中。每種細(xì)胞設(shè)3個(gè)重復(fù)，共5 d，以培養(yǎng)基為空白對(duì)照。然后將培養(yǎng)板放在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞增殖速率按CCK-8試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。記錄檢測(cè)的吸光度值，取平均值，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、吸光度A值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

1.2.7 C2C12細(xì)胞的誘導(dǎo)分化 培養(yǎng)C2C12細(xì)胞時(shí)，待細(xì)胞融合度達(dá)70%時(shí)，將生長(zhǎng)培養(yǎng)基換為含有2%馬血清的分化培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)分化。每個(gè)試驗(yàn)組分1、2、3、4、5、6 d共6個(gè)時(shí)期，分別在細(xì)胞分化1、2、3、4、5 d時(shí)收集細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)MyoD、MyoG、P21及MHC肌細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)變化。

1.2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)肌細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá) 將上述誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞系C2C12-phiC31、C2C12-phiC31-Gasp1和phiC31-Gasp2接種到6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)90%融合度時(shí)，按試劑盒說(shuō)明使用Trizol一步法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。將各試驗(yàn)組細(xì)胞cDNA樣品作為反應(yīng)模板進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)體系為：cDNA 1.25 μL,SYBR MIX 5 μL,上下游引物各0.1 μL,ddH2O 3.55 μL。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)參數(shù):95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)Ct值計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，根據(jù)溶解曲線判斷產(chǎn)物特異性。以GAPDH為內(nèi)參，以設(shè)置的對(duì)照組mRNA表達(dá)量作為對(duì)照組,對(duì)目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 熒光定量結(jié)果應(yīng)用MXPro-MX3000P 軟件(Stratagene，美國(guó))進(jìn)行分析處理。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及熒光曲線的Ct值，采用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，并利用GraphPad Prism 5.0軟件和t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Gasp1和Gasp2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

采用Trizol法從豬肌肉組織中提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以肌肉cDNA為模板擴(kuò)增豬Gasp1和Gasp2基因編碼區(qū)，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在1 755 bp和1 659 bp處有特異性條帶出現(xiàn)，目的片段大小與預(yù)期結(jié)果相符 (圖1)。

M：DL2000 DNA Marker；1：Gasp1基因；2：Gasp2基因

2.2 重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果

使用BamHⅠ、NheⅠ限制性內(nèi)切酶分別對(duì)phiC31載體和2.1中PCR回收產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收相應(yīng)目的片段。T4連接酶16 ℃過(guò)夜連接后轉(zhuǎn)化，挑選陽(yáng)性單菌落送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。測(cè)序正確后，擴(kuò)大培養(yǎng)提取質(zhì)粒，用BamHⅠ、NheⅠ限制性內(nèi)切酶對(duì)中提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，獲得phiC31和目的基因相對(duì)應(yīng)的大小片段(圖2)。

M：DL5000 DNA Marker；1：重組質(zhì)粒phiC31-Gasp1；2：重組質(zhì)粒phiC31-Gasp2

2.3 Gasp1和Gasp2基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

待細(xì)胞融合度達(dá)到75%時(shí)，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至C2C12細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，用含4 μg/mL嘌呤霉素培養(yǎng)基篩選，篩選2周后，未轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的C2C12細(xì)胞死亡，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞大量增殖，在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)綠色熒光充滿視野。結(jié)果表明，成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)C2C12-phiC31、C2C12-phiC31-Gasp1和C2C12-phiC31-Gasp2的細(xì)胞系(圖3)。

A:空白對(duì)照；B:C2C12-phiC31；C:C2C12-phiC31-Gasp1；D:C2C12-phiC31-Gasp2

2.4 Gasp1和Gasp2基因過(guò)表達(dá)對(duì)C2C12細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

在生長(zhǎng)至第2、3天時(shí)，細(xì)胞C2C12-phiC31-Gasp1 和C2C12-phiC31-Gasp2增殖能力強(qiáng)于陰性對(duì)照組C2C12-phiC31細(xì)胞。而到第5天后，細(xì)胞C2C12-phiC31-Gasp1和C2C12-phiC31-Gasp2增殖能力低于陰性對(duì)照組C2C12-phiC31細(xì)胞(圖4)。

圖4 過(guò)表達(dá)Gasp1和Gasp2基因?qū)2C12細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

2.5 Gasp1和Gasp2基因過(guò)表達(dá)對(duì)C2C12細(xì)胞分化的影響

在誘導(dǎo)分化2 d后直到分化末期，穩(wěn)定表達(dá)Gasp1和Gasp2的C2C12細(xì)胞的MyoG、MHC、P21基因表達(dá)量相對(duì)于同期對(duì)照組顯著增強(qiáng)。在分化初期MyoD表達(dá)無(wú)差異，分化末期穩(wěn)定表達(dá)Gasp1和Gasp2的C2C12細(xì)胞MyoD表達(dá)量顯著增強(qiáng)。同時(shí)用生物統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定表達(dá)Gasp1和Gasp2對(duì)C2C12細(xì)胞分化的促進(jìn)效果顯著 (圖5、6)。

*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)，下同

圖6 穩(wěn)定表達(dá)Gasp2對(duì)C2C12細(xì)胞分化的影響

3 結(jié)論與討論

肌肉質(zhì)量和功能的改善對(duì)于選育優(yōu)良轉(zhuǎn)基因豬肉新品系具有重大的意義[20-21]。卵泡抑素(Follistatin，F(xiàn)ST)作為一種有效的肌肉生長(zhǎng)抑制素拮抗劑，在小鼠中的過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)[16，22]。生長(zhǎng)和分化因子相關(guān)的分泌蛋白Gasp1，含有與蛋白酶抑制性蛋白相關(guān)的多個(gè)結(jié)構(gòu)域，也含有高度保守的半胱氨酸富集序列，稱為卵泡抑素結(jié)構(gòu)域。有研究顯示，F(xiàn)ST相關(guān)基因編碼的蛋白質(zhì)與卵泡抑素高度相似，在體外均可以抑制激活素和多種骨形態(tài)發(fā)生蛋白[13]。Hill等[14]研究顯示，Gasp1能夠直接且獨(dú)立地與成熟的肌肉生長(zhǎng)抑制素和肌生長(zhǎng)抑制素前肽結(jié)合，并在體外抑制肌生成抑制素活性。Gasp1和Gasp2蛋白具有54%的同源性，并且在包括骨骼肌在內(nèi)的相似組織中表達(dá)(少數(shù)例外)[23]。與其同源蛋白Gasp2一樣，Gasp1對(duì)調(diào)節(jié)軸骨架中前/后模式的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化因子(Growth differentination factor 11,GDF11)也有很高的親和力。與Gasp1不同，Gasp2從未被發(fā)現(xiàn)與血清肌肉生長(zhǎng)抑制素相關(guān)，盡管它們的相互作用是眾所周知的[24]。本試驗(yàn)利用真核表達(dá)載體phiC31551A過(guò)表達(dá)，不需要外界化學(xué)能源和蛋白質(zhì)輔助因子、適合大片段基因有效整合，可在多種真核細(xì)胞環(huán)境中發(fā)揮自主作用，并使轉(zhuǎn)基因持續(xù)高效表達(dá)，外源基因進(jìn)入細(xì)胞后能夠與細(xì)胞基因組整合進(jìn)而產(chǎn)生永久性表達(dá)[25-26]，從而獲得穩(wěn)定表達(dá)Gasp1和Gasp2基因的細(xì)胞株。成肌細(xì)胞的增殖和分化是一個(gè)相互拮抗的過(guò)程[27]，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。采用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示，豬Gasp1和Gasp2基因在促進(jìn)C2C12細(xì)胞分化的后期,細(xì)胞C2C12-phiC31-Gasp1和C2C12-phiC31-Gasp2增殖能力低于陰性對(duì)照組C2C12-phiC31細(xì)胞。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)MyoD、MyoG、P21及MHC分化相關(guān)基因的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)Gasp1、Gasp2基因可以促進(jìn)肌肉細(xì)胞分化，為進(jìn)一步闡明豬Gasp1、Gasp2基因在肌肉分化中的分子機(jī)制提供理論依據(jù)，同時(shí)為選育優(yōu)良轉(zhuǎn)基因豬肉新品系奠定了理論基礎(chǔ)。

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