甘麗萍，向小飛，陳夢吟，王莉莉，王思敏

(重慶三峽學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，重慶 萬州 404100)

三峽庫區(qū)屬典型亞熱帶季風(fēng)濕潤氣候，是我國乃至世界紅橘的最適宜生態(tài)區(qū)之一[1]。紅橘成熟期過于集中，果實在貯藏期間會發(fā)生青霉病、綠霉病、酸腐病、軟腐病、蒂腐病等多種侵染性病害[2]，病原菌大多為弱寄生真菌，造成較高的爛果率，大大影響了產(chǎn)品性狀和經(jīng)濟(jì)價值。過去采用百菌清、菌毒清、富馬酸二甲酯(DMF)[3]、2，4-D[4]等防治貯藏期間病害。但隨著病原菌抗藥性、農(nóng)藥殘留和有害重金屬超標(biāo)等問題的產(chǎn)生以及人們對綠色食品的青睞，研究者們開始把目光轉(zhuǎn)向高效、廣譜、低毒及不易產(chǎn)生耐藥性的納米材料[5]。

納米材料是指在三維空間中至少有一維處于納米尺度范圍 (1～100 nm) 或由其作為基本單元構(gòu)成的材料。大量研究證實，納米材料具有很好的殺菌抗菌效果[6-7]。納米抗菌劑釋放正電荷，牢牢吸附并穿透細(xì)菌、霉菌的細(xì)胞壁，破壞微生物電子傳輸系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、物質(zhì)傳輸系統(tǒng)從而迅速殺死菌體；進(jìn)入細(xì)胞體后，還能與細(xì)菌的羥基反應(yīng)，使細(xì)菌的蛋白質(zhì)凝固，破壞細(xì)菌細(xì)胞合成酶的活性，使細(xì)胞喪失分裂繁殖能力而死亡[8-10]。納米銀作為金屬銀的一種特殊形態(tài)，相比銀來說，具有更強(qiáng)的抗菌特性，對人體更具有安全性，已被提議應(yīng)用于手術(shù)和醫(yī)療器械的消毒[11]。關(guān)于納米銀顆粒的制備方法，文獻(xiàn)報道的有化學(xué)還原法、電化學(xué)法、電子束蒸發(fā)沉積法等，這些方法各有優(yōu)缺點。其中化學(xué)還原法具有設(shè)備簡單，操作方便，反應(yīng)條件溫和，制得的納米銀產(chǎn)量大、純度高、顆粒的大小和形狀可控、粒徑分布相對集中等諸多優(yōu)點[12-13]。 同一種納米材料往往對不同菌種抑制作用不同，如納米氧化鋅對擴(kuò)展青霉的抑菌效果優(yōu)于灰霉菌[14]，納米氧化銅對辣椒疫霉病菌的抑制率顯著高于番茄早疫病菌及西瓜枯萎病菌[15]。不同納米材料的抗菌作用也不同，可能與納米材料的粒徑、形狀、處理方式、微生物本身的結(jié)構(gòu)性狀以及劑量和作用時間等有關(guān)[16-18]。本研究采用化學(xué)還原法制備了納米銀顆粒，將其與其他的納米材料和化學(xué)農(nóng)藥做對比，對幾種菌種進(jìn)行體外抑菌試驗，并調(diào)查其對紅橘貯藏期間青霉病的防治效果，以確定納米銀的防效和有效劑量，從而為納米銀材料在柑橘貯藏期間病害預(yù)防中的應(yīng)用提供試驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

試驗中采用的金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)、指狀青霉菌(Penicilliumdigitatum)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)由重慶三峽學(xué)院微生物實驗室提供，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，活化待用。供試藥劑：聚乙烯吡咯烷酮[PVP，(C6H9NO)x,相對分子質(zhì)量10 000]、三水合氯金酸(HAuCl4·3H2O,99%)、硼氫化鈉(NaBH4,99%)、乙腈(CH3CN，99%)、抗壞血酸(C6H8O6,99%)、硝酸銀(AgNO3,99%)均購買自Sigma-Aldrich公司；農(nóng)用鏈霉素(72%可濕性粉劑)、百菌清(75%可濕性粉劑)由山東省濰坊市農(nóng)藥實驗廠生產(chǎn)；納米二氧化硅[(20±5)nm]、納米氧化鋅[(20±5) nm]、納米二氧化鈦[(20±5)nm]均產(chǎn)自山西長治天乙納米材料有限公司。

以紅橘成熟果實為研究對象。紅橘(CitrusreticulataBlanco cv.Tangerine)為蕓香科(Rutaceae)柑橘屬(CitrusLinn.)寬皮橘的栽培品種。貯藏用果于2016年11月4日采摘于重慶市萬州區(qū)龍沙鎮(zhèn)紅橘園，所有橘果采摘、運輸、貯藏條件一致。

儀器：樣品的透射電子顯微圖像使用日立HT-7700電子顯微鏡拍攝，操作電壓120 kV。高分辨透射電子顯微圖像使用飛利浦Tecnai F20 FEG-TEM拍攝，操作電壓200 kV。

1.2 納米銀的制備

1.2.1 種子準(zhǔn)備 將5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的聚乙烯吡咯烷酮和10 μL 0.25 mol/L的氯金酸溶于5 mL 水中。之后，在劇烈攪拌下向其中注入0.6 mL 0.1 mol/L的硼氫化鈉，產(chǎn)生黃色的Au納米顆粒溶液。Au納米顆粒需要老化6 h，使硼氫化鈉完全分解，然后在納米銀的制備過程中作為種子。

1.2.2 納米銀的制備 在25 ℃恒溫下，將2 mL 5%的聚乙烯吡咯烷酮、2 mL 的乙腈和100 μL 0.1 mol/L抗壞血酸加入2 mL的蒸餾水中。然后，加入150 μL 0.1 mol/L的硝酸銀，之后快速注入60 μL 種子溶液。反應(yīng)在25 ℃下保持15 min。最后通過離心并用蒸餾水重復(fù)洗滌收集納米銀。通過電子顯微鏡觀察納米銀的微觀形貌，進(jìn)行粒徑統(tǒng)計，方法為：在0～100 nm內(nèi)，每隔5 nm為一個區(qū)間，數(shù)出粒徑分布在對應(yīng)區(qū)間的顆粒數(shù)目，再將每個區(qū)間的顆粒數(shù)目換算成數(shù)目百分比。

1.3 納米銀的抑菌試驗

1.3.1 金黃色葡萄球菌 采用瓊脂培養(yǎng)法。配制牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，將超聲波振蕩后形成的納米材料懸濁液和百菌清分別加入培養(yǎng)基，混勻后倒入已滅菌的培養(yǎng)皿中，制成平板。分別設(shè)置0.4、0.2、0.1 mg/mL的質(zhì)量濃度處理，對照組(CK)則加1 mL的蒸餾水。接種經(jīng)活化的相同大小的金黃色葡萄球菌菌落于瓊脂平板上，每個平板均勻放置4個菌落，25 ℃下培養(yǎng)5 d后觀察結(jié)果，測量培養(yǎng)皿中4個菌落的直徑，統(tǒng)計平均值，計算抑制率。抑制率=(對照組菌落直徑-試驗組菌落直徑)/對照組菌落直徑×100%。

1.3.2 枯草芽孢桿菌 采用抑菌圈法。將枯草芽孢桿菌制成菌液懸浮液。移取50 μL菌液于無菌的牛肉膏蛋白胨瓊脂平板上，用玻璃刮涂布使菌液均勻擴(kuò)散。將直徑為2 cm的滅菌濾紙圓片置于培養(yǎng)皿正中與其緊密相貼，然后用移液槍移取 20 μL質(zhì)量濃度分別為0.4、0.2、0.1、0.05、0.025 mg/mL的納米銀懸浮液滴于其上，以蒸餾水為對照(CK)。25 ℃下倒置培養(yǎng)5 d后觀察結(jié)果，測量抑菌圈直徑，計算抑菌圈寬度和抑制率，公式如下：抑菌圈寬度=(抑菌圈直徑-濾紙圓片直徑)/2，抑制率=100%-(最大抑菌圈寬度-試驗組抑菌圈寬度)/最大抑菌圈寬度×100%。最大抑菌圈寬度為(10-2)/2=4,其中10為培養(yǎng)皿直徑，2為濾紙圓片直徑。

1.3.3 指狀青霉菌 采用瓊脂培養(yǎng)法。配制馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，將超聲波振蕩后形成的納米材料懸濁液加入培養(yǎng)基，混勻后倒入已滅菌的培養(yǎng)皿中，制成平板。設(shè)置處理為納米銀0.8、0.4、0.1 mg/mL，以及鏈霉素800倍液和百菌清1 000倍液，對照組(CK)則加1 mL的蒸餾水。待平板凝固后接種3 mm經(jīng)活化的指狀青霉菌菌落于瓊脂平板上。每皿4塊，25 ℃下培養(yǎng)，2 d和5 d 后測量菌落大小，統(tǒng)計平均值，計算抑制率。

1.4 納米銀對紅橘果實貯藏期青霉病的藥效試驗

1.4.1 供試菌種與藥液 將指狀青霉菌用無菌水

配成孢子懸浮液，以低倍光學(xué)顯微鏡下(16×10)一個視野150～200個孢子為標(biāo)準(zhǔn)。納米銀設(shè)置3個質(zhì)量濃度，分別為0.1 mg/mL、0.4 mg/mL和0.8 mg/mL，另設(shè)2個農(nóng)藥處理，分別為鏈霉素800倍液和百菌清1 000倍液，以無菌水為對照。

1.4.2 試驗方法 選取大小、色澤、生境一致的橘果，用清水洗凈果實表面后再用0.5%的次氯酸鈉消毒。待果實風(fēng)干，將消毒的針在青霉菌孢子懸浮液中浸泡3 s，之后在果實上人工接種，每果接種10針，接種深度基本一致，以刺破表皮為宜。接種24 h后，在配好的藥劑中浸果2～3 min，期間用玻璃棒攪拌，以克服藥劑沉淀。每處理50～60個橘果，平行3次。風(fēng)干套袋，在常溫下分別于處理后15、30、50 d調(diào)查青霉病發(fā)生情況，取病情指數(shù)平均值計算相對防效。

病果分級按以下標(biāo)準(zhǔn)[19]:0級，無??；1級，病害面積占整個橘果1/4以下；2級，病害面積占整個橘果1/4～1/2；3級，病害面積占整個橘果1/2～3/4；4級，病害面積占整個橘果3/4 以上。病情指數(shù)=100×∑(各級病果數(shù)×各級代表值)/(調(diào)查總果數(shù)×最高級代表值)；相對防效=(對照組病情指數(shù)-處理組病情指數(shù))/對照組病情指數(shù)×100%。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel和SPSS 20.0版統(tǒng)計分析軟件處理數(shù)據(jù)，并做方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米銀的制備結(jié)果

從電子顯微圖像可以看出，制備的納米銀顆粒具有非常好的分散性，沒有團(tuán)聚現(xiàn)象，粒徑較小且尺寸分布非常均一(圖1)。通過粒徑統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，平均粒徑大約為20 nm，主要集中在15～25 nm(圖2)。

A、B：透射電子顯微圖像；C：高分辨透射電子顯微圖像圖1 納米銀顆粒電子顯微圖像

圖2 納米銀顆粒的粒徑分布

2.2 納米銀的抑菌試驗結(jié)果

2.2.1 金黃色葡萄球菌 從菌落生長來看，各種藥劑對金黃色葡萄球菌都有一定的抑制作用，百菌清和納米銀的抑菌效果最為明顯(圖3)。經(jīng)過測量計算，對照組菌落直徑為3.58 cm，藥劑組菌落直徑都顯著降低。添加納米銀的處理組，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL時，菌落直徑為1.04 cm，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL時，菌落直徑僅為 0.19 cm，抑制率分別達(dá)到了70.95%和94.69%；這2個質(zhì)量濃度下百菌清對金黃色葡萄球菌的抑制率分別為78.21%和92.18%，與納米銀之間沒有顯著差異，納米氧化鋅的抑制率分別為 64.25%和89.39%，也表現(xiàn)出了和納米銀以及百菌清相仿的抑菌效果(表1)。

A：納米銀；B：納米氧化鋅；C:納米二氧化鈦；D:納米二氧化硅；E:百菌清圖3 不同藥劑對金黃色葡萄球菌的抑制試驗結(jié)果

藥劑名稱質(zhì)量濃度/(mg/mL)菌落直徑/cm抑制率/%納米銀0.40.19e94.690.20.36e89.940.11.04d70.95納米氧化鋅0.40.38e89.390.20.85d76.260.11.28d64.25納米二氧化鈦0.41.37d61.730.22.08d41.900.12.52c29.61納米二氧化硅0.41.40d60.890.22.19c38.830.13.30b7.82百菌清0.40.28e92.180.20.37e89.660.10.78d78.21CK3.58a

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

2.2.2 枯草芽孢桿菌 由圖4可見，接種枯草芽孢桿菌后5 d，相比于對照組，納米銀處理從初始質(zhì)量濃度0.025 mg/mL開始就出現(xiàn)了不同大小的抑菌圈，其寬度隨納米銀質(zhì)量濃度的增加呈增大趨勢，當(dāng)納米銀質(zhì)量濃度達(dá)到0.4 mg/mL時，培養(yǎng)皿中只有少數(shù)幾個枯草芽孢桿菌菌落生長。從表2可知，低質(zhì)量濃度的納米銀(0.025 mg/mL)已有一定的抑菌效果，0.05 mg/mL的納米銀抑菌效果增強(qiáng)，當(dāng)納米銀質(zhì)量濃度達(dá)到0.4 mg/mL，抑菌效果最強(qiáng)，抑制率達(dá)到了90.25%，顯著高于其他處理。

1：CK；2—6：納米銀質(zhì)量濃度分別為0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL 圖4 不同質(zhì)量濃度納米銀對枯草芽孢桿菌的抑制試驗結(jié)果

納米銀質(zhì)量濃度/(mg/mL)抑菌圈寬度/cm抑制率/%CK00a0.0250.389.50b0.051.5639.00c0.11.5839.50c0.21.9047.50c0.43.6190.25d

2.2.3 指狀青霉菌 從菌落生長來看，各藥劑處理對青霉菌都有一定的抑制作用(圖5)。接種后5 d，對照除了接種的4個菌落外，還產(chǎn)生了大量的小菌落。從表3可以看出，低質(zhì)量濃度的納米銀(0.1 mg/L)和鏈霉素處理后青霉菌菌落直徑在1 cm左右，抑菌效果較差。高質(zhì)量濃度的納米銀(0.4 mg/mL和0.8 mg/mL)對青霉菌有較明顯的抑制效果，菌落直徑在0.35～0.38 cm，抑制率達(dá)到了71.43%～73.68%，但與百菌清相比存在顯著差異。百菌清在1 000倍液時，青霉菌菌落直徑為 0.11 cm，抑制率達(dá)到了91.73%，接種的菌落沒有擴(kuò)張，甚至有一點縊縮。

A:接種后2 d；B：接種后5 d。1: CK; 2:鏈霉素; 3:納米銀0.1 mg/mL; 4:納米銀0.4 mg/mL; 5:納米銀 0.8 mg/mL; 6:百菌清圖5 不同藥劑對指狀青霉菌的抑制試驗結(jié)果

藥劑名稱使用劑量菌落直徑/cm抑制率/%CK1.33a鏈霉素800倍液1.07b19.55納米銀0.1mg/mL0.97b27.070.4mg/mL0.38c71.430.8mg/mL0.35c73.68百菌清1000倍液0.11d91.73

2.3 納米銀對紅橘果實貯藏期青霉病的藥效試驗結(jié)果

從表4可以看出，1 000倍液的百菌清對紅橘青霉病的防治效果最好，病情指數(shù)為1.97，相對防效達(dá)到59.07%，與其他處理之間都達(dá)到了顯著差異水平；0.4 mg/mL和0.8 mg/mL的納米銀也有較好的防治效果，病情指數(shù)分別為2.87和2.66，相對防效為40.20%和44.64%；低質(zhì)量濃度的納米銀(0.1 mg/mL)和800倍液的鏈霉素處理病情指數(shù)都超過4，與對照沒有顯著差異，相對防效僅為10%左右。

表4 不同藥劑防治紅橘青霉病的藥效試驗結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本試驗用化學(xué)還原法制備了納米銀顆粒，顆粒具有非常好的分散性，沒有團(tuán)聚現(xiàn)象，粒徑較小且尺寸分布非常均一，能夠滿足后續(xù)的試驗要求，之后研究了納米銀對不同菌種和紅橘貯藏期青霉病的抑制效果。納米銀對細(xì)菌特別是革蘭氏陽性菌的抑制作用最強(qiáng)，對酵母菌和霉菌的作用相對較弱[20-21]。本研究選擇的菌種金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均為革蘭氏陽性菌，當(dāng)納米銀質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL，抑制率都在90%以上，而其對指狀青霉菌的抑制率為71.43%,當(dāng)納米銀質(zhì)量濃度增加到0.8 mg/mL，對指狀青霉菌的抑制率為73.68%，說明在相同的質(zhì)量濃度和處理條件下，納米銀對不同菌種的抑制效果有差異，對細(xì)菌的抑制作用更強(qiáng)，而對青霉菌的抑制作用稍弱。納米銀的作用機(jī)制已有學(xué)者研究報道，其可通過促進(jìn)細(xì)菌凋亡而影響細(xì)菌生長[22]。納米氧化鋅通過摩擦灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)使菌絲變形而發(fā)揮抗菌活性，對青霉菌(Penicilliumexpansum)則是通過抑制分生孢子的生長而抑制其生長[14]。不同納米材料的抑菌機(jī)制不同，納米銀抑制真菌的機(jī)制還需要深入探究。

探究不同質(zhì)量濃度的納米銀對紅橘果實貯藏期青霉病的防治效果，結(jié)果表明，高質(zhì)量濃度(超過0.4 mg/mL)的納米銀處理與對照相比能使病情指數(shù)顯著降低，從而有效抑制青霉病。當(dāng)納米銀質(zhì)量濃度達(dá)到0.8 mg/mL時，對紅橘青霉病的相對防效為44.64%，盡管與1 000 倍液百菌清(相對防效 59.07%)之間有一定的差異，但鑒于納米銀對人體安全無毒，其將成為一種很有前途的新型保鮮劑。納米材料在果蔬采后保鮮中已經(jīng)有一些成功的應(yīng)用報道，如制成納米抗菌劑復(fù)合涂膜。在殼聚糖膜中加入納米二氧化鈦，其抑菌效果增強(qiáng)，可延長果蔬的貯藏保鮮時間[23]。將添加有1%納米無機(jī)抗菌劑(主要成分是納米銀、納米鋅和高嶺土)的低密度聚乙烯吹塑制成保鮮袋，可顯著提高柑橘采后貯藏品質(zhì)，減緩柑橘病害的發(fā)生[24]。由此可見，在復(fù)合膜中加入納米抗菌顆粒，可提高抑制致病菌的效果，從而提高果蔬采后貯藏品質(zhì)。關(guān)于納米銀在果蔬采后保鮮中的應(yīng)用效果還有待進(jìn)一步試驗。

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