王雅文 喬 芳 張美玲 賈永義 杜震宇

(1. 浙江省淡水水產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點實驗室， 浙江省魚類健康與營養(yǎng)重點實驗室， 湖州 313001；2. 華東師范大學生命科學學院， 水生動物營養(yǎng)與環(huán)境健康實驗室， 上海 200241)

高脂飼料雖然在一定程度上可以起到促進魚體增長， 節(jié)約蛋白的作用， 但也帶來了魚體脂肪堆積， 免疫力下降[1]等問題， 嚴重制約了水產(chǎn)養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展[2]。因此， 研究魚類的脂代謝過程， 改善養(yǎng)殖魚的脂肪沉積情況， 已成為當前魚類營養(yǎng)生理學研究的熱點。眾所周知， 脂肪組織沉積主要是由于脂肪細胞增生(增殖)和脂肪細胞肥大(分化)造成的[3]。因而， 脂肪細胞體外培養(yǎng)技術(shù)的建立對于魚類脂代謝研究具有重要的意義。與哺乳動物相比，魚類細胞體外培養(yǎng)的研究工作起步較晚。魚類脂肪細胞體外培養(yǎng)更是近幾年才展開。迄今為止， 國外主要進行了虹鱒(Oncorhynchus mykiss)[4]、大黃魚(Larimichthys crocea)[5]和真鯛(Pagrosomus ma-jor)[6，7]等脂肪細胞培養(yǎng)的研究， 國內(nèi)主要是吉紅等[8]于2009年建立了草魚脂肪細胞體外培養(yǎng)模型。

脂肪酸對脂肪細胞增殖分化的影響主要集中在哺乳動物上。研究人員發(fā)現(xiàn)DHA可以促進人體脂肪細胞中甘油的釋放； 而3T3-L1的脂代謝又受到EPA的調(diào)控。Azain等[9]的研究表明， 共軛亞油酸可以對小鼠脂肪細胞起到促進增殖， 抑制分化的作用。相比較來說， 脂肪酸對魚類脂肪細胞增殖與分化影響的研究相對較少。目前已見報道的是， n-3系不飽和脂肪酸可以調(diào)控草魚脂肪細胞脂解， 并且這一過程與脂解相關(guān)基因和炎癥基因的表達有關(guān)[10]。而脂肪酸對羅非魚(Oreochromis niloticus)脂肪細胞增殖和分化影響的研究尚未見報道。

本文首次建立了羅非魚脂肪細胞體外培養(yǎng)模型， 為研究羅非魚脂代謝提供了新的技術(shù)和方法。在脂肪細胞增殖和分化過程中， 分別加入100 μmol/L的棕櫚酸(PA)、油酸(OA)、亞油酸(LA)和亞麻酸(LNA)， 分析比較外源性脂肪酸對羅非魚脂肪細胞增殖和分化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

儀器與試劑儀器: 酶標儀(BIO-TEK)， 普通PCR儀(My-Cycler， BIO-RAK)， qPCR儀(CFX Connect， BIO-RAD)， 微量紫外分光光度計(Thermo Nanodrop 2000)， 全自動樣品快速研磨儀(上海凈信科技有限公司)， 冷動離心機(Eppendorf centrifuge 5415R)， SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(蘇州凈化設備有限公司)， 熒光倒置顯微鏡(日本Nikon)。

主要試劑: DMEM/F12， 100×雙抗母液(10000 U/mL青霉素和10000 μg/mL鏈霉素)， 1 mg/mL胰島素，胎牛血清(FBS): 美國Gibco公司； 牛血清白蛋白(BSA)， Ⅱ型膠原酶， Krebs-Henseleit， 二甲基亞砜(DMSO)， 棕櫚酸(PA)， 油酸(OA)， 亞油酸(LA)， α-亞麻酸(LNA): 美國Sigma公司； 吲哚美辛(Indomethacin)， 地塞米松(Dexamethasone)， 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-Isobutyl-1-methylxanthine)， 油紅O干粉， 異丙醇， 甲醛: 大連美倫生物技術(shù)有限公司。

實驗材料實驗所用的羅非魚購自上海市閔行區(qū)滄源水產(chǎn)市場， 體重約700—900 g。選擇體質(zhì)健壯， 游動活潑， 腹部飽滿的羅非魚作為實驗魚。

主要試劑的配制(1)脂肪酸配制: 4種脂肪酸用無水乙醇稀釋配制成100 mmol/L的母液， 并于–20℃保存?zhèn)溆谩?2)消化液: 稱取50 mg Ⅱ型膠原酶， 加入0.5 g牛血清白蛋白融入50 mL不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中。(3)誘導劑配制: 吲哚美辛:稱取一定量吲哚美辛溶于DMSO致終濃度為0.2 mmol/L， –20℃保存?zhèn)溆?。地塞米? 稱取一定量地塞米松溶于DMSO致終濃度為1 mmol/L， –20℃保存?zhèn)溆谩?-異丁基-1-甲基黃嘌呤: 稱取一定量3-異丁基-1-甲基黃嘌呤溶于DMSO致終濃度為0.5 mmol/L，–20℃保存?zhèn)溆谩?4)誘導培養(yǎng)基成分: 誘導培養(yǎng)基1: 用15%FBS-DMEM/F12培養(yǎng)基配制終濃度為15 μg/mL胰島素、0.2 μmol/L吲哚美辛、1 μmol/L地塞米松以及0.5 μmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤的誘導培養(yǎng)； 誘導培養(yǎng)基2: 用15%FBS-DMEM/F12培養(yǎng)基配制終濃度為15 μg/mL胰島素的誘導培養(yǎng)基；誘導培養(yǎng)基3: 15%FBS-DMEM/F12培養(yǎng)基。(5)油紅O: 稱取0.5 g油紅O粉末溶于100 mL異丙醇中配成5 g/L的母液， 置于4℃避光長期保存， 用時以母液與水體積比為3∶2稀釋過濾后為工作液備用。

1.2 方法

羅非魚脂肪細胞體外培養(yǎng)及分化模型的建立

無菌分離出羅非魚腹腔脂肪組織， 于Krebs-Henseleit緩沖液(1% BSA)中剪碎并加入消化液，28℃水浴震蕩消化1.5h。分離除去結(jié)締組織， 1000 r/min離心5—10min， 棄上清。用DMEM/F12緩沖液(1% BSA， pH 7.4)， 洗3遍。裂解去除紅細胞之后，加入15%FBS-DMEM/F12培養(yǎng)基重懸剩余的細胞，并接種到細胞板中， 密度為(2—3)×105個/mL， 28℃，在5%CO2條件下培養(yǎng)7d細胞即可長至匯合階段， 更換誘導培養(yǎng)基， 進行誘導分化。在誘導過程中， 先用誘導培養(yǎng)基1培養(yǎng)4d (第4天)； 之后更換誘導培養(yǎng)基2繼續(xù)培養(yǎng)4d (第8天)； 最后更換誘導培養(yǎng)基3培養(yǎng)4d (第12天)， 分化結(jié)束。誘導期間每2天換1次液。

脂肪酸對前脂肪細胞增殖的影響將前脂肪細胞(2—3)×105個/mL培養(yǎng)在96孔板中， 添加100 μmol/L的PA、OA、LA、LNA檢測脂肪酸對細胞增殖的影響。同時在增殖培養(yǎng)基中添加1%BSA以保護細胞。對照組添加等體積的無水乙醇與等質(zhì)量的BSA。在培養(yǎng)的第2、第4、第6、第8天， 借助SRB方法檢測細胞增殖情況。具體方法為， 用50% (v/v) TCA (三氯乙酸)固定細胞。加入0.4% (w/v) SRB溶液對細胞中的蛋白進行染色。之后加入100 μL的10 mmol/L Tris溶解細胞中的染料。讀取515 nm處的吸光度值(Optical Density)。每個處理4個重復， 實驗重復3次； 通過SRB實驗確定對脂肪細胞的增殖影響后， qPCR檢測脂代謝及增殖相關(guān)基因的表達。

脂肪酸對前脂肪細胞分化的影響將前脂肪細胞(2—3)×105個/mL培養(yǎng)在48孔板中， 培養(yǎng)1周后進行誘導分化: 分別添加100 μmol/L的PA、OA、LA、LNA作用12d (第0至第12天)， 每次換液均補充等量脂肪酸。分化結(jié)束用油紅O染色檢測羅非魚脂肪細胞分化情況， 用Image Pro Plus6.0(IPP 6.0)測量胞內(nèi)脂滴的數(shù)量和面積。qPCR檢測分化過程中脂代謝基因的表達水平。

油紅O染色用4%的甲醛固定細胞， 60%異丙醇(v/v)潤洗并晾干。加入油紅O染料靜置10min，棄去油紅O， 充分用清洗殘余的染料。晾干， 加入200 μL的超純水， 最后將細胞于顯微下觀察染色情況并拍照。

為了對以上的染色結(jié)果進行定量分析， 拍照后將細胞晾干， 加入100%異丙醇溶解油紅O染料，500 nm處用100%異丙醇調(diào)零檢測吸光度值。

Real-time qPCR 操作方法將前脂肪細胞(5—6)×105個/mL培養(yǎng)在6孔板中， 培養(yǎng)1周后進行誘導分化， 每次換液均補充等量脂肪酸。分化結(jié)束收后收集細胞， 使用Trizol法提取總RNA， 微量紫外分光光度計檢測RNA純度后， 保存在–80℃中。使用Prime Script RT Reagent Kit (Takara)試劑盒反轉(zhuǎn)得到cDNA， 具體方法參考說明書。在NCBI上查找相應基因序列， 用primer 5.0設計引物， 由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司合成引物。引物設計如表 1所示。根據(jù)試劑盒說明書進行Real-time qPCR， 以βactin為內(nèi)參。

采用公式處理qPCR結(jié)果: 目的基因mRNA相對表達量=2–ΔΔCt， 其中ΔΔCt=[Ct(目的基因)–Ct(βactin)]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗結(jié)果用平均值±標準差(Mean±SD)(n=3)來表示。使用SPSS19.0對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(one-way ANOVA)用于揭示不同脂肪酸處理對細胞影響的差異， 字母(a、b、c)表示不同脂肪酸處理組之間存在顯著性差異(P＜0.05)。Studentttest用于檢測脂肪酸處理組與對照組之間的差異， * 表示脂肪酸處理組與對照組之間存在顯著性差異(P＜0.05)。

2 結(jié)果

2.1 羅非魚腹腔脂肪細胞的增殖及分化過程中的形態(tài)學觀察

如圖 1所示， 剛接種貼壁的羅非魚前脂肪細胞呈現(xiàn)透明圓形， 胞內(nèi)無明顯脂滴， 均勻分散在細胞板底部， 具有增殖和分化功能。中性脂肪細胞中脂滴明顯， 無增殖功能， 在培養(yǎng)過程中， 會因通過裂解而分離出去(圖 1A)。前脂肪細胞增殖培養(yǎng)3d， 形態(tài)發(fā)生變化并呈現(xiàn)梭形， 占據(jù)細胞板底一半的面積(圖 1B)。培養(yǎng)7d后， 細胞邊緣模糊， 增殖的脂肪細胞鋪滿整個細胞板底， 中性脂肪細胞大量減少(圖1C)。對細胞進行誘導分化， 12d后誘導結(jié)束， 進行油紅O染色， 對細胞內(nèi)的脂滴進行染色觀察。鏡下可見胞內(nèi)被染為紅色的清晰脂滴(圖 1D)。

2.2 不同脂肪酸對羅非魚脂肪細胞增殖水平的影響

本實驗采用SRB染色法檢測外源性脂肪酸對羅非魚脂肪細胞增殖的影響。如圖 2所示， 4種脂肪酸在實驗濃度條件下(100 μmol/L)對脂肪細胞的增殖起到不同程度的影響。由于在培養(yǎng)1周之后細胞數(shù)量處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)， 所以我們檢測脂肪酸處理8d后細胞的增殖情況， 結(jié)果表明， 不飽和脂肪酸(OA、LA、LNA)對脂肪細胞的促增殖作用較為顯著， 飽和脂肪酸(PA)的促增殖能力較低。其中100 μmol/L的LNA對脂肪細胞的增殖效果最為明顯。

表 1 羅非魚脂肪細胞增殖分化相關(guān)基因表達所用引物Tab. 1 Primers used in quantitative PCR

圖 1 脂肪細胞增殖及分化過程中的形態(tài)變化Fig. 1 Morphology of preadipocyte and differentiated adipocytes

2.3 不同脂肪酸對脂肪細胞增殖和脂代謝相關(guān)基因表達的影響

如圖 3所示， 培養(yǎng)8d后， 細胞增殖相關(guān)基因，cmyc和c-fos的表達顯著性增高(P＜0.05)， 即細胞處于增殖活躍狀態(tài)， 并且不飽和脂肪酸如油酸， 亞油酸和亞麻酸對前脂肪細胞的促增殖作用優(yōu)于棕櫚酸；脂合成相關(guān)基因PPARγ和CD36的表達上調(diào)； 而脂肪酸合成基因FAS的表達下調(diào)， 且下調(diào)幅度隨著脂肪酸不飽和程度的上升而增大； 值得注意的是， 脂解相關(guān)基因ATGL的表達顯著上升(P＜0.05)， 同時，CPT-1a的表達也出現(xiàn)上調(diào)的趨勢。

2.4 脂肪酸對脂肪細胞分化的影響

油紅O染色檢測羅非魚前脂肪細胞分化情況。如圖 4所示， 脂肪酸對脂肪細胞分化存在抑制作用，且飽和脂肪酸(PA)的抑制作用最強。

為了進一步分析脂肪酸抑制脂肪細胞分化的機制， 我們采用軟件IPP 6.0對脂肪細胞中的脂滴面積、數(shù)量及面積進行定量計算。如圖 5A、B， 加入外源性脂肪酸， 細胞中的脂滴面積有下降趨勢， 而數(shù)量出現(xiàn)上升的趨勢。另外， 將細胞內(nèi)的單個脂滴的直徑和面積進行比較， 我們發(fā)現(xiàn)脂肪酸處理組的細胞中脂滴的平均直徑和面積均有下降的趨勢， 而棕櫚酸處理對細胞分化的抑制效果更加顯著(圖5C、D)。

圖 2 脂肪酸對脂肪細胞增殖的影響Fig. 2 Effects of fatty acids on adipocytes proliferation

圖 3 脂肪細胞增殖過程中基因表達水平Fig. 3 Gene expression in the process of adipocyte proliferation

圖 4 脂肪酸對脂肪細胞分化的影響Fig. 4 Effects of fatty acids on adipocytes differentiation

2.5 脂肪酸對脂肪細胞分化相關(guān)基因表達的影響

采用qPCR檢測分化過程中相關(guān)基因表達。如圖 6所示， 加入棕櫚酸后，CPT-1a(P＜0.05)和CPT-1b等β氧化相關(guān)基因的表達出現(xiàn)上調(diào)的趨勢； 脂解相關(guān)基因ATGL顯著下降； 而脂合成相關(guān)基因(FAS)的表達也出現(xiàn)下調(diào)的趨勢。

3 討論

3.1 羅非魚脂肪細胞體外培養(yǎng)模型的建立

影響脂肪細胞增殖分化效果的因素主要包括提取方法， 培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)及誘導時間。不同物種脂肪細胞的提取及培養(yǎng)條件各不相同。以哺乳動物為例， 人和牛脂肪細胞的消化時間通常為1.5h[12，13]， 而豬脂肪細胞則通常為1h[14]； 在魚類中，草魚脂肪細胞的消化時間是50min[8]， 大黃魚脂肪細胞消化時間為1h[5]。本文羅非魚脂肪細胞消化時間為1.5h。在培養(yǎng)基方面， 吉紅等[8]在草魚前脂肪細胞培養(yǎng)中， 使用含20% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基對脂肪細胞進行培養(yǎng)和誘導， 本文采用含15% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基， 而哺乳動物脂肪細胞培養(yǎng)基大多使用含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基。在細胞培養(yǎng)溫度方面， 哺乳動物大多為37℃， 大西洋鮭的脂肪細胞通常培養(yǎng)在13℃中[15]， 而虹鱒脂肪細胞為18℃[16]， 草魚脂肪細胞為28℃[8]， 大黃魚脂肪細胞也是28℃[5]。本文的羅非魚脂肪細胞培養(yǎng)于28℃。因此本文在前人的基礎上進一步摸索， 成功的構(gòu)建了羅非魚脂肪細胞體外培養(yǎng)模型。

圖 5 脂肪酸對脂肪細胞脂滴形成的影響Fig. 5 Effects of fatty acids on lipid droplet formation in adipocyte

圖 6 脂肪細胞分化過程中基因表達Fig. 6 Gene expression in the process of adipocyte differentiation

3.2 脂肪酸對羅非魚脂肪細胞增殖分化的影響

在建立羅非魚脂肪細胞體外培養(yǎng)模型的基礎上， 本文探討不同脂肪酸對脂肪細胞增殖分化的影響。SRB染色實驗證實， 脂肪酸可以促進脂肪細胞增殖， 且促增殖作用隨著脂肪酸的不飽和程度的增加而增大。其中， 100 μmol/L的LNA的對前脂肪細胞的促增殖作用最為顯著。相關(guān)基因表達數(shù)據(jù)表明， 細胞增殖基因c-myc和c-fos的表達量在外源脂肪酸的刺激下顯著上升。孫超等[17]在哺乳動物上發(fā)現(xiàn)， 短鏈脂肪酸可以抑制3T3-L1的增殖， 長鏈脂肪酸對3T3-L1的增殖無顯著影響； 陳蓉等[18]發(fā)現(xiàn)在一定濃度范圍內(nèi)的多不飽和脂肪酸可以抑制3T3-L1的增殖。而吉紅等[19]證明不同濃度的EPA在2d內(nèi)均能顯著促進草魚前體脂肪細胞增殖， 這與本研究的結(jié)果相一致。因此， 脂肪酸對細胞增殖的影響不但與脂肪酸的種類有關(guān)， 也與細胞的來源有關(guān)，這也提示我們在魚類的營養(yǎng)學研究中， 不能完全依賴哺乳動物的細胞系。

值得注意的是， 脂肪酸對前脂肪細胞增殖過程中脂代謝影響機制的研究相對較少。目前只有Distel等[20]的研究可以證明， 脂肪酸可以提高3T3-L1在增殖過程中的脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)的表達。這表明， 前脂肪細胞在增殖過程確實存在吸收胞外脂肪酸， 在胞內(nèi)進行轉(zhuǎn)化分解的可能。而我們的研究結(jié)果表明在外源性脂肪酸刺激下， 脂合成相關(guān)基因PPARγ和CD36的表達也出現(xiàn)了上調(diào)， 脂解相關(guān)基因CPT-1和ATGL表達上調(diào)，ATGL的表達量甚至出現(xiàn)顯著性上升(P＜0.05)， 表明在增殖過程中， 脂肪細胞可以吸收環(huán)境中的脂肪酸， 用于自身代謝活動， 胞內(nèi)脂質(zhì)合成與分解都比較活躍， 有效促進細胞增殖。同時， 我們也注意到脂肪酸合成基因PPARγ與FAS表達出現(xiàn)相反趨勢， 這有可能是因為細胞可以通過吸收外源脂肪酸以維持自身代謝， 因此脂質(zhì)合成相關(guān)的過程沒有被完全啟動， 但其中的具體機制仍需進一步探討。

在探究脂肪酸對脂肪細胞分化影響的實驗中，油紅O染色結(jié)果顯示， 脂肪酸對脂肪細胞分化起抑制作用， 且飽和脂肪酸的抑制作用要強于不飽和脂肪酸。使用IPP 6.0對細胞中脂滴數(shù)量和面積進行測量， 我們發(fā)現(xiàn)脂肪酸對胞內(nèi)脂滴形成具有抑制作用。具體表現(xiàn)為加入脂肪酸處理的細胞， 脂滴的面積較小， 而數(shù)量較多。Manickam等[21]發(fā)現(xiàn)EPA可以顯著降低3T3-L1脂肪細胞中脂滴的大小及脂質(zhì)含量。這與我們的結(jié)果一致。因此， 我們認為脂肪酸抑制脂肪細胞分化， 可能是通過抑制脂滴體積的增大， 從而阻止較小脂滴融合為較大脂滴。

而定量PCR結(jié)果表明， 在細胞分化過程中添加脂肪酸， 細胞中β氧化相關(guān)基因表達水平有所上調(diào)，而脂解基因ATGL表達下調(diào)。與我們的結(jié)果類似，F(xiàn)lachs等[22]發(fā)現(xiàn)DHA和EPA可以促進小鼠白色脂肪組織中線粒體生成和β氧化的進行。吉紅等[19]發(fā)現(xiàn)EPA處理的草魚脂肪細胞分化能力下降， 且PGC-1α的表達被激活，PGC-1α的高表達可以提高細胞線粒體的增殖發(fā)育， 進而促進胞內(nèi)脂肪酸的氧化分解。這些結(jié)果表明， 羅非魚脂肪細胞分化過程中，脂肪酸通過加快胞內(nèi)β氧化的進行， 減少胞內(nèi)脂滴積累， 進而抑制細胞的分化， 但具體的信號通路還需進一步研究。

本研究建立了羅非魚脂肪細胞作為模型， 同時發(fā)現(xiàn)不同飽和度的外源性脂肪酸對于細胞的增殖和分化有不同的效應， 其中飽和脂肪酸更傾向于促進細胞分化， 而高不飽和脂肪酸則傾向于促進細胞的增殖。這也為我們解釋不同魚體對于脂質(zhì)的利用策略提供了必要的細胞學數(shù)據(jù)。

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