白麗梅，董昔山

肺炎支原體（MP）是常見(jiàn)的呼吸道感染病原體，約30%感染者發(fā)生肺炎[1]。支原體肺炎無(wú)特異性癥狀，臨床醫(yī)生很難與其他病原菌感染所致肺炎區(qū)分開(kāi)來(lái)[2]。MP檢測(cè)技術(shù)眾多，包括培養(yǎng)法、血清學(xué)抗原抗體檢測(cè)等，培養(yǎng)法檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)于實(shí)驗(yàn)室要求較高，且容易受到送檢樣本中其他病原菌的干擾；血清MP-IgM一般于感染后1周出現(xiàn)，并且血清學(xué)抗原抗體檢測(cè)受患者自身免疫水平影響[3]。因此，臨床迫切需求一種快速、準(zhǔn)確的MP檢測(cè)新方法。RNA恒溫?cái)U(kuò)增法是（SAT）近年來(lái)出現(xiàn)的一種新型的病原體分子診斷技術(shù)，是以活菌的特異性RNA基因片段作為擴(kuò)增對(duì)象，具有無(wú)創(chuàng)、簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[4]。本研究對(duì)咳嗽、發(fā)熱癥狀患者的臨床樣本采用SAT法進(jìn)行MPRNA檢測(cè)，探討SAT-MP（RNA）結(jié)合胸部X線檢查在早期支原體肺炎中的診斷價(jià)值，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取浙江新安國(guó)際醫(yī)院2016年10月至2017年4月收治的咳嗽、發(fā)熱癥狀患者463例，其中男241例，女222例；年齡2個(gè)月至14歲，中位年齡4.5歲；病程 2 ～ 12 d，平均（4.72±1.82）d。

1.2 儀器及試劑 上海宏石SLAN-96S型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，MP核酸檢測(cè)試劑盒（RNA恒溫?cái)U(kuò)增）購(gòu)自上海仁度生物科技有限公司；MP-IgM檢測(cè)試劑盒（化學(xué)發(fā)光法）由深圳亞輝龍公司生物科技有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 SAT-MP檢測(cè) 使用一次性無(wú)菌咽拭子采集入院1 d患者咽部分泌物，將拭子頭放入含1 ml 0.9%氯化鈉注射液的PE管中晃動(dòng)10 s，貼管壁擠干后丟棄拭子頭。取500 l樣本加入500 l裂解液進(jìn)行裂解，取裂解后的樣本400 l加入100 l核酸提取液。60℃恒溫5min，室溫放置10min，于磁性分離架放置5min，吸凈管中的液體，洗滌2次。加入40 l擴(kuò)增液，震蕩5 s，取30 l懸液至新的PCR 管中，60 ℃，10 min；42 ℃，5 min；加入10 l擴(kuò)增酶，在上海宏石SLAN-96S擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?2℃，1min，共40個(gè)循環(huán)，F(xiàn)AM通道收集熒光信號(hào)。讀取每個(gè)樣本的RNA擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（dt值）。陽(yáng)性和陰性對(duì)照同法進(jìn)行操作。判斷標(biāo)準(zhǔn)：dt值≤35為陽(yáng)性；dt值≥40為陰性；dt值35～40的樣本重新檢測(cè)，dt值≤35為陽(yáng)性，＞35為陰性。

1.3.2 MP-IgM抗體檢測(cè) 分別取患兒入院2d和7～10 d時(shí)空腹靜脈血2 ml，2 000 r/ming離心10 min，取血清按照MP-IgM檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)。陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)：MP-IgM抗體≥1.10 Col。

1.3.3 X線檢查 對(duì)SAT-MP檢查陽(yáng)性的患者行胸部正位X線檢查。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料比較采用2檢驗(yàn)。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SAT-MP檢查結(jié)果 入院24 h時(shí)血清MP-IgM陽(yáng)性14例（3.02%），經(jīng)雙份血清MP抗體檢查確診MP感染19例（4.10%），經(jīng)SAT-MP檢查共發(fā)現(xiàn)36例（7.77%）MP感染患者。SAT-MP診斷MP感染的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為36.11%（13/36）、98.59%（421/427）、68.42%（13/19）、94.82%（421/444）。見(jiàn)表 1。

2.2 X線檢查結(jié)果 36例SAT-MP檢測(cè)陽(yáng)性患者胸部正位X線檢查，均可見(jiàn)肺炎病變。其中大葉實(shí)質(zhì)浸潤(rùn)8例，表現(xiàn)為扇形或者三角形大片狀陰影，邊界清晰，左肺3例，右肺3例，雙肺2例；小葉性實(shí)質(zhì)浸潤(rùn)14例，表現(xiàn)為自肺門向外呈扇形或者放射狀延伸，可見(jiàn)大小不一的陰影，部分病灶融合呈磨玻璃密度，左肺2例，右肺4例，雙肺8例；間質(zhì)浸潤(rùn)性14例，表現(xiàn)為肺紋理變粗、增加，可見(jiàn)網(wǎng)狀和點(diǎn)狀陰影，左肺4例，右肺8例，雙肺2例。

3 討論

MP感染是臨床常見(jiàn)的呼吸道感染病原體，支原體肺炎好發(fā)于學(xué)齡期兒童，以5歲以下居多[4]。MP感染早期肺部體征不明顯，影像學(xué)改變比較明顯但具有多樣性，使得醫(yī)生難以做出診斷結(jié)論。經(jīng)典培養(yǎng)法培養(yǎng)條件苛刻，檢測(cè)周期長(zhǎng)不適用于早期診斷。快速培養(yǎng)法易受雜菌影響，特異性不高。血清學(xué)中的雙份血清特異性抗體滴度檢測(cè)特異性高，但需在患者治療期間采集2次血液進(jìn)行檢測(cè)，抗體的產(chǎn)生需1周左右的時(shí)間并且受機(jī)體免疫功能的影響較大，降低了臨床診斷效率。MP DNA檢測(cè)的靈敏度和特異度均較高[5]。但臨床DNA檢測(cè)無(wú)法區(qū)分MP的攜帶狀態(tài)，部分患者感染1個(gè)月時(shí)其 DNA的檢出率仍然高達(dá)50%，MP DNA持續(xù)攜帶中位數(shù)時(shí)間為7周，個(gè)別甚至長(zhǎng)達(dá)7個(gè)月之久[6]；另一方面，DNA檢測(cè)技術(shù)無(wú)法區(qū)分“活菌”和“死菌”，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果和臨床相關(guān)性不足。

SAT技術(shù)是采用 M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、T7RNA聚合酶對(duì)靶RNA進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)，具有如下優(yōu)勢(shì)[7]：（1）區(qū)分“活菌”和“死菌”，靶RNA由活菌產(chǎn)生，一旦病原體死亡，RNA快速降解，因此檢測(cè)結(jié)果與臨床具有良好的相關(guān)性，指導(dǎo)臨床合理用藥，減少無(wú)效治療；（2）診斷活動(dòng)性感染，當(dāng)病原體處于活動(dòng)性感染狀態(tài)時(shí)，RNA轉(zhuǎn)錄較為活躍，dt值較低，當(dāng)病原體處于潛伏狀態(tài)時(shí)，靶RNA不轉(zhuǎn)錄；（3）防止實(shí)驗(yàn)室污染，由于SAT檢測(cè)對(duì)象為 RNA，擴(kuò)增中產(chǎn)生的產(chǎn)物也是RNA，而RNA極易降解，避免了DNA擴(kuò)增過(guò)程中可能造成的實(shí)驗(yàn)室污染問(wèn)題。本研究顯示，SAT-MP檢測(cè)疑似支原體肺炎患者咽拭子中 MP感染的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為36.11%、98.59%、68.42%、94.82%，提示該法檢測(cè) MP的特異度較高。MP抗體檢測(cè)入院24h內(nèi)MP感染陽(yáng)性率為3.02%（14/463），低于最終確診MP感染19例（4.10%），提示SAT-MP對(duì)MP的診斷早于 MP抗體檢測(cè)。本研究36例SAT-MP陽(yáng)性患者進(jìn)行胸部正位X線檢查顯示，均可見(jiàn)肺部病變，提示SAT-MP與X線檢查結(jié)果具有極高的一致性，反映SAT-MP與臨床具有非常高的相關(guān)性。

表1 463例患者M(jìn)P感染情況分析 例

參考文獻(xiàn)：

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[3]張志英,韓淑娟,張小寧,等.肺炎痰液支原體DNA聯(lián)合血清MP-IgM抗體檢測(cè)在小兒肺炎支原體肺炎早期診斷中的價(jià)值[J].中國(guó)臨床新醫(yī)學(xué),2017,10(9):866-868.

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