劉丹

摘要：葉綠素a檢測(cè)是生物監(jiān)測(cè)水質(zhì)和評(píng)價(jià)藻類生物量的重要指標(biāo)，但是從當(dāng)前實(shí)際情況來(lái)看，水質(zhì)中葉綠素a檢測(cè)方法存在研磨損失問(wèn)題。文章總結(jié)分析了反復(fù)凍融法、超聲波法、熱乙醇法等改進(jìn)方法，為如何優(yōu)化水質(zhì)中葉綠素a的提取方法進(jìn)行策略分析。

關(guān)鍵詞：水質(zhì)；葉綠素a；提取方法；優(yōu)化分析

葉綠素a是地表水監(jiān)測(cè)的常規(guī)項(xiàng)目，是評(píng)價(jià)水體初級(jí)生產(chǎn)力和水體富營(yíng)養(yǎng)化的重要指標(biāo)。目前環(huán)境監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室主要采用的是《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》（第四版）（以下稱第四版）中《葉綠素a的測(cè)定方法—丙酮研磨提取法》和2017年12月21日環(huán)境保護(hù)部首次發(fā)布的《葉綠素a的測(cè)定 分光光度法 HJ 897-2017》。兩種方法都是采用研磨法作為提取方法，但在大量的實(shí)際研究工作中發(fā)現(xiàn)，研磨可能導(dǎo)致葉綠素a的損失。目前，已有研究對(duì)標(biāo)準(zhǔn)方法中葉綠素a提取方法進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)，如：反復(fù)凍融法、超聲波法、熱乙醇法等[1-3]。本文就上述幾種提取方法的操作步驟、優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行總結(jié)，為優(yōu)化水質(zhì)中葉綠素a檢測(cè)方法進(jìn)行分析。

一、研磨浸提法

研磨的內(nèi)涵是破碎的細(xì)胞壁在丙酮溶液的作用下能夠確保葉綠素a更容易被析出。HJ 897-2017規(guī)定，將樣品濾膜置于研磨器中，加入3～4ml丙酮溶液研磨至糊狀，并重復(fù)1～2次，保證充分研磨5min以上，在4°C避光浸提2～24h，離心取上清液，再用0.45μm聚四氟乙烯有機(jī)相針式濾器過(guò)濾上清液后測(cè)定。該方法在第四版的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，減少了多次研磨、轉(zhuǎn)移過(guò)程中樣品的損失。但仍存在手動(dòng)研磨費(fèi)時(shí)費(fèi)力、人為誤差較大、研磨器表面附著等問(wèn)題，不僅會(huì)造成葉綠素a提取不完全，長(zhǎng)時(shí)間與有神經(jīng)毒性的丙酮溶液接觸也不利于實(shí)驗(yàn)人員身體健康。

二、反復(fù)凍融浸提法

反復(fù)凍融浸提法是利用細(xì)胞冰粒的形成和細(xì)胞液濃度的增高引起溶脹以達(dá)到破碎細(xì)胞的目的。反復(fù)凍融—浸提法操作步驟分為冰凍、解凍、浸提三步，將濾膜放入黑色塑料袋或用錫箔紙包好，在-20°C和室溫下反復(fù)凍融3～5次（冰凍時(shí)間為20min，解凍時(shí)間為5min），再放進(jìn)10ml 90%丙酮溶液中震搖1min，4°C避光浸提20h后離心測(cè)定。

研究表明，反復(fù)凍融浸提法對(duì)葉綠素a的提取效果優(yōu)于研磨浸提法[4]。不僅其有效減少了操作過(guò)程中樣品的損耗，而且在顯微鏡下觀察細(xì)胞破碎率達(dá)90%，明顯高于研磨法[5]。因此反復(fù)凍融浸提法所測(cè)得的濃度水平較高，平行樣品間的標(biāo)準(zhǔn)偏差也較小，重現(xiàn)性較好。同時(shí)，降低了試驗(yàn)人員與丙酮的接觸時(shí)間。但反復(fù)凍融破碎的效果也因水體內(nèi)藻類的不同而存在差異。陳明等發(fā)現(xiàn)，反復(fù)凍融—浸提法對(duì)微囊藻葉綠素a的提取效果優(yōu)于小球藻[6]。這是因?yàn)榍罢呒?xì)胞壁多由肽聚糖組成易破碎，而后者細(xì)胞壁中含有大量纖維組織，穩(wěn)定性好，較難破碎。同時(shí)，該方法在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)濾膜的水分含量和反復(fù)凍融時(shí)間的掌握也尤為重要[7]。

三、超聲波提取法

超聲波提取法就是利用超聲波的能量起到破碎細(xì)胞的作用。操作方法較為簡(jiǎn)單，即將濾膜置于有90%丙酮溶液的離心管中，于超聲波儀破碎30min，然后定容、離心、待測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，超聲波提取法測(cè)定所得的葉綠素a濃度水平是研磨提取法的1.08～1.57倍，提取效率明顯提高[3]。同時(shí)，該方法也具有安全性高、系統(tǒng)操作誤差小的優(yōu)點(diǎn)。然而，與反復(fù)凍融—浸提法相似的是，該方法的提取效果也易受藻類細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的影響[6]。

四、熱乙醇浸提法

熱乙醇浸提法在操作過(guò)程用安全的乙醇替代揮發(fā)性強(qiáng)的丙酮，在國(guó)際上采用率較高。該方法的原理是利用冷凍再熱融過(guò)程引起細(xì)胞溶脹破碎，同時(shí)加熱升溫以增加乙醇萃取能力，從而使葉綠素a提取的更充分。操作步驟為將冷凍后的濾膜置于比色管中，迅速加入7～8ml 95%的熱乙醇振搖，并水浴萃取1～2min，浸提后定容、離心測(cè)定。

研究發(fā)現(xiàn)，熱乙醇浸提法對(duì)綠藻為主的水體中葉綠素a的提取效果較好，甚至優(yōu)于反復(fù)凍融浸提法和超聲波浸提法[6]。但也有研究表明熱乙醇浸提法測(cè)得的葉綠素a含量與研磨浸提法所測(cè)數(shù)據(jù)無(wú)顯著差異[3，8]。該方法優(yōu)勢(shì)在于樣品損失小、安全性高，操作簡(jiǎn)單。然而，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，水浴的時(shí)間和溫度控制尤為重要。溫度過(guò)高，乙醇蒸發(fā)、葉綠素a的穩(wěn)定性被破壞均會(huì)使實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏低；溫度過(guò)低則會(huì)造成提取不完全，使結(jié)果偏低。楊玉珍等在對(duì)水浴溫度、浸提溫度、浸提時(shí)間等實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行比較優(yōu)化后提出，抽濾后濾膜先冷凍8h以上，然后在80°C條件下水浴萃取，室溫浸提12h以上提取效果更好[2]。也有學(xué)者認(rèn)為90%丙酮比95%乙醇的穿透性更強(qiáng)、萃取效率更高，更能完全提出浮游植物的葉綠素a[8]。

結(jié)論：

綜上所述，葉綠素a提取方法的改進(jìn)主要是解決研磨過(guò)程中樣品損失的問(wèn)題。研究人員提出的反復(fù)凍融法、超聲波法和熱乙醇法改進(jìn)策略操作簡(jiǎn)便、安全性高、重復(fù)性好、人為誤差小，提取效果較好，但在實(shí)際操作過(guò)程中時(shí)間、溫度、藻類種類等客觀因素對(duì)葉綠素a的提取效果影響較大。因此針對(duì)不同的水體、不同實(shí)驗(yàn)條件選擇或組成最佳的葉綠素a的提取方法可達(dá)到客觀反映水體初級(jí)生產(chǎn)力和水體富營(yíng)養(yǎng)化的目的。

參考文獻(xiàn)

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[8]黃昌妙，葉樹才，王潮.浮游植物葉綠素a測(cè)定方法的比較分析[J].福建分析測(cè)試，2013，22（4）：23-27.

（作者單位：自貢市自流井區(qū)環(huán)境監(jiān)測(cè)站）