張旭光 郭弘藝 宋佳坤

(1. 上海海洋大學(xué)海洋動(dòng)物系統(tǒng)分類與進(jìn)化上海高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 201306； 2. 上海海大學(xué)科技部海洋生物學(xué)國(guó)際聯(lián)合研究中心， 上海 201306； 3. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心， 上海 201306)

水下噪聲污染是近年來備受關(guān)注的環(huán)境污染問題， 尤其是來自航運(yùn)中船舶馬達(dá)和海上風(fēng)電機(jī)的低頻噪聲污染日益嚴(yán)重[1]。魚類可以通過內(nèi)耳來感知水中的聲音信號(hào)， 此外， 聲信號(hào)在其捕食、避害、生殖、洄游、棲息地選擇等行為中都有重要的作用[2]。而水下噪聲不僅會(huì)遮蔽與魚類上述行為相關(guān)的聲音線索， 甚至?xí)斐婶~類的聽覺喪失和內(nèi)分泌應(yīng)激反應(yīng)等負(fù)面影響[3，4]， 從而影響其攝食、避害、生殖和洄游等行為， 長(zhǎng)期以往可能會(huì)影響其種群補(bǔ)充量、群體結(jié)構(gòu)和生態(tài)功能等。

褐菖鲉(Sebasticus marmoratus)是典型的近岸巖礁魚類， 廣泛分布于我國(guó)東南沿海， 具有較高的生態(tài)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[5]。由于航道開發(fā)和近岸工程等人為活動(dòng)的影響， 褐菖鲉的活動(dòng)范圍受到了嚴(yán)重地縮減， 其野生資源量已急劇下降， 急需對(duì)褐菖鲉資源開展保護(hù)[6]。最近的研究表明， 褐菖鲉可通過魚鰾肌收縮發(fā)出聲音進(jìn)行種間聲訊交流[7，8]。這樣，近岸水下工程產(chǎn)生的水下噪聲以及船舶噪聲則可能對(duì)其聲訊交流造成一定的影響。確定褐菖鲉的聽覺敏感性是評(píng)估水下噪聲對(duì)其影響的重要前提。Lee等[9]曾利用行為馴化條件下的心電圖技術(shù)研究了褐菖鲉的聽覺閾值。然而， 這種方法需要實(shí)驗(yàn)魚經(jīng)過一段長(zhǎng)期的訓(xùn)練以形成生理上對(duì)聲音信號(hào)的條件反射， 并不能客觀反映實(shí)驗(yàn)對(duì)象的聽覺特性。目前， 聽覺誘發(fā)位電位(Auditory Evoked Potential， AEP)作為一種微創(chuàng)傷性的電生理技術(shù)廣泛應(yīng)用于魚類的聽覺方面的各種研究中[10]。因此， 本文利用聽覺誘發(fā)電位法研究褐菖鲉的聽覺閾值， 以確定其聽覺敏感性， 進(jìn)一步理解其聲訊交流機(jī)制和環(huán)境適應(yīng)性機(jī)制， 并為水下噪聲對(duì)經(jīng)濟(jì)魚類的影響評(píng)估提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用褐菖鲉為浙江省舟山枸杞島(30°42′48″N，122°46′42″E)附近海域采用定置網(wǎng)具所捕的漁獲物，全長(zhǎng)7.3—13.2 cm， 平均(10.3±2.1) cm， 體重30—60 g， 平均(45.3±12) g。實(shí)驗(yàn)魚由船運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)， 暫養(yǎng)水槽規(guī)格為100 cm×40 cm×45 cm， 水溫為22—24℃， 正常自然光照。根據(jù)褐菖鲉喜棲巖礁的特性， 暫養(yǎng)水槽內(nèi)放置多個(gè)瓦礫塊作為其棲息場(chǎng)所。暫養(yǎng)期間投喂人工配合顆粒飼料以及小雜魚。實(shí)驗(yàn)前， 挑選無外傷， 有活力的褐菖鲉進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前采用0.1%的MS-222麻醉3—5min， 并在其軀干背部注射加拉碘銨抑制肌肉活動(dòng)， 劑量為2—4 μg/g(體重)， 僅見魚鰓蓋輕微扇動(dòng)。

1.2 AEP記錄

實(shí)驗(yàn)魚通過自制的夾持器固定在實(shí)驗(yàn)水槽中(r=15 cm)， 并通過自重力富氧流水進(jìn)行人工灌流，以保持實(shí)驗(yàn)魚的呼吸[11，12]。水槽放置于位于隔音室(2.5 m×2.5 m×2 m， 上海聲諾)內(nèi)的防震臺(tái)(ZDT07-07， 江西連勝)上。隔音室內(nèi)的空氣本底噪聲為25 dB(上海聲諾)。

實(shí)驗(yàn)時(shí)， 使魚頭部背側(cè)露出水面1—2 mm， 記錄電極(Rochester Electro-Medical， 美國(guó))置于頭骨的中縫線上， 延腦上方。參考電極置于記錄電極前方1—2 cm處。2個(gè)電極穿過紙巾緊緊地固定于皮膚上。另有一根接地電極置于魚尾附近的水體中。所有電極均直接連接至前置放大器(RA4LI，Tucker Davis Technologies TDT， 美國(guó))， 并通過光纖與TDT聽覺生理工作站(RZ6， 內(nèi)置數(shù)模轉(zhuǎn)換和信號(hào)同步， TDT， 美國(guó))相連。

聲音刺激文件由軟件SigGenRZ (TDT， 美國(guó))設(shè)置。頻率設(shè)置為100、150、200、300、500、800、1000 Hz。聲音時(shí)程(Duration)為12ms， 含2ms起落(rase/fall)， 以減少聲音輸出的瞬變。聲音信號(hào)通過功率放大器(D75A， Crown， 英國(guó))輸至位于水槽底部的水下?lián)P聲器(UW-30， University Sound， 美國(guó))。實(shí)驗(yàn)魚距離水下?lián)P聲器 18 cm， 水槽內(nèi)的實(shí)際聲音信號(hào)， 由置于魚耳附近的水聽器(8103， B&K， 丹麥)進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè)量。測(cè)量的聲音信號(hào)通過電荷放大器(2692， B&K， 丹麥)輸入TDT數(shù)模轉(zhuǎn)換模塊。實(shí)驗(yàn)中采集的AEP信號(hào)經(jīng)放大器， 也輸入TDT數(shù)模轉(zhuǎn)換模塊， 并由軟件BigSigRZ (TDT， 美國(guó))同步保存聲音信號(hào)與AEP信號(hào)。

實(shí)驗(yàn)魚聽覺閾值確定方法與Kenyon等相似[11，13]。實(shí)驗(yàn)時(shí)設(shè)置2個(gè)相位相反的刺激聲音， 分別為90°和270°， 如果它們誘發(fā)的腦電位波形具有重合性， 即可視為正確的AEP反應(yīng)。聲音刺激強(qiáng)度設(shè)置為從110到60 dB， 每次以3 dB遞減， 直至不可產(chǎn)生可重復(fù)的AEP波形， 此時(shí)對(duì)應(yīng)的刺激聲音的聲壓級(jí)即為該頻率的聽覺閾值[14，15]。實(shí)際刺激聲的聲壓級(jí)通過水聽器記錄的聲音波形和水聽器校正系數(shù)共同確定。

2 結(jié)果

2.1 褐菖鲉AEP波形特征

實(shí)驗(yàn)對(duì)8條褐菖鲉進(jìn)行了AEP測(cè)試。2個(gè)相位相反的刺激聲音誘發(fā)的AEP波形可以基本重合(圖1)， 而且2個(gè)AEP波形之間的自相關(guān)系數(shù)(R值)也較高。但隨著刺激強(qiáng)度的降低， AEP波形的自相關(guān)系數(shù)(R值)也逐漸降低。在刺激強(qiáng)度較大時(shí)， 其R值在0.7—0.9內(nèi)波動(dòng)， 當(dāng)接近聽覺閾值時(shí)， 其R值急劇下降， 但波形仍表現(xiàn)一定的反應(yīng)幅度。AEP反應(yīng)的波形幅度也隨著刺激強(qiáng)度的降低而減弱， 通常反應(yīng)幅度降至10—20 μV左右時(shí)， 基本也接近聽覺閾值。由于AEP反應(yīng)具有與聲音相位無關(guān)的特性[10，16]， 如果AEP波形不能重合時(shí)， 即無AEP反應(yīng)， 其R值則可能接近或低于零。

根據(jù)波形形狀特點(diǎn)， 褐菖鲉AEP波形可分為3類(圖 2)。一類是100 Hz低頻信號(hào)誘發(fā)的AEP波形， 波形相對(duì)于基線波動(dòng)較平緩； 第二類是150—300 Hz誘發(fā)的AEP波形， 首先是產(chǎn)生1個(gè)相對(duì)于基線的負(fù)向峰， 在這個(gè)負(fù)向峰上可能出現(xiàn)多個(gè)小的負(fù)向峰， 緊接著1個(gè)相對(duì)基線的正向峰； 第三類是500—800 Hz誘發(fā)的AEP波形首先是一個(gè)相對(duì)于基線的正向起伏， 緊接著一個(gè)緩慢的負(fù)向峰。

褐菖鲉AEP波形的另一個(gè)基本特征是AEP反應(yīng)頻率幾乎是刺激頻率的兩倍。如圖 3所示， 150 Hz的聲音信號(hào)在水槽中的實(shí)際頻率為143 Hz， 其對(duì)應(yīng)的AEP波形的頻譜中則存在具有二倍關(guān)系的287 Hz頻率峰， 而另一個(gè)597 Hz的頻率峰則可能來自聲音信號(hào)中262 Hz的聲音畸變信號(hào)。這種兩倍關(guān)系的特點(diǎn)也可簡(jiǎn)單的從兩者波形疏密程度看出(圖 2)。

2.2 褐菖鲉聽力圖

實(shí)驗(yàn)共記錄了8尾褐菖鲉對(duì)100—1000 Hz短純音刺激的AEP反應(yīng)。將8尾褐菖鲉在各測(cè)量頻率下獲得的聽覺閾值平均后， 可得出褐菖鲉的聽力曲線圖(圖 4， AEP)。根據(jù)聽力曲線圖， 褐菖鲉的聽力曲線在100—1000 Hz的頻率范圍內(nèi)呈線性上升， 聽覺閾值隨聲音頻率的增加而增加， 即隨著聲音頻率的增加， 褐菖鲉聽覺敏感性降低。褐菖鲉對(duì)低頻聲音信號(hào)較敏感， 主要頻率范圍100—300 Hz， 其聽覺閾值為70—79 dB， 其中最敏感的頻率為150 Hz， 對(duì)應(yīng)的聽覺閾值為(70±1.1) dB， 對(duì)500 Hz以上的聲音敏感性較差， 其聽覺閾值已達(dá)90 dB以上。

3 討論

圖 1 不同相位和刺激強(qiáng)度誘發(fā)的褐菖鲉AEP波形Fig. 1 AEP wave forms of marbled rockfish in response to 100 Hz tone bursts at stimulus levels from 86.9 dB to 54 dB with starting phases of 90° and 270°， respectively

目前， 聽覺誘發(fā)電位法(AEP)是世界公認(rèn)的最快、最準(zhǔn)確的確定魚類聽覺閾值的方法[14]。相對(duì)傳統(tǒng)的行為條件反射方法或其它創(chuàng)傷性電生理法，AEP方法無需對(duì)動(dòng)物長(zhǎng)期馴化或進(jìn)行組織破壞性的解剖， 具有快速、可重復(fù)試驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)[13—17]。本文首次應(yīng)用聽覺腦干誘發(fā)電位法研究了鲉形目魚類褐菖鲉的聽覺閾值。確定動(dòng)物的電位變化是否為AEP反應(yīng)的方法是采用相位相反的二組聲音刺激，如果誘發(fā)波形表現(xiàn)出與刺激聲音相位無關(guān)的波形重合性， 則表明該電位變化為正確的AEP波形。波形重合性可以通過第二實(shí)驗(yàn)人經(jīng)肉眼檢測(cè)或通過波形自相關(guān)系數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。理論上來說， 相位相反的聲音信號(hào)互相疊加后可消除AEP波形中聲音信號(hào)的干擾[16]。然而， 由于實(shí)驗(yàn)條件限制， 如實(shí)驗(yàn)水槽的諧振， 聲音的反射等， 聲音信號(hào)疊加后并不能完全消除， 依然存在一些聲音信號(hào)的殘跡， 但聲音偽跡的特點(diǎn)是波形起伏相對(duì)于基線是平行的。而AEP波形在疊加后， 表現(xiàn)出相對(duì)于基線起伏的正向或負(fù)向峰(圖 2)， 這與Kenyon等[13]在金魚(Carassius auratus)聽覺閾值研究中的結(jié)果相似。但是， 褐菖鲉在低頻段的AEP波形相對(duì)基線起伏較平緩， 只有在高頻段的AEP波形才有相對(duì)基線的負(fù)向或正向起伏。Lu等[17]在金魚的聽覺閾值研究中發(fā)現(xiàn)， 100 Hz的純音誘發(fā)的AEP波形也相對(duì)基線較平緩， 只有500 Hz時(shí)， 才出現(xiàn)相對(duì)于基線起伏顯著的波峰。在魚類中， 一般只有高頻短純音可以誘發(fā)較好的聽覺腦干電位， 這可能與聽覺神經(jīng)元的頻率響應(yīng)有關(guān)，但具體的神經(jīng)機(jī)制還尚不清楚[18]。另外， 魚類對(duì)聲音或機(jī)械波的感受主要涉及聲壓感受或微粒子運(yùn)動(dòng)位移感受。對(duì)于聽覺敏感型魚類， 通過魚鰾與內(nèi)耳的連接(或相對(duì)靠近)提高了聲壓感受的敏感性，也提高的聽覺閾值的上限[19]。因此， 聽覺敏感型的魚類的聽覺上限可達(dá)數(shù)千赫茲。缺乏內(nèi)耳與魚鰾聯(lián)系的魚類則對(duì)低頻的微粒子運(yùn)動(dòng)位移更敏感， 而無鰾魚類則只對(duì)微粒子位移敏感[20，21]?？梢姡?聽覺腦干誘發(fā)電位更適用于聲壓感受魚類的聽覺閾值研究， 而低頻聲音信號(hào)除聲壓信號(hào)外還涉及更多的粒子位移信號(hào)[21]。因此， 低頻聲音信號(hào)誘發(fā)的聽覺腦干電位波形表現(xiàn)出非典型的AEP特征。AEP反應(yīng)的另一特征是其反應(yīng)頻率接近刺激頻率的二倍，這與聽覺毛細(xì)胞成對(duì)排列有關(guān)[22]。然而， 在金魚的聽覺研究中也發(fā)現(xiàn)， 當(dāng)聲音刺激高于2000 Hz時(shí)， 這一規(guī)律并不是很顯著， 其AEP的反應(yīng)頻率則小于刺激頻率的二倍值[17]， 其中的機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

圖 2 不同頻率刺激聲音的誘發(fā)的褐菖鲉AEP波形Fig. 2 AEP wave forms of marbled rockfish in response to tone bursts with different frequencies

目前， 對(duì)鲉科魚類聽覺閾值的研究較少。Lee等[9]通過行為馴化條件反射的心電記錄對(duì)褐菖鲉的聽覺閾值進(jìn)行了研究， 其行為聽力曲線與聽覺誘發(fā)電位法所得到的褐菖鲉聽力曲線基本相似。行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明， 褐菖鲉其敏感的頻率范圍為80—300 Hz， 其中對(duì)100 Hz聲音最為敏感， 對(duì)應(yīng)的聽覺閾值為90 dB。對(duì)300 Hz以上聲音敏感性較差，閾值已達(dá)120 dB以上(圖 4， ECG)。而AEP實(shí)驗(yàn)中，褐菖鲉的敏感頻率范圍為100—300 Hz， 其中150 Hz為最敏感頻率， 對(duì)應(yīng)閾值為70 dB， 比行為聽覺閾值低20 dB。Kojima等[23]利用行為學(xué)和AEP方法對(duì)真鯛(Pagrus major)的聽覺閾值進(jìn)行了對(duì)比研究， 結(jié)果表明， 兩種方法得到的聽力曲線形狀相同， 但行為學(xué)聽覺閾值卻比AEP聽覺閾值高15 dB左右。同樣，對(duì)聽覺普通型魚類眼斑星麗魚(Astronotus ocellatus)的比較研究表明， 行為聽覺閾值比AEP聽覺閾值要高10 dB以上[13]。雖然， 不同實(shí)驗(yàn)室在不同條件下所得的聽覺閾值存在差異， 但是不同方法所體現(xiàn)的頻率敏感性卻基本相近。根據(jù)行為學(xué)和AEP實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖 4)， 可知褐菖鲉對(duì)低頻聲音信號(hào)敏感， 對(duì)500 Hz以上的聲音敏感性較差。

褐菖鲉可通過魚鰾肌收縮發(fā)出主頻為(172±2.5) Hz左右的低頻信號(hào)， 用于種間的聲訊交流[7，24]。AEP實(shí)驗(yàn)表明褐菖鲉聽覺敏感性在100—300 Hz，這種發(fā)聲頻率與聽覺敏感性的高度匹配性， 表明了其感覺系統(tǒng)協(xié)同進(jìn)化的適應(yīng)性[25]。然而， 由于海洋航運(yùn)和水下工程使海洋中的低頻噪聲污染日益嚴(yán)重， 如海上風(fēng)電場(chǎng)運(yùn)營(yíng)期的水下噪聲主要頻率為125 Hz[26]， 而船舶馬達(dá)聲的水下噪聲也以低頻為主，聲壓級(jí)可高達(dá)150 dB以上[27，28]。這樣， 水下噪聲污染則可能對(duì)褐菖鲉的聲訊交流造成影響。因此， 亟需開展海洋中近岸人為噪聲對(duì)褐菖鲉個(gè)體或群體行為影響的相關(guān)研究， 以保護(hù)褐菖鲉的野生資源進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)該資源的持續(xù)利用。

圖 3 150 Hz刺激聲音(A)和褐菖鲉AEP波形(B)的頻譜Fig. 3 The FFT of (A) 150 Hz sound stimulus and (B) AEP wave form of marbled rockfish

圖 4 褐菖鲉聽力曲線比較Fig. 4 Audiograms of the S. marmoratus from methods AEP and electrocardiogram (ECG)， respectively[9]

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