艾 鳳 王連生 李晉南 王常安 趙志剛 羅 亮 都 雪 徐奇友

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院， 上海 201306； 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所， 哈爾濱 150070)

飼料中磷來源于動物、植物和礦物質(zhì)添加劑(無機磷)。動物性原料價格偏高， 而植物中的磷大多以植酸磷的形式存在， 不易于消化吸收。養(yǎng)殖水體中磷含量少， 不能滿足魚類生長需求[1]。飼料磷是魚類生長免疫[2]、骨骼發(fā)育[3]和保持體內(nèi)代謝平衡[4]所必需的營養(yǎng)元素。大量研究表明: 適宜磷可促進黑線鱈(Melanogrammus aeglefinusL.)[5]、黑鯛(Sparus macrocephalus)[6]、花鱸(Lateolabrax japo)[7]、鯉(Cyprinus carpio)[8]等水生動物的生長。磷缺乏則導(dǎo)致飼料效率降低、生長速度下降，骨骼微量元素減少[1]。此外， 缺磷直接影響維生素D介導(dǎo)的免疫反應(yīng)以及魚類易患厭食癥， 降低生長，體脂含量增加， 降低魚肉品質(zhì)[9]。因此， 在飼料中添加無機磷以滿足魚類生長需求， 但添加過量的磷通過水產(chǎn)動物排泄進入水中導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化。

研究表明， 低磷可促進腸道及腎臟鈉磷轉(zhuǎn)運載體蛋白的表達[10]， 其決定了日糧磷在腎臟中的吸收速度， 提高磷利用率， 降低磷排泄[11]。α-酮戊二酸(α-ketoglutarate， AKG)是谷氨酰胺前體物質(zhì)， 具有水中良好穩(wěn)定性、無毒性的特性， 可促進細胞生長及機體氨基酸循環(huán)。AKG經(jīng)多種機制參與細胞生長: (1)AKG是三羧酸循環(huán)循環(huán)的中間體， 提供細胞所需要的能量[12]； (2)AKG加成作用是通過G蛋白偶聯(lián)型受體， 增強細胞的新陳代謝信號， 因而促進細胞增殖[13]； (3)AKG能夠作用于由細胞釋放氨的清除劑， 以盡量減少細胞有毒的氨的積累[14]。此外，動物的研究表明， AKG的研究已經(jīng)顯露出其對骨骼發(fā)育和穩(wěn)態(tài)維持的積極影響[15－17]。AKG， 抗壞血酸和Fe2+通過脯氨酸水解酶將肽結(jié)合的脯氨酸羥基化轉(zhuǎn)為羥脯氨酸， 增加了前膠原轉(zhuǎn)化為膠原和骨基質(zhì)的形成[18]。AKG可促進肋骨重量和長度， 且誘導(dǎo)骨礦物質(zhì)密度增加及促進骨機械性能[19]。醫(yī)學(xué)上研究， 超重和肥胖的絕經(jīng)后婦女， 酮戊二酸和性類固醇促進骨礦物質(zhì)密度和骨轉(zhuǎn)換[20]。根據(jù)目前對AKG及其代謝產(chǎn)物和周圍神經(jīng)系統(tǒng)功能的了解， 已證實在靜脈肝細胞中， AKG還原氨化合成谷氨酸，并由骨組織中神經(jīng)纖維釋放谷氨酸[21]。通過較高的谷氨酸合成及其作為骨代謝調(diào)節(jié)中的神經(jīng)信號分子可以誘導(dǎo)改善骨質(zhì)量[22]。AKG在機體骨骼發(fā)育和礦物質(zhì)沉積等生理過程中有重要作用， AKG促進動物機體鈣磷沉積， 已達到降低糞尿中磷含量的效果[23]， 表明AKG可以有效改善鈣磷代謝。綜上所述， 關(guān)于AKG促進細胞生長和骨骼發(fā)育的研究很多， 對于磷吸收代謝的研究未見報導(dǎo)。松浦鏡鯉是黑龍江水產(chǎn)研究所在德國鏡鯉選育系(F4)的基礎(chǔ)上選育的新品種， 具有生長速度快、養(yǎng)殖成活率高、肉質(zhì)鮮嫩等優(yōu)點。因此， 本試驗通過低磷飼料中添加AKG對松浦鏡鯉生長性能、血清生化指標(biāo)和體成分的影響， 探討AKG與磷利用之間的聯(lián)系， 以期提高磷利用為解決當(dāng)前生產(chǎn)與環(huán)境問題提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及飼料的制備

AKG: 購自Sigma-Aldrich公司， 白色粉末， 純度≥98.5%。飼料蛋白質(zhì)源以進口魚粉， 豆粕為主，用羥甲基纖維素鈉黏合， 以2%和1%磷酸二氫鈉為添加磷源， 根據(jù)鯉魚營養(yǎng)需求配制基礎(chǔ)飼料: 分別為含有效磷0.73%的正常磷飼料和含有效磷0.47%不同濃度AKG (0、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%， 干物質(zhì)含量)的低磷飼料， 用葡萄糖替代不同水平AKG， 配置7種試驗飼料， 其組成及營養(yǎng)水平見表 1。飼料原料經(jīng)過80目篩， 逐級混均后， 加入一定量的水分充分混合， 用小型顆粒機擠壓成顆粒飼料(顆粒直徑為2.0 mm)， 常溫風(fēng)干后， –20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

松浦鏡鯉幼魚購自黑龍江水產(chǎn)研究所呼蘭試驗站， 養(yǎng)殖在可控溫水循環(huán)系統(tǒng)中， 水溫(23±1)℃左右， 溶氧＞6 mg/L， 氨氮＜0.02 mg/L， pH控制在7±0.5。試驗前將松浦鏡鯉經(jīng)3%鹽水消毒后在暫養(yǎng)池馴養(yǎng)2周， 每日飽食投喂4次。投食1h候后， 用虹吸管收集成型糞便， 65℃恒溫干燥箱烘干， –20℃冰箱保存， 用于總磷表觀消化率的測定。

樣品采集與處理采樣均在養(yǎng)殖實驗結(jié)束停食24h后。統(tǒng)計每重復(fù)魚總數(shù)， 總重， 然后每組取4尾魚， 于–20℃冰箱保存用于體成分分析， 另外從每組中取出6尾魚用濃度為100 mg/L的MS-222(化學(xué)名稱: 間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽)麻醉， 稱重、量體長后尾靜脈采血， 用于血清生化指標(biāo)的測定。取內(nèi)臟團稱重分離出前中后腸， 至于波恩氏液中，浸泡48h后進行包埋。再取其脊椎骨并徹底清除附著的肌肉組織后置于–20℃冰箱冷凍保存待用或立即使用， 用去離子水洗凈， 恒溫箱中60℃烘干充分磨碎后， 分別采用分光光度法(GB/T9695.4—2009)和采用EDTA絡(luò)合滴定法(GB/T6436—2002)測定骨鈣磷含量[25]。將血清保存于冰盒里送黑龍江省電力醫(yī)院采用全自動生化分析儀(貝克曼ProCX4， 德國)進行血清生化分析。血清生化分析指標(biāo)包括:磷、鈣、堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)。計算出各組試驗魚的WGR、FCR、SGR、PER、VSI、CF、鈣磷沉積率、磷表觀消化率， 計算公式如下:

增重率(WGR/%)=(末均重–初均重)/初均重×100；

蛋白質(zhì)效率(PER/%)=(總末重+總死魚重–總初重)/(總投飼量×飼料蛋白質(zhì)含量)×100；

特定生長率(SGR， %/d)=[ln(末均重)–ln(初均重)]×100/天；

臟體比(VSI/%)= 100×內(nèi)臟重/體重；

肥滿度(CF， g/cm)=100×體重/體長3；

成活率(SR/%)=成活數(shù)/總數(shù)×100；

餌料系數(shù)(FCR)=總投飼量/(總末重+總死魚重–總初重)；

磷沉積率(%)=[(結(jié)束時體磷–開始時體磷)/攝入磷量]×100；

鈣沉積率(%)=[(結(jié)束時體鈣–開始時體鈣)/攝入鈣量]×100；

磷表觀消化率(%)=[1–(飼料指示劑含量×糞便磷含量/糞便指示劑含量×飼料磷含量)]×100

測定方法飼料和體成分測定分別采用105℃烘箱干燥恒重法(GB/T5009.3—2003)和550℃高溫灼燒法(GB/T5009.4—2003)測定水分和粗灰分； 采用凱氏定氮法(GB/T5009.5—2003)測定粗蛋白質(zhì)含量； 采用索氏抽提法(GB/T5009.6—2003)測定粗脂肪含量。采用酸消化法測定飼料和糞便中三氧化二鉻(Cr2O3)(SC/T 1089-2006)含量。

表 1 試驗配方及營養(yǎng)組成(干物質(zhì)基礎(chǔ))Tab. 1 Formulation and nutritional of experimental diet (DM basis)

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗以不同水平AKG為影響因素， 采用SPSS-19.0軟件進行單因素方差分析和Duncan氏法多重比較， 統(tǒng)計數(shù)據(jù)， 顯著水平P=0.05。試驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 低磷飼料中添加AKG對松浦鏡鯉生長性能的影響

與正常磷組相比， 低磷組FCR顯著升高(P＜0.05)，WGR、SGR、PER、VSI及CF差異沒有達到顯著水平； 低磷組添加0.4%、0.8%、1.2%、1.6%及2.0%AKG組WGR、FCR、SGR、PER、VSI及CF差異都沒有達到顯著水平。與低磷組相比， 添加0.4%、0.8% AKG顯著降低FCR(P＜0.05)(表 2)。飼料總磷表觀消化率隨AKG濃度的升高， 先升高后降低， 差異不顯著(P＞0.05)(圖 1)。

2.2 低磷飼料中添加AKG對松浦鏡鯉形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

與正常磷組相比， 低磷組前腸、中腸和后腸絨毛寬度、基層厚度均顯著降低(P＜0.05)， 與低磷組相比， 添加1.2% AKG前腸、中腸絨毛長度、寬度及基層厚度均顯著增加(P＜0.05)(表 3)

2.3 低磷飼料中添加AKG對松浦鏡鯉體成分的影響

相比于正常磷組， 低磷組的粗灰分含量、骨鈣含量和鈣磷沉積率顯著降低(P＜0.05)(表 4)。與低磷組比較， 添加AKG鈣沉積率無顯著影響(P＞0.05)，而魚體磷含量、磷沉積率顯著增加(P＜0.05)， 0.4%AKG組， 骨鈣含量顯著增加(P＜0.05)， 0.8%AKG組，骨磷含量顯著增加(P＜0.05)。

表 2 低磷水平飼料中添加AKG對松浦鏡鯉生長性能的影響Tab. 2 Effects of AKG supplementation in low-phosphorous diets on growth performance of Songpu mirror carp (%)

圖 1 低磷水平飼料中添加AKG對松浦鏡鯉總磷表觀消化率的影響Fig. 1 Effects of AKG supplementation in low-P diets on total P apparent digestibility of Songpu mirror carp

2.4 低磷飼料中添加AKG對松浦鏡鯉血清生化指標(biāo)的影響

低磷組與正常磷比， 除血清磷含量顯著降低(P＜0.05)外， 血清各項指標(biāo)無顯著差異(P＞0.05)(表5)。與正常磷組相比， 0.8%AKG組谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性及1.20%AKG組谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性顯著提高(P＜0.05)； 1.6%AKG組， 血清磷、白蛋白含量(ALB)顯著增加(P＜0.05)； 添加不同水平AKG對血清其余各項指標(biāo)無顯著影響(P＞0.05)。

3 討論

3.1 低磷飼料中添加AKG對松浦鏡鯉生長的影響

Kim等[26]研究指出， 在飼料中添加2%磷酸二氫鈣(有效磷水平0.67%)， 鏡鯉(Cyprinus carpiovar.specularis)生長性能最佳。本試驗低磷組有效磷0.47%，WGR、SGR、PER低于正常磷組，F(xiàn)CR顯著高于正常磷組。在低磷飼料中添加不同濃度AKG能一定程度上促進魚體生長， 降低飼料效率，其原因可能是AKG可促進腸道生長、發(fā)育和在健康、病理條件下作為主要能源和結(jié)構(gòu)組成發(fā)揮功能。已研究日糧補充1%的AKG增加疑似內(nèi)毒素仔豬腸黏膜蛋白質(zhì)的合成和減輕黏膜損傷， 并增加小腸的吸收功能[27，28]。此外， AKG可增強ATP的供給，并刺激腺苷酸活化蛋白激酶的磷酸化和能量底物(例如葡萄糖、氨基酸、脂肪酸)在腸黏膜的氧化，支持腸細胞的功能[29]。李晉南等[30]研究表明， 日糧中添加1.5%的AKG可以促進松浦鏡鯉腸道發(fā)育， 增強腸道消化酶活性。本試驗?zāi)c道顯微結(jié)構(gòu)結(jié)果表明， 低磷中添加AKG可有效促進腸道發(fā)育， 與上述結(jié)論一致。本實驗中AKG最高添加量未促生長作用， 其原因可能是AKG的積累限制谷氨酰胺分解降低細胞增殖[21]。

3.2 低磷飼料中添加AKG對松浦鏡鯉體成分的影響

熊文等[9]概述， 缺磷導(dǎo)致魚體粗灰分含量、磷含量降低， 脂含量增加， 并以鈣的流失為特征。楊原志等[31]研究得出， 不同磷水平對軍曹魚(Rachycentron canadumLinnaeus)幼魚水分、粗蛋白、粗脂肪含量無顯著影響， 而魚體磷含量在磷水平為0.61%時， 顯著低于0.76%處理組。位瑩瑩等[32]在蛋白水平34%條件下， 添加不同濃度AKG對松浦鏡鯉魚體粗蛋白含量無顯著差異。本試驗低磷組， 水分、粗蛋白和粗脂肪含量無顯著變化， 粗灰分、鈣磷沉積率顯著降低， 與上述研究結(jié)論一致。低磷飼料中全魚脂肪含量有所提高， 隨著AKG水平的升高， 全魚體脂呈下降趨勢， 可能與AKG促進腸道脂肪酶活性有關(guān)。魏玉強[33]等研究表明飼料添加AKG可顯著降低松浦鏡鯉肌肉粗脂肪含量。

表 3 低磷水平飼料中添加AKG對松浦鏡鯉腸道形態(tài)的影響Tab. 3 Effects of AKG supplementation in low-phosphorous diets on intestinal morphology of Songpu mirror carp (μm)

表 4 低磷水平飼料中添加AKG對松浦鏡鯉體成分的影響(干重基礎(chǔ))Tab. 4 Effects of AKG supplementation in low-phosphorous diets on body composition of Songpu mirror carp (Dry weight basis)

鈣和磷是骨生長和代謝中發(fā)揮重要作用的礦物元素[34]。本試驗低磷添加0.4%—0.8%AKG組，磷沉積與脊椎骨磷含量指標(biāo)與正常磷組相一致， 原因在于添加適宜水平AKG對骨骼礦物質(zhì)沉積有積極的影響。研究證實， AKG對骨代謝的調(diào)控作用，Harrison等[35]AKG對仔豬(0.4 g/kg體重)和新生羊(0.1 g/kg體重)骨骼系統(tǒng)如骨形態(tài)、骨密度和機械性能的發(fā)育有促進作用。Andersen等[36]在出生21—24d的仔豬飼糧中添加0.1%AKG， 其股骨礦物質(zhì)密度顯著增加。而本試驗低磷飼料的基礎(chǔ)上添加AKG， 0.4%AKG組骨鈣含量顯著提高， 0.8%AKG組骨磷含量、磷沉積率均顯著提高。由此可見，AKG可有效地改善磷代謝。然而， AKG如何調(diào)控骨骼礦物質(zhì)沉積的機制目前國內(nèi)外鮮少報道。

表 5 低磷水平飼料中添加AKG對松浦鏡鯉血清生化指標(biāo)的影響Tab. 5 Effects of AKG supplementation in low-phosphorous diets on serum biochemical indices of Songpu mirror carp

3.3 低磷飼料中添加AKG對松浦鏡鯉血清生化指標(biāo)的影響

血清Ca、P及ALP活性是反映機體鈣磷代謝的重要指標(biāo)。長時間采食低磷日糧血清磷降低， 較低的磷會引起血清離子鈣的含量升高， 而刺激甲狀旁腺的分泌， 減少腎臟中磷的排泄。血清中的ALP大部分由成骨細胞產(chǎn)生， 排泄經(jīng)肝膽系統(tǒng)進行。本試驗高濃度AKG組血清磷水平升高， 可能因為添加AKG總磷表觀消化率逐漸升高， 磷消化率提高促進磷的吸收。磷含量增加， ALP活性增強， 促進磷代謝[37]。在本試驗條件下， 添加0.8%和1.2%水平AKG， 血清磷濃度、ALP活性均增加， 說明添加AKG可以促進磷代謝作用。

血清ALB和GLB與機體的免疫功能關(guān)系密切，具有多種生理功能， 如運輸多種代謝物， 調(diào)節(jié)被運輸物質(zhì)， 維持酸堿度和血管內(nèi)正常膠體滲透壓等。血清TP水平反映肝臟合成功能和腎臟病變造成蛋白質(zhì)丟失的重要指標(biāo)， TP檢測可間接了解機體的營養(yǎng)狀況。本試驗條件下， 添加1.6%AKG顯著提高TP含量和ALB含量， 說明添加AKG可以促進蛋白質(zhì)的合成。

動物體內(nèi)最主要的2個轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST， 主要反映蛋白質(zhì)代謝利用率， 并在氨基酸代謝方面發(fā)揮重要作用。當(dāng)飼料中蛋白質(zhì)水平升高時， 氨基酸代謝強度增加， 從而造成轉(zhuǎn)氨酶活性升高[38]。在本試驗中， 與低磷組比， 添加0.8%AKG顯著提高AST活性， 添加1.2%AKG顯著提高ALT活性， 表明添加AKG有利于促進松浦鏡鯉肝胰臟氨基酸代謝，提高蛋白質(zhì)利用率。

4 結(jié)論

低磷飼料中添加適量的AKG可以在一定程度上促進松浦鏡鯉的生長， 降低飼料系數(shù)， 增加魚體磷和脊椎骨鈣磷含量。過高的AKG添加量不利于生長， 降低脊椎骨鈣磷含量。

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