劉成洪，郭桂梅，何 婷，陸瑞菊*，黃劍華*

（1.上海市農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所，上海201106；2.上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室，上海201106）

大麥是我國啤酒工業(yè)不可替代的主體原料，也是畜牧養(yǎng)殖業(yè)的優(yōu)質能量飼料，還是營養(yǎng)價值豐富的食品加工原料，對促進國民經(jīng)濟發(fā)展和滿足人民群眾健康生活需求發(fā)揮重要作用。青稞為食用裸大麥，是青藏高原藏族人民等賴以生存和繁衍的主要食物來源，對西部發(fā)展和邊疆穩(wěn)定也具有重要意義[1]。我國大麥種植區(qū)域遼闊，生產(chǎn)用途多樣化，市場需求巨大，因此需要選育更多更好的大麥新品種來滿足國內(nèi)生產(chǎn)需要[2]。

要加速新品種的選育，必須加大育種技術研發(fā)力度。小孢子培養(yǎng)技術是近年來發(fā)展起來的一項高效的單倍體育種手段，該技術已在油菜、煙草和大麥等作物育種中實現(xiàn)[3]，但這一技術的真正推廣應用在很大程度上受到技術體系的成熟度和育種材料的基因型限制。為了解決大麥青稞育種中的這一瓶頸問題，筆者所在植物細胞工程科研團隊經(jīng)過多年技術攻關，在大麥中建立了小孢子高頻再生的成熟體系，并在來自全國各地大量育種材料中成功取得小孢子培養(yǎng)再生綠苗，進一步與各地育種團隊合作育成了一批大麥和青稞優(yōu)良新品系和品種，在此基礎上還拓展了系列大麥遺傳改良新方法。

1 大麥小孢子高頻再生體系的建立

針對大麥生產(chǎn)上的主栽品種或育種材料建立小孢子高頻再生體系，是將小孢子培養(yǎng)技術應用于大麥育種生產(chǎn)實踐的一個前提條件。只有通過小孢子離體培養(yǎng)再生，獲得足夠多的加倍單倍體（double haploid，DH）植株，進一步產(chǎn)生永久純合穩(wěn)定的DH株系，才能用于目標性狀篩選。筆者通過對供體植株生長、離體穗預處理、小孢子游離提取液、小花共培養(yǎng)、誘導培養(yǎng)基、轉分化時間、分化培養(yǎng)基、壯苗生根、倍性鑒定、加倍處理、煉苗移栽等各個步驟進行優(yōu)化，針對我國大麥主栽品種或育種材料建立了小孢子高頻再生體系（表1）。

利用上述建立的大麥小孢子高頻再生體系，從我國大麥栽培的不同生態(tài)區(qū)，選取代表性主栽品種，于2017年開展了游離小孢子培養(yǎng)。針對北方春大麥區(qū)，選取了黑龍江省農(nóng)墾總局紅興隆農(nóng)業(yè)科學研究所選育的墾啤麥7號和甘肅省農(nóng)科院啤酒原料研究所選育的甘啤6號；針對黃、淮以南秋播大麥區(qū)，選取了江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所與中科院遺傳所合作選育的蘇啤3號，同時選取了上海市農(nóng)業(yè)科學院與浙江省嘉興市農(nóng)業(yè)科學研究院合作選育的花30作為對照。結果表明，在4份大麥主栽品種中，花30的小孢子再生綠苗頻率最高（表2），達到平均每皿378.7株（小孢子為1×105個/皿），較前期報道的另一大麥主栽品種花22的小孢子綠苗再生頻率[253株/（1×105個小孢子）]有了更進一步提高[4]，超過了國外花培反應高的模式品種Igri的再生頻率，其最高花培再生頻率為1 009.8株/（100個花藥），綠苗數(shù)占總再生苗的87.6%[5]，按每個花藥平均獲得3 000個游離小孢子折算[6]，其再生頻率為295株/（1×105個小孢子）。其次為甘啤6號，小孢子綠苗再生頻率為216.3株/（1×105個小孢子），有著較高的綠苗比例（表2）。由此可以看出，4份材料的小孢子再生綠苗單皿均可達到百株以上。此外仍有部分白苗，白苗比例過高是將來小孢子高頻再生體系中需要進一步解決的問題。

表1 大麥小孢子高頻再生體系的優(yōu)化

表2 我國大麥栽培不同生態(tài)區(qū)4份代表品種的游離小孢子培養(yǎng)結果

針對青藏高原裸大麥區(qū)的青稞作物，也是小孢子培養(yǎng)中遲鈍基因型材料，陸瑞菊等已在國際上首次報道了青稞的小孢子再生成苗技術[7]，目前正在開展高頻再生體系優(yōu)化工作。

2 小孢子高頻再生技術在大麥青稞育種中的應用

自2009年起，筆者利用建立的小孢子高頻再生技術，結合在此基礎上發(fā)展形成的小孢子高鹽、低氮、赤霉病菌毒素脅迫培養(yǎng)篩選等新方法，連續(xù)為湖北、甘肅、黑龍江、內(nèi)蒙、青海等地的大麥青稞育種團隊提供育種材料的小孢子培養(yǎng)公益服務，截止2017年底已培養(yǎng)育種材料528份，獲得再生植株12萬多株（表3）。近5年來每年都有上萬份小孢子再生苗移栽云南昆明基地，成活率達90%以上，再生植株結實率達90%以上。各育種團隊獲得小孢子培養(yǎng)形成的加倍單倍體株系后，在當?shù)亻_展鑒定性試驗和品比試驗，快速形成了一批優(yōu)良大麥青稞新品系和品種（表4、表5），極大地提高了我國大麥青稞主產(chǎn)區(qū)的育種效率。

在建立大麥小孢子高頻再生技術的基礎上，近年來還發(fā)展了3項遺傳改良的新方法，目前已取得初步應用效果：1）不經(jīng)種子的單株小孢子高效培養(yǎng)技術（專利申請?zhí)枺?01510890842.3）。利用小孢子培養(yǎng)高頻再生基因型大麥花30品種，不僅實現(xiàn)了當代單株來源小孢子高頻再生[8]，而且實現(xiàn)了不經(jīng)種子階段的再生植株小孢子高頻再生，這一技術目前已用于大麥花30與西藏野生大麥遠緣雜交胚挽救形成的F1小孢子培養(yǎng)，為野生種質材料外源基因滲入栽培種的難題提供了新的解決途徑。2）基于小孢子高頻再生體系的轉基因方法（專利申請?zhí)枺?01611011357.5）。利用農(nóng)桿菌直接侵染游離培養(yǎng)小孢子，成功將目標基因BAK03316轉入大麥品種“花30”中，轉化效率約為17%，遠遠高于前期用基因槍轟擊花藥轉化小孢子的頻率[16]；利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)對MLO基因 (白粉病廣譜抗性基因)在小孢子水平進行編輯，獲得的大麥花30（高感白粉病）小孢子再生植株對接種白粉病表現(xiàn)出高抗，目前正在進行基因編輯效率研究。3)單倍體群體構建方法（專利申請?zhí)枺?01410710796.X）。利用小孢子培養(yǎng)中獲得的單倍體植株，采用基部分蘗節(jié)誘導叢生芽的方法成功獲得大量單倍體再生植株[14]，繼代5次后鑒定仍然保持單倍體倍性，建立了單倍體無性繁殖的穩(wěn)定群體[15]，解決了單倍體種質保存與常年利用的難題，目前已從保存單倍體植株中制備獲得了葉肉細胞原生質體，并正在開展轉基因和基因編輯研究。

3 展望

小孢子培養(yǎng)技術提供了一個單倍體生殖細胞離體培養(yǎng)再生系統(tǒng)，相比傳統(tǒng)花藥培養(yǎng)更高效。有研究報道大麥中小孢子培養(yǎng)再生綠苗相比花藥培養(yǎng)平均提高9.3倍[17]，表明小孢子培養(yǎng)技術在綠苗高頻再生方面比花藥培養(yǎng)技術更有潛力。盡管國內(nèi)外已有大麥小孢子培養(yǎng)方法優(yōu)化的系列報道，但要將小孢子培養(yǎng)技術真正用于育種，首先要針對生產(chǎn)上大量使用的育種材料優(yōu)化小孢子培養(yǎng)方法，突破基因型障礙；其次要建立一套高頻再生綠苗程序，獲得大量小孢子再生植株；最后，還需要建立一套高效的加倍單倍體形成方法。筆者所在團隊已通過技術研發(fā)建立了上述一整套小孢子高頻再生技術體系，并用于大麥青稞的規(guī)模化育種，實現(xiàn)了在1～2年內(nèi)從1個優(yōu)良雜交組合獲得上百份永久純合的加倍單倍體，可供育種家開展多年、多目標性狀的篩選鑒定，大大加速了育種進程，提高了常規(guī)育種效率，顯示出了巨大的應用潛力。

突破大麥小孢子高頻再生技術瓶頸，經(jīng)單個培

養(yǎng)皿培養(yǎng)就可以獲得上百株再生植株，在此基礎上還可發(fā)展單倍體細胞水平的誘變、脅迫篩選、轉基因、基因編輯以及原生質體融合等多種技術手段[18]。筆者所在團隊早期利用小孢子培養(yǎng)中加入高鹽、低氮、赤霉病菌毒素等非生物脅迫處理，結合誘變或雜交手段獲得的加倍單倍體株系中成功篩選到了一批耐鹽性、耐低氮性和抗病性提高的突變體材料[19-22]，初步顯示了誘變、雜交等傳統(tǒng)育種手段與小孢子脅迫培養(yǎng)結合形成的細胞工程復合育種技術的應用潛力。近年來，基于小孢子高效培養(yǎng)體系拓展的不經(jīng)種子階段的單株小孢子連續(xù)培養(yǎng)、單倍體群體構建與單倍體材料的轉基因、基因編輯以及原生質體培養(yǎng)等技術也取得了一定進展，且正在進一步優(yōu)化中。這些技術的研發(fā)將在麥類作物遺傳改良的基礎研究和應用研究方面發(fā)揮重要作用，同時也為水稻、小麥等重要禾谷類作物的遺傳改良提供有益借鑒。

表3 不同來源大麥青稞材料的小孢子培養(yǎng)再生綠苗頻率

表4 利用小孢子育種技術選育的大麥青稞新品系

表5 利用小孢子育種技術選育的大麥青稞新品種

參考文獻：

[1]國家大麥青稞產(chǎn)業(yè)技術體系.中國現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略研究·大麥青稞分冊[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2017:1-3.

[2]邊秀秀,李志蘭,任紅艷,等.我國大麥產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀和遺傳育種研究重點趨勢分析[J].生物技術進展,2012(5):309-314.

[3]FERRIE A MR,CASWELL K L.Isolated microspore culture techniques and recent progress for haploid and doubled haploid plantproduction[J].PlantCellTissue&Organ Culture,2011,104(3):301-309.

[4]陳志偉,陸瑞菊,黃劍華.大麥空間誘變與小孢子培養(yǎng)復合育種技術及應用[J].上海農(nóng)業(yè)學報,2012,28(4):160-160.

[5]JACQUARD C,ASAKAVICIUTE R,HAMALIAN A M,et al.Barley anther culture:effects of annual cycle and spike position on microspore embryogenesis and albinism[J].Plant Cell Reports,2006,25(5):375-381.

[6]OLSENFL.Isolationandcultivationofembryogenicmicrospores from barley(Hordeum vulgareL.)[J].Hereditas,1991,115(3):255.

[7]陸瑞菊,高潤紅,郭桂梅,等.青稞的小孢子離體培養(yǎng)和植株再生[J].植物生理學報,2014，50(12):1764-1768.

[8]郭桂梅,何 婷,劉成洪,等.大麥單株小孢子植株再生及脅迫培養(yǎng)研究[J].植物生理學報,2015，51(12):2201-2206.

[9]郭桂梅.水稻和大麥游離小孢子培養(yǎng)條件的優(yōu)化[D].上海:上海海洋大學,2013.

[10]陸瑞菊.大麥游離小孢子培養(yǎng)技術的優(yōu)化及單倍體耐鹽、耐低氮脅迫篩選體系的建立[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學,2012.

[11]LU R,WANG Y,SUN Y,et al.Improvement of isolated microspore culture of barley(Hordeum vulgareL.):the effect of floretco-culture[J].PlantCellTissue&Organ Culture,2008,93(1):21-27.

[12]LU R,CHEN Z,GAO R,et al.Genotypes-independent optimization ofnitrogen supplyfor isolated microspore cultures in barley[J].BioMed Research International,2016,2016:1-8.

[13]何 婷,陸瑞菊,高潤紅,等.大麥單倍體的離體培養(yǎng)與快速繁殖[J].植物生理學報,2014，50(12):1780-1784.

[14]何 婷,郭桂梅,陸瑞菊,等.大麥小孢子來源單倍體試管苗擴繁中的倍性檢測[J].植物生理學報,2015，51(12):2270-2274.

[15]何 婷,郭桂梅,陳志偉,等.大麥小孢子再生植株氣孔保衛(wèi)細胞長度與倍性的相關性 [J].麥類作物學報,2014,34(2):175-180.

[16]杜志釗,高潤紅,陳志偉,等.利用基因槍轟擊花藥將GUS基因導入大麥小孢子[J].麥類作物學報,2011,31(6):1025-1029.

[17]LI H,DEVAUX P.Isolated microspore culture overperforms anther culture for green plant regeneration in barley(Hordeum vulgareL.)[J].Acta Physiologiae Plantarum,2005,27(4):611-619.

[18]王亦菲,陸瑞菊,黃劍華.花藥和小孢子培養(yǎng)技術應用于大麥育種的回顧與展望[J].植物生理學報,2014,50(12):1753-1758.

[19]陸瑞菊,徐紅衛(wèi),陳志偉,等.源于小孢子培養(yǎng)的大麥耐鹽變異體獲取[J].植物生理學報,2012,48(11):1069-1078.

[20]劉成洪,陸瑞菊,郭桂梅,等.誘變結合小孢子培養(yǎng)創(chuàng)制大麥黃花葉病不同抗性突變體[J].核農(nóng)學報,2015,29(11):2065-2070.

[21]徐紅衛(wèi),陸瑞菊,劉成洪,等.源于大麥F1小孢子氮脅迫培養(yǎng)自交一代的耐低氮性評價[J].麥類作物學報,2015,35(12):1646-1652.

[22]高潤紅,馬運濤,方春燕,等.大麥赤霉病抗性不同突變體的創(chuàng)制及其相關基因表達[J].核農(nóng)學報,2017,31(3):417-423.