丁上書 霍涌瑋 張曉田 路 明周勁松 邢俊平 王麗蓉 張秋養(yǎng) 田 宏**

1.西安交通大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科（西安 710061）；2.西安交通大學基礎醫(yī)學院人體解剖與組織胚胎學系；3.西安交通大學基礎醫(yī)學院生殖醫(yī)學研究中心；4.美國杜蘭大學醫(yī)學院結(jié)構(gòu)與細胞生物學系，美國 新奧爾良 70112-2699

精索靜脈曲張（varicocele，VC）被認為是導致男性不育或生育力低下的最常見的且可手術矯正的病因[1]。據(jù)調(diào)查顯示35%～44%的原發(fā)性男性不育和45%～81%的繼發(fā)性男性不育皆可發(fā)現(xiàn)左側(cè)精索靜脈曲張病變[2,3]。在精索靜脈曲張導致男性不育或生育力低下的病理改變中，附睪的結(jié)構(gòu)功能紊亂扮演著重要的角色[4]。附睪黏膜所分泌的蛋白，如cathelicidins抗菌肽、防御素、胱蛋白[5]和精子結(jié)合蛋白11家族（sperm associated antigen SPAG 11）等，皆參與了精子在附睪中成熟的過程[6]，一旦附睪出現(xiàn)病理性變化，勢必造成精液質(zhì)量和精子相關功能的下降，從而影響男性生育力[7]。

奈斯的自我實現(xiàn)原則指出，生態(tài)系統(tǒng)的復雜性和共生能夠增加生物多樣性，而生物多樣性又能夠增加人類自我實現(xiàn)的潛能，[4]3保護野生動物從根本上講是為了保護人類自身的健康生活和生存環(huán)境。

精索靜脈曲張的病理機制研究發(fā)現(xiàn)，精索靜脈曲張可致附睪質(zhì)量下降、附睪管腔直徑變窄、附睪上皮主細胞凋亡增多[8]和α-葡萄糖苷酶活力下降[9]，電鏡下發(fā)現(xiàn)附睪上皮主細胞中溶酶體變大增多、細胞器功能紊亂[10]，由其產(chǎn)生的附睪分泌蛋白在精索靜脈曲張時亦發(fā)生變化[11]，這將導致精子成熟微環(huán)境的改變，可能成為精索靜脈曲張致男性不育的原因。本研究試圖通過建立實驗性左側(cè)精索靜脈曲張（experimental left varicocele, ELV） 大鼠模型，明確精索靜脈曲張是否引起精子結(jié)合抗原11C（SPAG11C ）和精子結(jié)合抗原11T（SPAG11T）的表達發(fā)生變化，為探究精索靜脈曲張導致男性不育的機制提供資料。

材料與方法

一、材料

（一）動物分組及飼養(yǎng)

48只8周齡的健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（購于西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心，經(jīng)學校動物實驗倫理委員會批準），飼養(yǎng)于相對濕度25%、溫度23～25℃的無菌環(huán)境中，使用雙蒸水和動物中心提供的大鼠飼料喂養(yǎng)，隨機平均分籠并標記分為4組。A組：假手術2周組；B組：假手術4周組；C組：ELV造模2周組；D組：ELV造模4周組；每組均為12只大鼠。

三峽職院機制專業(yè)自實行“因材施教、分層培養(yǎng)、工學交替、強化技能”人才培養(yǎng)模式以來，學生就業(yè)率保持在95%以上，學生技能水平和創(chuàng)新能力得到較快提升，先后獲得湖北省大學生機械創(chuàng)新設計大賽一等獎二次、二等獎一次，獲得國家專利三項，參與企業(yè)技術開發(fā)多項。

ELV造模2周時，取模型鼠和假手術鼠雙側(cè)附睪，稱量記錄后分別置于Bouin's液和TRIzol液處理過的EP管中，完成附睪組織固定和低溫冷凍保存。

（一）Real-time PCR

1.引物設計合成：GenBank上查詢大鼠的SPAG11C（AY600145）、SPAG11T（AY600144）和β-肌動蛋白（NM031144）mRNA序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計引物序列，委托AuGCT基因公司合成。SPAG11C的上游引物5′-CCACAGCCATGAAACAGAGA -3′，上游引物5′-GAAGGGATGTAAGCAGCAGG -3′；SPAG11T的上游引物5′-TTTGTCAACCTCCTCCTTGC-3′，上游引物5′- CATGTGGGCTCCATATTTCC-3′；內(nèi)參β-肌動蛋白的上游引物5′-GAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，上游引物5′- CTGGAAGGTGGACAGTGAG -3′。

2.總RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄cDNA：從-80℃中取出TRIzol-EP管，將附睪標本置于研磨器中，按照1mL Trizol:100mg 組織的比例加入TRIzol研磨成組織勻漿后，4℃，12 000×g，離心10min，將上清液移至DEPC（焦碳酸二乙酯，Sigma，美國）處理的EP管中，依次加入400μL氯仿、1mL 異丙醇后，取上清液， 4℃，12 000×g，離心10min后75%乙醇，洗滌2次。使用NanoDrop 2000型（Thermo， 美國）分光光度計測定RNA濃度及260/280nm比值。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo，美國）按步驟獲取cDNA。

（二）動物模型建立方法[12]

二、方法

使用乙醚吸入麻醉，左側(cè)中腹部1.0～1.5cm切口入腹腔，逐層暴露進入腹膜后隙尋找到左腎靜脈，使用4-0無菌手術線聯(lián)合直徑0.5 mm細鐵絲進行結(jié)扎，結(jié)扎完成后，抽出鐵絲，關腹縫合。在ELV術后2周和4周時，將大鼠麻醉后剖腹觀察，以左精索靜脈直徑較術前擴大2倍以上且雙腎質(zhì)量相似為標準成功建立ELV模型鼠。假手術只需分離暴露左腎靜脈，不行結(jié)扎術。

（三） 動物器官取材及處理

大荔縣土地總面積1776.4km2，分為北部黃土臺塬區(qū)、中部洛灌區(qū)、東部黃河灘區(qū)和南部沙苑區(qū)，除沙苑區(qū)外，其他各區(qū)均適宜核桃生長，我們充分利用此類土地大力發(fā)展核桃產(chǎn)業(yè)，促進農(nóng)村產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，帶動群眾增收致富。

新鮮制備Bouin's 固定液，并標記組別+左（右）側(cè)備用。取用40支滅菌滅酶EP管，分別標記組別+左（右）側(cè)，滴加300μL TRIzol液（Invitrogen，美國）備用。

3.PCR擴增：將假手術組的右側(cè)附睪樣本作為擴增對照組，建立25μL反應體系，模板cDNA 2μL（陰性對照不加模版，使用滅菌DEPC水），上下游引物各1μL， 2×SYBR Real-time PCR pre-mixture（百泰克，中國）12.5μL，滅菌DEPC水8.5μL。置于Real-time PCR儀TL988（Tianlong，中國）中，設置反應條件：95℃預變性5min，40個循環(huán)中95℃變性15 s，57℃（SPAG11C）/58℃（SPAG11T）/56℃（β-肌動蛋白）20 s。收集CT值，使用2-△△CT計算基因相對表達量。

突然，幾枝步槍啪啪地響起。不用說，是國軍的一支偵察小分隊，他們與這撥鬼子遭遇上了。槍聲一響，受了驚的大洋馬便嘶鳴著四散開去，不一會兒，有馬撞了地雷，轟轟作響。一匹馬朝陳大勇方向撞來，眼看要踩上了，陳大勇猛地站了起來，照著馬上的鬼子猛扣扳機。

（二）免疫組織化學染色

石蠟包埋各組別附睪組織，5μm切片，脫蠟至水，3% H2O2浸泡15min，1% Triton X-100（北京化學試劑廠，中國）穿透15min，5% 正常山羊血清封閉30min，滴加兔抗小鼠SPAG11C和SPAG11T一抗（1:1200，美國北卡羅萊納大學Susan教授惠贈），4℃孵育過夜。次日恢復室溫40min，滴加生物素化山羊抗兔二抗37℃孵育60min，滴加辣根酶標記的鏈霉卵白素37℃孵育25min，滴加DAB顯色液3～5min，終止反應。使用蘇木精染液復染細胞核1～3min，浸入自來水中返藍15min，脫水透明后，中性樹膠封片。以正常兔血清代替一抗作陰性對照。使用Olympus BX-1型數(shù)碼顯微鏡觀察鏡下并采集圖像。免疫組化圖像結(jié)果使用圖像分析軟件（Image Pro Plus5.1，美國）測量比較。每組至少選取5張不同個體來源的切片，每張切片隨機選擇5個視野區(qū)（×400）獲得陽性細胞的累積面積，并將計算所得的平均積分光密度（Integrated optical density, IOD）作為指標，數(shù)值與免疫強度成正比。

串聯(lián)PHEV通常稱為增程式混合動力汽車。串聯(lián)PHEV結(jié)構(gòu)原理如圖4所示。其結(jié)構(gòu)特點為：純電動＋增程器，汽車車輪僅由電動機獨立驅(qū)動，增程器可以是發(fā)動機—發(fā)電機組，發(fā)動機—發(fā)電機組發(fā)電直接供給電動機驅(qū)動汽車，同時發(fā)出的多余電量給蓄電池包充電，增程器還可以是燃料電池等。

三、統(tǒng)計學分析

結(jié)果輸入SPSS19.0軟件，各組別實驗所得數(shù)據(jù)均以±s表示，使用單因素方差分析，P＜0.05認定為組間存在顯著性差異。

結(jié) 果

一、Real-time PCR

本研究采用目的基因的相對擴增量作為指標，分別比較ELV造模2周組和4周組左側(cè)附睪SPAG11C和SPAG11T mRNA 表達量與同期假手術對照組和右側(cè)附睪的變化以及ELV造模2周和4周組間其mRNA表達的差異。ELV造模2周時，造模鼠左側(cè)附睪的SPAG11C相對擴增量較假手術組顯著性降低（P＜0.05，圖1A），且左側(cè)附睪低于右側(cè)附睪（P＜0.05，圖1A）。ELV造模4周，造模組左側(cè)附睪SPAG11C相對擴增量較假手術組明顯降低（P＜0.05，圖1A），左側(cè)附睪亦低于右側(cè)附睪（P＜0.05，圖1A）。 ELV造模4周組左側(cè)附睪SPAG11C mRNA較ELV造模2周組同側(cè)附睪顯著性減低（P＜0.05，圖1A）。ELV造模組SPAG11T mRNA的變化與SPAG11C相同（圖1B）。

二、免疫組化

SPAG11C和T免疫組化陽性反應呈棕褐色，且兩蛋白在附睪組織中的表達均呈現(xiàn)細胞特異性和區(qū)段特異性。SPAG11C和T均集中表達在附睪上皮的主細胞胞質(zhì)中（圖2A和圖2B），暈細胞、基細胞和亮細胞表達呈陰性。SPAG11C沿附睪體部近端表達逐漸減弱甚至消失（圖2A），而SPAG11T則在附睪頭部遠端、體部近端和尾部表達較強（圖2B），在附睪頭部始段未見兩蛋白的表達。將積分光密度作為免疫強度的指標，ELV造模2周組和4周組左側(cè)附睪SPAG11C和SPAG11T的表達與假手術組和同期右側(cè)組相比，均顯著降低（P＜0.05）；ELV造模4周組左側(cè)附睪兩蛋白的表達均較ELV造模2周組明顯減少（P＜0.05），余未發(fā)現(xiàn)顯著性差異（表1和表2）。

圖1 SPAG11C和SPAG11T的mRNA在ELV造模2周組和4周組大鼠附睪組織中相對擴增量的分析

圖2 ELV造模2周和4周時SPAG11C和SPAG11T在造模組和假手術組大鼠附睪組織中的表達

表1 ELV大鼠附睪組織中SPAG11C免疫組化積分光密度值測定結(jié)果（±s）

表1 ELV大鼠附睪組織中SPAG11C免疫組化積分光密度值測定結(jié)果（±s）

與同期假手術組比較，*：P＜0.05；與同期右側(cè)附睪組比較，#：P＜0.05；與2周造模組同側(cè)附睪組相比較，△：P＜0.05

組別 N SPAG11C ELV造模2周組左側(cè)附睪 6 102.34±1.79*#右側(cè)附睪 6 111.35±1.23假手術組 12 114.78±3.17 ELV造模4周組左側(cè)附睪 6 92.81±1.30*#△右側(cè)附睪 6 108.98±1.27假手術組 12 109.50±2.18

表2 大鼠附睪組織中SPAG11T免疫組化積分光密度值測定結(jié)果（±s）

表2 大鼠附睪組織中SPAG11T免疫組化積分光密度值測定結(jié)果（±s）

與同期假手術組比較，*：P＜0.05；與同期右側(cè)附睪組比較，#：P＜0.05；與2周造模組同側(cè)附睪組相比較，△：P＜0.05

組別 NSPAG11T ELV造模2周組左側(cè)附睪 6 100.39±1.37*#右側(cè)附睪 6 109.92±1.65假手術組 12 110.07±1.67 ELV造模4周組左側(cè)附睪 6 90.46±2.92*#△右側(cè)附睪 6 110.20±2.30假手術組 12 112.43±1.91

討 論

SPAG11基因家族編碼的產(chǎn)物，根據(jù)種屬分類，又命名為Bin-1b（大鼠），附睪蛋白-2（靈長類），human epididymis-2（人類），承擔免疫和生殖的功能[13,14]。由于不同啟動子和選擇性剪接機制至少生成了9個不同的剪切轉(zhuǎn)錄本，hSPAG11A- hSPAG11I在人類和黑猩猩中發(fā)現(xiàn)，恒河猴則出現(xiàn)了13個（m SPAG11B,C，E and m SPAG11J-S）[15-18]。SPAG11的蛋白同分體是由氨基末端的46個氨基酸耦合不同外顯子組合編碼的羧基末端組成。SPAG11C 是由外顯子1,2（不完全）和3組成，SPAG11T則是由外顯子1和2組成[19]。SPAG11是附睪上皮的分泌蛋白，證明與精子成熟密切相關。蛋白結(jié)構(gòu)中有6個似防御素的半胱氨酸的模序，與固有免疫相關，SPAG11C 在附睪、睪丸、大腦、腎臟、前列腺和卵巢都有表達，并在多系統(tǒng)產(chǎn)生抗菌作用。眾多研究表明，人類、恒河猴、牛、大鼠和小鼠的SPAG11蛋白和多肽主要通過穿透細胞膜和抑制大分子合成等機制，起到廣譜的抗菌作用[14,20,21]。SPAG11C蛋白的羧基末端的多肽并沒有抗菌作用，但可促進對完全蛋白的正確折疊。大鼠SPAG11C蛋白的氨基末端起到重要的抗菌作用。在人類，SPAG11蛋白家族同分體包括一個類似弗林蛋白的前蛋白轉(zhuǎn)換酶模序（furin-like proprotein convertase motif RVKR）[22,23]。由于在RVKR裂隙形成的SPAG11多肽在附睪液中和體外精液及精子中存在[22]，且大鼠的SPAG11C 和SPAG11T有完全相同的RVKR結(jié)構(gòu)，由附睪上皮產(chǎn)生，釋放到管腔內(nèi)，所有釋放的SPAG11同分體在RVSK部位斷裂，并確定哪種同分體可以獲得有效的殺菌濃度[19]。SPAG11可以通過干擾細菌基本的代謝途徑，包括細菌的相關DNA、RNA和蛋白的合成起到殺菌作用[14]。在體內(nèi)外的實驗模型中β-防御素和SPAG11基因表達可以由脂多糖刺激產(chǎn)生，同時受到TLR-介導的核因子κB（NF-κB） 活化和組蛋白甲基化、組蛋白乙?；虳NA的甲基化的表觀遺傳規(guī)則的調(diào)節(jié)[24,25]。SPAG11基因變異顯然是與男性生育表現(xiàn)密切相關的[26]。牛的SPAG11 基因變異對繁殖至關重要，已發(fā)現(xiàn)SPAG11C， E 和U的mRNA主要存在于成年雄牛的生殖管道[26]。SPAG11在精子成熟過程中起核心作用，特別是對精子的活動力有重要的提升作用[27]。大鼠SPAG11C在30d左右開始表達，這發(fā)生在33～50d雄激素快速增長之前，表明SPAG11C可能輔助刺激青春前期的啟動。SPAG11T在性成熟期雄性大鼠的附睪頭部密集表達，在60～90d的老年大鼠中，只表達在附睪的尾部，推知其與精子成熟密切相關[13]。而大鼠防御素BIN1B的研究[27]表明具有似防御素結(jié)構(gòu)的SPAG11同分體參與啟動精子成熟，關于DEFB126的研究[28]則可解釋其在精子獲能中的相關作用。總之，作為附睪上皮分泌蛋白之一的SPAG11各蛋白同分體參與精子成熟和生殖道的抗感染作用。

某抽水蓄能電站總裝機4×320 MW，其最高凈水頭502.7 m，輸水系統(tǒng)水平總長度2 449 m，其中中平洞襯砌后直徑為9.2 m，襯砌厚60 cm，靜水頭約300 m。中平洞存在長約40 m的V類圍巖洞段，該洞段發(fā)育有f24、f20和f80三條較大斷層。斷層均為全風化構(gòu)造角礫巖，圍巖見高嶺土化，地下水多呈滲滴～線流狀，最大滲水量約5 L/min～6 L/min。斷層外圍巖裂隙發(fā)育，裂隙走向總體與斷層垂直。該洞段地質(zhì)平面展布圖見圖1。

在附睪中SPAG11C和SPAG11T的轉(zhuǎn)錄是通過去勢和雄激素替代實驗的證明，SPAG11C和SPAG11T的轉(zhuǎn)錄是雄激素依賴的[19]。大鼠SPAG11基因的-779到+17的上游區(qū)域包含著可以與雄激素受體、NF-κB、核因子-1（NF-1）、EST和活化蛋白2結(jié)合的位點[6]。在脂多糖刺激時，雄激素受體和NF-κB位點是最重要的調(diào)節(jié)位點[6]。歐洲泌尿協(xié)會關于男性不育的指南指出，在患有精索靜脈曲張的大齡不育患者出現(xiàn)血清雄激素的顯著降低[29]。精索靜脈高位結(jié)扎術后，可以抑制雄激素的加速降低，或也許暫時提高，對雄激素基線較低的患者，恢復明顯[30]。研究表明，青春期ELV模型大鼠在手術后6～18周出現(xiàn)血清和睪丸內(nèi)的雄激素水平降低[31-33]，在成年大鼠手術模型2周后即出現(xiàn)睪丸內(nèi)雄激素降低，血清水平不變[34]，但手術造成了StAR mRNA的表達水平降低，干擾雄激素的合成，導致睪丸內(nèi)的雄激素水平降低[35]，同時促進睪丸間質(zhì)細胞的凋亡，損傷大鼠睪丸間質(zhì)細胞的內(nèi)分泌功能[35]，導致雄激素的分泌降低。而在手術矯正后，雄激素水平得到有效提高[36]。另外，精索靜脈曲張可以導致雄激素受體的表達降低，雄激素受體的mRNA未見變化，主要與轉(zhuǎn)錄后修飾有關，諸如mRNA的穩(wěn)定性，蛋白翻譯，翻譯后修飾（磷酸化，泛素/蛋白酶體系統(tǒng)），蛋白穩(wěn)定性[37]，精索靜脈曲張可以通過蛋白激酶C的一種錨定蛋白RACK1的表達增加，導致雄激素受體的磷酸化[38-40]。

本研究采用qPCR和免疫組織化學技術，明確SPAG11C和SPAG11T在附睪組織中的表達定位，說明它們在附睪組織中的表達具有細胞特異性和區(qū)段特異性，參與構(gòu)成精子成熟的附睪微環(huán)境。由于實驗性左側(cè)精索靜脈曲張病理模型的成功建立，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上證明患側(cè)附睪組織中SPAG11C和SPAG11T的表達均發(fā)生變化。在ELV術后2周和4周時，左側(cè)附睪中兩蛋白的表達均較假手術組和同期右側(cè)組呈顯著性的降低，且ELV造模4周組較2周組表達下降更顯著。而ELV后右側(cè)及假手術組附睪兩蛋白的表達未發(fā)生明顯變化，保持正常水平。這樣的結(jié)果表明，精索靜脈曲張導致SPAG11C和SPAG11T表達的降低，其可能通過較早地持續(xù)地影響SPAG11蛋白的表達而改變病側(cè)附睪微環(huán)境，繼而導致男性不育或生育力降低。我們前期實驗[41]也已證明精索靜脈曲張時干擾患側(cè)附睪雄激素受體表達下降，所以可以推測精索靜脈曲張可能通過下調(diào)雄激素受體的表達導致SPAG11C和SPAG11T表達降低，從而影響到生殖道的抗感染能力、精子成熟和精子活動力，從而導致生育力降低，而雄激素受體和SPAG11家族蛋白的功能相關路徑需要進一步研究，以證明精索靜脈曲張致男性生育力降低的具體機制。

致謝：本試驗研究中SPAG11C/T多克隆抗體（兔抗鼠）由美國北卡羅萊納大學生物研究所的Susan H.Hall 副教授無私提供，特此表示衷心感謝。

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