羅振國 鄧勇泉 陳向鋒 遲寶進(jìn) 陶 然 王 凱

1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科（黑龍江佳木斯 154003）；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院泌尿外科

外周血miRNA作為腫瘤標(biāo)志物在乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌等研究中已經(jīng)取得一定的成果[1,2]。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)前列腺癌（PCa）患者和前列腺增生（BPH）患者血清miRNA-107的表達(dá)水平，研究其對(duì)前列腺癌診斷與預(yù)后的價(jià)值，并分析其與 PCa臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。

材料和方法

一、臨床資料

收集2015年10月至2017年10月期間在我院泌尿外科經(jīng)病理活檢確診的 PCa 和 BPH 患者術(shù)前血清。其中PCa患者30例，年齡62～91歲，平均年齡為（77.8±7.4）歲；BPH 患者30例，年齡63～88歲，平均年齡（75.3±6.0）歲。所有患者術(shù)前未行任何治療。對(duì)可能影響miRNA表達(dá)的慢性疾病患者不納入本次研究。病理分級(jí)依據(jù) 2003年WHO前列腺癌病理組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)Gleason評(píng)分，腫瘤分期按AJCC的TNM系統(tǒng)。兩組研究對(duì)象年齡的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。采集標(biāo)本前獲得患者知情同意和我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有的血清標(biāo)本保存在-80℃。PSA檢測(cè)由我院檢驗(yàn)科完成。

二、方法

1. RNA提取：取患者血清300μL，用 mir VanaTPAISTMmiRNA 試劑盒（Applied Biosystems）提取總RNA。按照ABI公司miRNA提取試劑盒分離提取miRNA，嚴(yán)格按照試劑盒說明方法步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)（qRT-PCR）：以總RNA 5μL為模板，應(yīng)用Taq Man MicroRNA Reverse Transcription 試劑盒（ABI）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，總反應(yīng)體系為15μL，反應(yīng)條件如下：16℃30min，42℃ 30min，85℃5min，反轉(zhuǎn)錄引物miRNA-107特異性的莖環(huán)引物（Taq ManMicroRNA Assay ABI），其中上游序列為:5'-AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUCA-3'，下游序列:3'-AUAGCCCUGUACAAUGCUGCUUU-5'；內(nèi)參基因上游序列:5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，下 游 序 列: 3'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-5'，miRNA-107反轉(zhuǎn)錄引物、PCR引物和探針分別來自ABI生物公司TaqMan MiRNA RT Kit和TaqMan MiRNA Assay Kit。熒光定量PCR總反應(yīng)體系為20μL，反應(yīng)條件為：95℃ 10min，95℃ 15s，60℃ 1min，40個(gè)循環(huán)。所有反應(yīng)均在ABI 7500實(shí)時(shí)定量PCR儀上完成，每個(gè)樣本重復(fù)3次，以U6為內(nèi)參基因。采用 2-ΔCt計(jì)算 miRNA-107的相對(duì)定量表達(dá)水平，其中 ΔCt = CtmiRNA-107-CtU6。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用 SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素ANOVA分析和 LSD-t檢驗(yàn)。用SPSS 17.0 軟件繪制ROC曲線。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、miRNA-107在前列腺癌、良性前列腺增生患者血清中的表達(dá)水平

PCa、BPH患者血清 miRNA-107的相對(duì)表達(dá)水平見圖1，PCa 組miRNA-107表達(dá)水平（15.19±4.44）較BPH組（9.66±3.97）增加明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 miRNA-107在前列腺癌組及前列腺增生組中的表達(dá)

二、ROC 曲線分析

miRNA-107對(duì)前列腺癌的診斷價(jià)值用 SPSS 17.0軟件構(gòu)建ROC曲線顯示miRNA-107能夠較好地區(qū)分前列腺癌與BPH，見圖2，ROC曲線顯示，miRNA-107區(qū)分前列腺癌和BPH的ROC曲線下面積（AUC）為0.806（曲線A），95%置信區(qū)間為（0.698～0.913），敏感度和特異性分別為66.7%和83.3%；PSA聯(lián)合miRNA-107區(qū)分PCa和BPH的ROC曲線下面積為0.912（曲線B），95%置信區(qū)間為（0.839～0.985），敏感度和特異性分別為80.0%和86.7%。

圖2 ROC曲線

三、miRNA-107表達(dá)水平與 PCa 臨床特征的相關(guān)性

miRNA-107的表達(dá)水平與PCa患者的年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），Gleason 評(píng)分≥8分組與＜8分組miRNA-107的表達(dá)量分別為17.05±3.61和10.86±2.96，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。血清miRNA-107表達(dá)水平與臨床分期相關(guān)，隨著臨床分期的增加，miRNA-107的表達(dá)水平增加，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。此外，骨轉(zhuǎn)移的PCa miRNA-107表達(dá)量與未轉(zhuǎn)移者相比增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），miRNA-107表達(dá)量與血清PSA水平顯著相關(guān)（P＜0.05），見表1。

討 論

miRNA是一類非編碼、長度約為18～25nt的單鏈小RNA，miRNA參與細(xì)胞重要的生理病理變化過程，并且在研究中發(fā)現(xiàn)許多惡性腫瘤中都觀察到miRNA的異常[2]。Lawrie 等[3]第一個(gè)證實(shí)表明血清中存在腫瘤特異性miRNA，他們發(fā)現(xiàn)彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者的血清中miRNA-21表達(dá)量明顯高于正常對(duì)照組，并且miRNA-21的表達(dá)水平與患者的生存率相關(guān)。近來Chen等[4]發(fā)現(xiàn)血漿microRNA表達(dá)譜可作為PCa非侵入性的標(biāo)志物，并且let-7c、let-7e、miRNA-30c、miRNA-622和miRNA-1285等5個(gè)miRNAs 能夠準(zhǔn)確地區(qū)分PCa和BPH（AUC=0.924）。Chen等研究[5]顯示miRNA-107通過抑制let-7 家族促進(jìn)腫瘤的生長，起“癌基因”的作用。近期，Bryant等[6]應(yīng)用qRT-PCR分析了PCa患者與正常對(duì)照血漿miRNA，篩選出12種異常表達(dá)的miRNA，其中miRNA-107在PCa中明顯高表達(dá)（AUC＝0.62），并且在PCa患者尿液中也發(fā)現(xiàn)了高表達(dá)的miRNA-107。本研究通過qRTPCR檢測(cè)PCa、BPH 血清中miRNA-107的相對(duì)表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miRNA-107在PCa中高表達(dá)，能較好地區(qū)分PCa、BPH，AUC為0.806,與Bryant等[6]研究結(jié)果相一致。PSA聯(lián)合miRNA-107區(qū)分Pca和BPH的AUC為0.912,敏感度和特異性分別為80.0% 和86.7% 。

表1 前列腺癌miRNA-107表達(dá)量與臨床特征的相關(guān)性（±s）

表1 前列腺癌miRNA-107表達(dá)量與臨床特征的相關(guān)性（±s）

臨床特征 n miRNA-107的表達(dá)( 2- ΔCt×10-4)量統(tǒng)計(jì)量 P值年齡(歲)≤70 5 14.30±2.11 t＝0.483 ＞0.05＞70 25 15.37±4.79臨床分級(jí)T1 4 8.00±1.20 F＝52.01 ＜0.01 T2 6 12.36±0.64 T3 11 15.17±1.62 T4 9 20.31±2.49 Gleason評(píng)分＜8 9 10.86±2.96 t＝4.524 ＜0.01≥8 21 17.05±3.61骨轉(zhuǎn)移是6 19.46±2.35 t＝2.963 ＜0.05否24 14.12±4.21 PSA ρB (ng?mL-1)≤10 8 10.41±3.23 t＝4.015 ＜0.05＞10 22 16.65±3.70

本研究還發(fā)現(xiàn) PCa 患者血清miRNA-107水平與Gleason評(píng)分相關(guān)，Gleason評(píng)分＞8的 PCa 患者血清miRNA-107水平明顯增加；此外miRNA-107的表達(dá)水平隨著臨床分期的增加而增加；并且骨轉(zhuǎn)移的PCa患者血清miRNA-107顯著高于未轉(zhuǎn)移者。Bryant等[6]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性PCa與miRNA-107水平相關(guān)，轉(zhuǎn)移性PCa miRNA-107水平高于未轉(zhuǎn)移者。Brase等[7]表明miRNA-107 是高風(fēng)險(xiǎn)腫瘤的標(biāo)志物，循環(huán)miRNA-107水平與 Gleason評(píng)分相關(guān)。上述研究結(jié)果提示，血清miRNA-107可作為PCa診斷和預(yù)后的分子標(biāo)志。近年來發(fā)現(xiàn)循環(huán)miRNA不僅可作為腫瘤診斷和預(yù)后判斷的標(biāo)志物，還可以作為個(gè)性化治療的一種潛在方法[8]。經(jīng)直腸超聲引導(dǎo)下穿刺活檢是我國PCa診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[9]，隨著PSA在臨床上的廣泛應(yīng)用，PCa的診斷及治療技術(shù)不斷完善，PCa的綜合治療趨于成熟，但是25%～50%的患者仍然面臨著生化復(fù)發(fā)問題，即術(shù)后PSA水平的升高[10]。我國逐步邁入老齡化社會(huì)，人均壽命的不斷增長，生活習(xí)慣及飲食結(jié)構(gòu)的不斷改變，PCa發(fā)病率不斷攀升，此外中老年男性缺乏泌尿外科相關(guān)的科普知識(shí)，出現(xiàn)排尿梗阻等不適癥狀時(shí)往往未及時(shí)就診，我國PCa患者確診時(shí)多屬晚期，常常導(dǎo)致預(yù)后差、死亡率高的現(xiàn)狀，因此對(duì)于中老年男性應(yīng)提倡PCa的早期篩查。PSA聯(lián)合檢測(cè)血清miRNA-107對(duì)于PCa的臨床診斷意義重大，可以增加前列腺穿刺活檢的陽性率，避免不必要的前列腺穿刺等，但仍需后續(xù)的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。根據(jù)miRNA-107的具體含量來輔助評(píng)定臨床中診斷證據(jù)不足或者難以診斷的患者是否可行PCa的相關(guān)治療，完成PCa的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，對(duì)提高患者治愈率和預(yù)后生活水平有重要意義。

綜上所述，PCa患者血清中可以檢測(cè)到miRNA-107高表達(dá)，可以作為PCa的早期診斷及評(píng)定預(yù)后的標(biāo)記物之一，聯(lián)合PSA檢測(cè)的結(jié)果，對(duì)于PCa的臨床早期診斷具有協(xié)同作用，或許對(duì)PSA水平增高但穿刺活檢為陰性的患者有特殊的意義，但相關(guān)數(shù)據(jù)仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。由于本研究樣本量偏小，會(huì)產(chǎn)生偏倚，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量及多中心的患者群體中進(jìn)一步驗(yàn)證，為PCa的早期診斷、療效判斷及預(yù)后分析提供有力武器。

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