李 龍,劉鎖珠,張振倉(cāng)

(1.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物工程分院,陜西楊凌 712100;2.西藏農(nóng)牧學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,西藏林芝 860000)

近幾年，西藏商品肉雞的飼養(yǎng)量不斷增加。但在高海拔缺氧條件下，外來商品肉雞表現(xiàn)出死亡率高的特點(diǎn)，這也是造成高海拔地區(qū)肉雞飼養(yǎng)經(jīng)濟(jì)損失的主要原因之一。Li等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，在西藏林芝地區(qū)（平均海拔2900 m）飼養(yǎng)AA肉雞死亡率高達(dá)30%，其中飼養(yǎng)前期（1～14 d）死亡率占總死亡率的一半，缺氧引起的腹水死亡主要發(fā)生在中期（15～28 d）和后期（29～42 d），飼養(yǎng)前期的死亡率主要是非腹水引起的死亡。高海拔地區(qū)的缺氧環(huán)境使肉仔雞孵化率很低（田發(fā)益等，2001），西藏地區(qū)飼養(yǎng)的肉雞都是從內(nèi)地購(gòu)買并空運(yùn)進(jìn)藏，因此，降低早期過高的雛雞死亡率對(duì)西藏和其他高海拔地區(qū)養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展至關(guān)重要。

飼養(yǎng)前期肉仔雞免疫系統(tǒng)未發(fā)育成熟，更易受到病原菌感染，造成前期死亡率高，因此，飼養(yǎng)前期的免疫系統(tǒng)發(fā)育對(duì)肉雛雞來說非常重要（Bar-Shira等，2003）。已有大量研究表明，缺氧環(huán)境會(huì)影響動(dòng)物機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫（McNamee等，2013；Clambey等，2012），本課題組前期研究也表明，缺氧會(huì)抑制肉雞免疫機(jī)能的發(fā)育，并與高海拔肉雞早期非腹水死亡率高有關(guān)（待發(fā)表）。多年生草本植物紅景天在歐洲和亞洲以其抗缺氧、抗抑郁和抗炎等作用已在臨床上得到廣泛應(yīng)用，在體外、動(dòng)物和臨床試驗(yàn)中已證實(shí)，紅景天能增強(qiáng)機(jī)體免疫機(jī)能和調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)（Recio等，2016；Chou等，2011）。但目前對(duì)紅景天提取物對(duì)肉雞早期免疫機(jī)能的影響還未見報(bào)道，因此，本試驗(yàn)的目的是研究不同紅景天提取物添加水平對(duì)肉雞早期（0～14 d）死亡率和免疫機(jī)能的影響。

1 材料與方法

1.1 紅景天提取物制備 本試驗(yàn)中紅景天來自西藏農(nóng)牧學(xué)院校內(nèi)人工種植，經(jīng)本校相關(guān)專家鑒定為大花紅景天。取紅景天干燥根部用蒸餾水清洗，在陰涼處風(fēng)干，用粉碎機(jī)將紅景天制成粉末，按質(zhì)量體積比1：5（m/V）蒸餾水，室溫放置24 h（冷滲法）獲得紅景天水提物，將上層液體轉(zhuǎn)入另一容器中，殘?jiān)貜?fù)上述操作4次。將所有紅景天水提物混合并用紗布過濾，8000 g離心2 min轉(zhuǎn)移上清棄去殘?jiān)?。上清利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行干燥處理，結(jié)果顯示，1 g大花紅景天根部可以生產(chǎn)約0.18 g紅景天水提物粉末。通過液相色譜檢測(cè)提取物中紅景天苷、絡(luò)塞維和酪醇的含量分別為25.21、10.44 mg/g和 0.03 mg/g。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理 本試驗(yàn)中所用的450只1日齡健康雄性AA肉仔雞從成都購(gòu)買，出殼當(dāng)天空運(yùn)至西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院實(shí)習(xí)牧場(chǎng)（平均海拔2986 m）。肉仔雞全程自由采食和飲水。飼養(yǎng)密度為15只/m3，第一周室溫保持在33 ℃，第二周室溫保持在28 ℃。光照制度為23 h光照，1 h熄燈。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 450只1日齡雄性AA肉仔雞按體重隨機(jī)分為5組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15只雞，試驗(yàn)期為14 d。仔雞飼喂玉米為基礎(chǔ)的商品前期日糧。5個(gè)處理組分別在基礎(chǔ)日糧中添加0（對(duì)照組）、0.1%、0.15%、0.2% 和 0.4% 的紅景天水提物干粉。

1.4 樣品采集與測(cè)定 每天觀察雞群，統(tǒng)計(jì)死亡雞只數(shù)。在14日齡，利用抗凝采血管頸靜脈采血，血樣3000 g離心10 min，血漿保存于-80 ℃，用于測(cè)定血漿免疫球蛋白IgA，IgG和IgM。血漿免疫球蛋白水平通過ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特）測(cè)定，操作步驟按照說明書進(jìn)行。免疫球蛋白的濃度通過標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。

為測(cè)定肉雞特異性抗體免疫應(yīng)答，本試驗(yàn)選擇給雛雞口服抗原牛血清白蛋白（BSA）。Bar-Shira（2003）曾報(bào)道雞仔7日齡后才會(huì)出現(xiàn)特異性抗體應(yīng)答，因此，本試驗(yàn)從每個(gè)重復(fù)選取2只雞免疫BSA（每只雞每天5 mg），從8日齡到12日齡連續(xù)免疫5 d。最后一次免疫10 d后頸靜脈采血，3000 g離心10 min，收集血漿，通過ELISA方法檢測(cè)抗-BSA抗體的水平。通過連續(xù)稀釋免疫過BSA的雞血清繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，未稀釋的血清定為1000。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 one-way ANOVA進(jìn)行單因素方差分析，差異顯著時(shí)用LSD法進(jìn)行多重比較，P＜0.05表示差異顯著，死亡率通過卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 死亡率 由圖1可知，與對(duì)照組相比，0.1%和0.15%紅景天提取物組對(duì)肉雞早期死亡率無顯著影響（P＞0.05），但0.2%和0.4%紅景天提取物組顯著降低了肉雞早期死亡率（P＜0.05）。

圖1 不同紅景天提取物添加水平對(duì)飼養(yǎng)早期肉雞死亡率的影響

2.2 血漿免疫球蛋白 由表1可知，在飼養(yǎng)期14 d，與對(duì)照組相比，0.2%和0.4%紅景天提取物組血漿中IgA和IgG水平顯著提高（P＜0.05），0.1%和0.15%紅景天提取物組與對(duì)照組間無顯著差異（P＞0.05）。所有處理組對(duì)血漿中IgM水平無顯著影響（P＞0.05）。

2.3 BSA抗體滴度 由圖2可知，與對(duì)照組相比，0.2%和0.4%紅景天提取物組血漿中BSA抗體水平顯著提高（P＜0.05），但0.1%和0.15%紅景天提取物組與對(duì)照組無顯著差異（P＞0.05）。

表1 不同紅景天提取物添加水平對(duì)早期肉雞免疫球蛋白水平的影響????????????ng/mL

圖2 不同紅景天提取物添加水平對(duì)飼養(yǎng)早期肉雞BSA抗體水平的影響

3 討論

高原缺氧條件下，肉雞飼養(yǎng)早期死亡率偏高是制約高原地區(qū)肉雞飼養(yǎng)的一個(gè)重要問題。本研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加0.2%和0.4%紅景天提取物顯著降低高原缺氧條件下肉雞飼養(yǎng)早期（0～14 d）死亡率。高海拔地區(qū)肉雞飼養(yǎng)前期高的死亡率與缺氧引起的免疫機(jī)能發(fā)育受阻密切相關(guān)。缺氧應(yīng)激會(huì)影響機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)，削弱免疫細(xì)胞的分化和功能，如T細(xì)胞和B細(xì)胞，進(jìn)而影響免疫球蛋白和細(xì)胞因子的水平。Kleessen等（2005）研究發(fā)現(xiàn)，德國(guó)登山者在攀登過程中，血清中的IgA和IgM水平有降低趨勢(shì)。Chohan等（1975）發(fā)現(xiàn)，高海拔地區(qū)居民血清中的IgA和IgG水平顯著高于生活在海平面的居民，而且生活在海平面的居民達(dá)到高海拔地區(qū)兩年后，血清IgA和IgG水平也顯著高于海平面居民。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，0.2%和04%紅景天提取物組顯著提高肉雞血液IgA和IgG水平。Mishra等（2010，2006）在體外和體內(nèi)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，紅景天提取物能改善不良狀態(tài)下的免疫抑制作用，但在正常情況下紅景天提取物對(duì)免疫的改善作用不明顯。本課題組通過對(duì)比高氧組（氧氣百分比25.8%～26.5%）和低氧組（氧氣百分比20.7%～21.4%）肉雞前期免疫機(jī)能發(fā)現(xiàn)，缺氧會(huì)削弱肉雞前期非特異性免疫應(yīng)答，降低血液中免疫球蛋白IgA和IgG水平（數(shù)據(jù)待發(fā)表），證實(shí)了缺氧條件造成肉雞的免疫抑制。綜合以上結(jié)果說明，紅景天提取物能改善缺氧引起的肉雞免疫抑制。

除了改善肉雞的非特異性免疫應(yīng)答，紅景天提取物還會(huì)改善肉雞特異性免疫應(yīng)答。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼料中添加0.2%和04%紅景天提取物能顯著提高血漿中特異抗原BSA的抗體水平。徐業(yè)芬等（2005）也發(fā)現(xiàn)，飲水或肌注紅景天提取物能顯著提高藏雞新城疫抗體水平，并且存在計(jì)量依懶性。在體外細(xì)胞模型和哺乳動(dòng)物試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，缺氧影響免疫應(yīng)答的原因可能是因缺氧會(huì)抑制TCR信號(hào)通路或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而影響T細(xì)胞的功能（Sitkovsky等，2005）。此外，缺氧還會(huì)引起細(xì)胞氧化損傷。免疫細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激特別敏感，免疫細(xì)胞表面存在大量多不飽和脂肪酸膠，并且缺乏維生素E、鋅等抗氧化物質(zhì)，這可能是缺氧影響免疫的另一個(gè)原因（Meydani等，1995）。但在家禽上，缺氧對(duì)免疫機(jī)能影響的機(jī)理可能會(huì)有不同，還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)中，日糧添加0.2%和0.4%紅景天提取物能顯著降低肉雞高原缺氧條件下飼養(yǎng)前期的死亡率，這與其能改善雛雞免疫機(jī)能有關(guān)，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)成本，以0.2%紅景天提取物添加量為最佳。

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