任詩思 齊志濤 昌鳴先

(1. 中國科學院水生生物研究所， 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防控重點實驗室， 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點實驗室， 武漢 430072；2. 中國科學院大學， 北京 100049； 3. 鹽城工學院海洋與生物工程學院， 鹽城 224051)

肽聚糖識別蛋白(Peptidoglycan recognition protein， PGRPs)是一類廣泛存在于無脊椎動物和脊椎動物中， 能特異地識別細菌細胞壁肽聚糖(Peptidoglycan， PGN)成分的高度保守的模式識別受體。PGRP最早是在家蠶的血淋巴和角質(zhì)層中被發(fā)現(xiàn)[1]。之后， 隨著黑腹果蠅(Drosophila elanogaster)、岡比亞按蚊(Anopheles gambiae)及人類基因組測序的發(fā)展， 相繼在哺乳動物和昆蟲中發(fā)現(xiàn)了PGRPs家族的眾多成員[2—4]。此后， 在其他的無脊椎動物(如軟體動物、棘皮動物)和脊椎動物(魚類、兩棲類、鳥類)中也相繼有PGRPs基因被發(fā)現(xiàn)和鑒定[5—9]。

昆蟲PGRPs家族成員根據(jù)其mRNA轉(zhuǎn)錄本的大小分為短型PGRP (PGRP-S)和長型PGRP (PGRPL)。哺乳動物的4個PGRPs成員， 最初按照mRNA轉(zhuǎn)錄本的大小命名為短型PGRP (PGRP-S)、中型PGRP (PGRP-I， 包括PGRP-Iα/PGRP-Iβ)和長型PGRP (PGRP-L)[4]， 后更名為PGLYRP-1、PGLYRP-2、PGLYRP-3、PGLYRP-4。短型PGRP(PGRP-S)， 大約含有200個氨基酸殘基， 蛋白分子量19—20 kD左右， 其含有的PGRP結(jié)構(gòu)域占據(jù)其絕大部分序列。有的中型PGRP (如哺乳動物PGLYRP-3、PGLYRP-4)或長型的PGRP (如果蠅PGRPLF)則含有2個PGRP結(jié)構(gòu)域。此外， 長型PGRP除了C端的PGRP結(jié)構(gòu)域外， 還包含一段長度可變的N端序列； 且該N端序列在PGRPs家族成員中不保守， 賦予每個PGRP獨特性和功能多樣性。PGRPs家族成員大多數(shù)為分泌蛋白(如果蠅PGRP-SA和PGRPSD、哺乳動物PGLYRP1等)， 少部分是跨膜蛋白(如果蠅PGRP-LF)和胞內(nèi)蛋白(如果蠅PGRP-LE)。

在天然免疫系統(tǒng)中， PGRPs主要作為模式識別受體、調(diào)節(jié)子和效應分子發(fā)揮作用。在不同的物種中PGRPs的功能具有一定的保守性， 但也存在著明顯的差異。昆蟲PGRPs功能主要包括激活酚氧化酶原級聯(lián)反應、激活Toll信號通路、激活IMD信號通路以及具有酰胺酶活性[5]。哺乳動物PGRPs的功能主要包括具有酰胺酶活性和直接的殺菌活性2個方面[10]。魚類作為低等脊椎動物， 進化上處于昆蟲和哺乳動物之間， 它們的PGRPs卻同時兼具酰胺酶活性和直接的殺菌活性[8]。兩棲動物在進化上介于魚類和哺乳動物之間， 目前關于兩棲類的PGRPs報道甚少。而大鯢(Andrias davidianus， 俗稱“娃娃魚”)， 作為現(xiàn)存?zhèn)€體最大的兩棲動物， 存在已有三億五千多萬年的歷史， 有“活化石”之稱， 具有極高的學術(shù)科研價值、醫(yī)用和食用等經(jīng)濟價值。近年來， 由于自然環(huán)境的破壞， 非法捕殺、走私販賣等原因， 野生大鯢資源量急劇下降； 而人工養(yǎng)殖大鯢隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大， 大鯢的各種病害也接踵而來， 其細菌性以及病毒性疾病成為大鯢產(chǎn)業(yè)發(fā)展的限制瓶頸。

我們以往的研究揭示了硬骨魚類短型的PGRPSC或者PGRP5、長型的PGRP6的選擇性剪接及其免疫功能[11—14]。本研究構(gòu)建了兩棲動物大鯢短型肽聚糖識別蛋白PGRP-S的真核表達質(zhì)粒， 并研究了其抗菌活性、PGN結(jié)合活性、酰胺酶活性以及對NF-κB啟動子活性的影響。該研究為揭示脊椎動物PGRPs在進化中的功能異同以及大鯢的免疫防治奠定了重要的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞系、細菌菌株及主要試劑

HEK293T (Human embryonic kidney cell)和遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tardaPPD130/91)由本實驗室保存并培養(yǎng)。Lys-type PGN (No.77140)或Dap-type PGN (No. 69554)購買于Sigma公司。

1.2 真核表達質(zhì)粒構(gòu)建

大鯢PGRP-S的真核表達質(zhì)粒由鹽城工學院海洋與生物工程學院的齊志濤博士克隆并提供。真核表達的上游引物為CCCAAGCTTATGGGTGA GTGCTTGTTAC； 下游引物為CGGGATCCGGGCA GCAGAGTCGGCGTTTTTTCTGTG， 下劃線部分為限制性內(nèi)切酶位點。

1.3 生物信息學分析

大鯢PGRP-S的結(jié)構(gòu)域通過NCBI網(wǎng)站CD-search (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預測； 使用SignalP 3.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測蛋白的信號肽； 多序列比對使用ClustalW1.83分析； 不同物種同源基因的相似性用MatGat2.02分析[15]； 大鯢PGRP-S和其他脊椎動物PGRPs的進化關系采用MEGA4.0軟件的鄰接法(Neighbor-Joining， NJ)構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹來分析，設置1000次bootstraps進行評估。

1.4 NF-κB活性分析

將HEK293T細胞接種24孔板(3×105/孔)， 37℃5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。將200ng的pNF-κB-Luc報告質(zhì)粒和1 ng Rellina內(nèi)參質(zhì)粒分別與不同量的p3xFLAG或PGRP-S-FLAG質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞。48h后收集并裂解細胞， 用Promega公司的Dual-Luciferase Reporter Assay System檢測樣品的熒光素酶活性。

1.5 抗菌活性分析

胞內(nèi)抗菌活性分析 將HEK293T細胞接種24孔板并培養(yǎng)過夜， 分別將p3xFLAG或PGRP-SFLAG轉(zhuǎn)染到細胞中(0.5 μg/孔)。隨后用遲緩愛德華氏菌(MOI=10)感染過表達的細胞(170×g， 離心5min； 25℃， 感染1h)， 用1×PBS輕輕洗滌細胞3次，加入100 μg/mL慶大霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基殺胞外菌1h， 隨后再更換為16 μg/mL慶大霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基。分別在感染3h和6h后用1×PBS緩沖液洗滌細胞3—5次， 再用含1%Triton-X100的PBS緩沖液裂解細胞并將細胞裂解產(chǎn)物梯度稀釋后涂布平板， 計數(shù)。

胞外抗菌活性分析 細胞種板及感染步驟同上， 不加入含有慶大霉素的DMEM培養(yǎng)基。感染3h和6h后， 分別取細胞培養(yǎng)上清梯度稀釋后涂布平板， 計數(shù)。

1.6 肽聚糖結(jié)合活性分析

將HEK293T細胞接種6孔板(1×106/孔)并培養(yǎng)過夜， 分別將pTurbo-GFP、p3xFLAG或PGRP-SFLAG轉(zhuǎn)染到細胞中(2.5 μg/孔)， 36—48h后提取細胞總蛋白。分別將40 μg不溶的Lys-type PGN或Dap-type PGN與100 μL總蛋白低溫孵育3—4h后，離心除去未結(jié)合的蛋白， 重懸洗滌4次后通過Western-blotting檢測蛋白結(jié)合情況。

1.7 酰胺酶活性分析

HEK293T細胞接種到25cm2的細胞培養(yǎng)瓶(5×106—1×107/瓶)并在培養(yǎng)過夜后， 將10 μg p3×FLAG或PGRP-S-FLAG轉(zhuǎn)染到細胞之中，36—48h后提取細胞總蛋白。分別將40 μg不溶的Lys-type PGN或Dap-type PGN與50 μg p3xFLAG或PGRP-S-FLAG總蛋白加入到Tris-ZnCl2緩沖液中(20 mmol/L Tris-HCl， 150 mmol/L NaCl， 10 μmol/L ZnCl2， pH7.2)， 室溫孵育120min， 每10min用全波長分光光度計讀取λ540的吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 大鯢PGRP-S 開放閱讀框及其編碼的氨基酸序列

大鯢PGRP-S的ORF長495bp， 編碼165個氨基酸， 在其53—161氨基酸處含有一個保守的PGRP結(jié)構(gòu)域。SignalP軟件分析， 大鯢PGRP-S的N端不含有信號肽。通過ClustalX1.8對大鯢PGRP-S和其他物種的PGRPs氨基酸序列進行同源性比較分析， 發(fā)現(xiàn)大鯢PGRP-S具有2個相距較近的半胱氨酸殘基， 而這2個半胱氨酸對于PGRP的功能和結(jié)構(gòu)完整性都是十分重要的[5，10，16]。此外， 大鯢PGRP-S具有保守的2個Zn2+結(jié)合位點(H83和Y117)。

MatGat2.0相似性比對顯示大鯢PGRP-S與其他物種的PGRPs相似性在19.1%—50.5%， 其中與非洲爪蟾PGLYRP1相似性最高， 為50.5%； 其次是熱帶爪蟾和牛的PGLYRP1， 分別為45.1%和42.1%； 與鯉科魚類短型PGRP5的相似性為29.8%—36.1%； 與其他脊椎動物長型PGRP2和PGRP6的相似性為19.1%—22.4% (表 1)。

2.2 大鯢PGRP-S系統(tǒng)進化樹分析

使用MEGA4.0軟件鄰接法構(gòu)建大鯢PGRP-S和其他脊椎動物PGRPs的系統(tǒng)進化樹， 結(jié)果表明大鯢PGRP-S與兩棲動物爪蟾的短型肽聚糖識別蛋白PGLYRP1的親緣關系最近； 同時哺乳動物短型PGLYRP1與中間型PGLYRP-3和PGLYRP-4聚為一個大的分支(圖 1)。

2.3 大鯢PGRP-S真核表達產(chǎn)物免疫印跡檢測

由于HEK293T細胞高的轉(zhuǎn)染效率， 我們以HEK293T細胞作為模型研究大鯢PGRP-S的功能。用重組質(zhì)粒PGRP-S-FLAG以及相應的空質(zhì)粒p3xFLAG轉(zhuǎn)染HEK293T細胞36h后提取蛋白， 經(jīng)SDS-PAGE電泳后， 轉(zhuǎn)PVDF膜， Western-blotting分析結(jié)果顯示HEK293T細胞的胞外培養(yǎng)基以及細胞溶胞產(chǎn)物中在15—25 kD有特異性條帶， 與目的蛋白理論分子量大小一致(18 kD左右)， 而空質(zhì)粒p3xFLAG轉(zhuǎn)染組無特異性條帶， 表明目的蛋白在HEK293T細胞胞外和胞內(nèi)都有表達。

表 1 大鯢PGRP-S與其他物種的PGRPs氨基酸序列相同性/相似性比較Tab. 1 Amino acid identities/similarities of Andrias davidianus PGRP-S and those of other species

2.4 大鯢PGRP-S的NF-κB活性分析

NF-κB信號通路是肽聚糖識別蛋白識別病原微生物繼而產(chǎn)生抗菌效應的重要通路， 果蠅PGRPs家族許多成員均可通過此信號通路誘導抗菌肽的產(chǎn)生[17，18]。為了研究大鯢PGRP-S是否能激活NF-κB信號通路， 我們將大鯢PGRP-S及空質(zhì)粒分別與NF-κB啟動子報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞中，48h后裂解細胞。該熒光素酶檢測的結(jié)果表明， 大鯢PGRP-S能顯著激活NF-κB啟動子活性(圖 2)。

2.5 大鯢PGRP-S的抗菌作用

為了研究大鯢PGRP-S對胞外以及胞內(nèi)遲緩愛德華氏菌增殖的影響， 我們將PGRP-S-FLAG質(zhì)粒及空質(zhì)粒p3xFLAG轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞， 然后用遲緩愛德華氏菌感染過表達的細胞， 分別在感染后3h和6h收集細胞培養(yǎng)基或者裂解物， 通過平板計數(shù)法來計算各組細胞內(nèi)或者細胞外遲緩愛德華氏菌的數(shù)量。結(jié)果顯示， 在遲緩愛德華氏菌感染3h和6h后， 實驗組的細菌數(shù)量顯著低于對照組(圖 3)。

2.6 大鯢PGRP-S的肽聚糖結(jié)合活性

肽聚糖識別蛋白， 作為天然免疫系統(tǒng)中的一類模式識別受體， 因其能特異性地識別細菌細胞壁組分PGN而得名。為了研究大鯢的PGRP-S與PGN的結(jié)合情況， 我們在HEK293T細胞中分別過表達大鯢PGRP-S的FLAG標簽融合蛋白以及GFP蛋白， 并將胞漿蛋白提取物分別與Lys-type和Dap-type PGN共孵育， 再通過Western-blotting技術(shù)檢測大鯢PGRP-S與這2種PGN的結(jié)合情況。結(jié)果表明， 大鯢PGRP-S能結(jié)合Lys-type和Dap-type PGN (圖 4)。

2.7 大鯢PGRP-S的酰胺酶活性

肽聚糖識別蛋白家族的部分成員與T7溶菌酶相似， 具有酰胺酶活性， 通過切割MurNAc與LAla之間的酰胺鍵水解細菌細胞壁的PGN。為了研究大鯢PGRP-S是否具有酰胺酶活性， 我們在HEK293T細胞中過表達大鯢PGRP-S的重組質(zhì)粒， 并將蛋白提取物分別與Lys-type和Dap-type PGN在Tris-Zn-Cl2緩沖液中共孵育， 用全波長分光光度計檢測OD540的變化。結(jié)果表明， 大鯢PGRP-S沒有酰胺酶活性， 不能水解Lys-type和Dap-type PGN (圖 5)。

3 討論

圖 1 鄰接法構(gòu)建大鯢PGRP-S與其他物種PGRPs的系統(tǒng)進化樹Fig. 1 Phylogenetic tree of Andrias davidianus PGRP-S with those of other species

圖 2 大鯢PGRP-S對NF-κB啟動子活性的影響Fig. 2 The effect of Andrias davidianus PGRP-S on the NF-κB activity

肽聚糖識別蛋白家族成員既可編碼分泌蛋白，又可編碼膜蛋白或者胞內(nèi)蛋白。在果蠅中， 幾乎所有短型PGRPs均為分泌蛋白； 其中PGRP-SA和PGRP-SD起著模式識別受體的作用， PGRP-SB和PGRP-SC則具有水解PGN的酰胺酶活性[19]。哺乳動物的4個PGRPs均為分泌蛋白， 它們分別表達于不同的組織， 參與該組織的免疫應答[4]。在魚類中，斑馬魚的PGLYRP2、PGLYRP5和PGLYRP6及草魚的PGLYRP6也均能分泌到胞外[8，13]。本研究中的大鯢PGRP-S盡管沒有信號肽， 但也能分泌到胞外， 這與斑馬魚PGLYRP5的情況類似[8]。這表明PGRPs家族成員具有不依賴于信號肽的分泌機制。

圖 3 大鯢PGRP-S對胞內(nèi)(A)以及胞外(B)遲緩愛德華氏菌增殖的影響Fig. 3 The effect of Andrias davidianus PGRP-S on the intracellular (A) and extracellular (B) E.tarda’s growth in HEK293T cells

圖 4 大鯢PGRP-S與PGN的結(jié)合作用Fig. 4 The binding activity of Andrias davidianus PGRP-S with PGN

肽聚糖識別蛋白最初因能識別細菌細胞壁的PGN而得名， 目前發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)PGRPs均具有PGN結(jié)合能力， 并且這種結(jié)合活性可能并不依賴于PGRP結(jié)構(gòu)域的完整性[14]。已有的研究顯示， PGRPs對于Lys-type和Dap-type PGN的結(jié)合能力存在差異；它們區(qū)別Lys和Dap型PGN主要是通過2個途徑:(1)通過區(qū)別不同類型肽聚糖的四肽尾之間的肽橋；(2)通過肽聚糖結(jié)合大溝內(nèi)的3個重要的氨基酸的組成區(qū)別不同類型的肽聚糖[20]， 如人類的PGLYRP1(Gly89、Trp90和Arg109GWR)識別Dap型PGN； PGLYRP3(Asn236、Phe237和Val256NFV)識別Lys型PGN[5]， 草魚PGLYRP5(Gly73、Phe74和Arg93GFR)識別2種類型的PGN[12]。在本研究中， 大鯢PGRP-S (Lys111、Arg112和Arg131KRR)也識別2種類型的PGN。此外， 在其他的物種中這3個位點還存在其他不同的氨基酸組成， 這些不同的氨基酸組成與PGN結(jié)合特異性之間的關系還有待進一步的研究。

目前發(fā)現(xiàn)的PGRPs成員幾乎都參與天然免疫應答， 它們的功能概括起來主要包括三個方面:(1)作為模式識別受體(如果蠅的PGRP-SA)， 激活下游的免疫應答信號通路， 介導抗菌肽等效應分子的釋放； (2)作為效應分子， 具有直接的殺菌作用， 如哺乳動物的PGLYRP1、PGLYRP3、PGLYRP4； (3)作為調(diào)節(jié)分子， 調(diào)節(jié)免疫信號通路的應答水平: 包括具有酰胺酶活性的PGRPs (如PGRP-LB)和一些PGRPs分子的異構(gòu)體(如rPGRP-LC)[16，19，21]。本研究發(fā)現(xiàn)在HEK293T細胞中過表達大鯢PGRP-S能抑制E. tarda在胞內(nèi)的增殖， 這與之前Li等[13]和Yu等[14]在草魚CIK細胞中對草魚PGRP6及其異構(gòu)體的研究結(jié)果類似， 與之不同的是我們還發(fā)現(xiàn)大鯢PGRP-S對E.tarda的胞外增殖也具有抑制作用， 這表明大鯢的PGRP-S在抵抗胞內(nèi)和胞外細菌感染的免疫應答中都具有重要作用。

NF-κB作為無脊椎動物和脊椎動物的天然免疫系統(tǒng)乃至適應性免疫系統(tǒng)中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子， 參與多個免疫信號通路的激活。昆蟲中2個重要的抗菌天然免疫信號通路(Toll和IMD)以及脊椎動物中其他的PRRs (如TLRs和NODs)介導的免疫應答信號通路都涉及NF-κB的活化。Li等[13]和Yu等[14]研究發(fā)現(xiàn)， 在草魚頭腎細胞中過表達草魚PGRP6及其異構(gòu)體能激活NF-κB信號通路。而本研究發(fā)現(xiàn)， 在HEK293T細胞中過表達大鯢的PGRPS也能誘導NF-κB啟動子的活性， 我們推測大鯢PGRP-S可能和魚類一樣， 通過激活NF-κB相關的免疫信號通路發(fā)揮抗菌功能。

圖 5 大鯢PGRP-S的酰胺酶活性分析Fig. 5 Amidase activity of Andrias davidianus PGRP-S

在肽聚糖識別蛋白家族中， 有的PGRPs具有酰胺酶活性， 如果蠅PGRP-SB1、PGRP-LB， 哺乳動物PGLYRP2等[22—24]。目前發(fā)現(xiàn)的所有具有酰胺酶活性的PGRPs均含有4個保守的Zn2+結(jié)合位點， 如斑馬魚PGLYRP5(His98、Tyr132、His206和Cys214，HYHC)[8]。Zn2+在PGRPs水解PGN的過程中作為親電催化劑， 促進N-乙酰胞壁酸和L-丙氨酸之間的酰胺鍵的水解[25]。因此， 這4個Zn2+結(jié)合位點對具有催化活性的PGRPs至關重要， 人類PGLYRP2C530S突變及果蠅PGRP-SC1b C168A和C168S突變均失去酰胺酶活性[26，27]。本研究發(fā)現(xiàn)， 只有2個Zn2+結(jié)合位點的大鯢PGRP-S不具有酰胺酶活性， 這表明所克隆的大鯢PGRP-S類似于哺乳動物的PGLYRP1、PGLYRP3和PGLYRP4， 能結(jié)合但不能直接降解細菌的肽聚糖； 其殺菌機制有可能是因為與細菌細胞壁的相互作用抑制了肽聚糖的合成， 進而殺死細菌或者抑制細菌的增殖[28，29]。

總之， 本研究克隆了大鯢的一個短型肽聚糖識別蛋白PGRP-S， 在其氨基酸序列中只含有2個保守的Zn2+結(jié)合位點。功能研究發(fā)現(xiàn)， 大鯢PGRP-S無酰胺酶活性， 但能識別并結(jié)合Lys型及Dap型PGN， 對胞內(nèi)及胞外的細菌具有顯著的抑菌作用， 這說明本研究中所克隆的大鯢PGRP-S在功能上更類似于哺乳動物的短型PGRP。

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