張 瑜， 奚雪滔， 趙 雪

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院泌尿外科，上海 200336)

前列腺癌(prostate cancer)是男性十大致死性腫瘤之一，發(fā)病率逐步上升[1]。前列腺癌根治術(shù)和內(nèi)分泌治療能改善患者生存期，中、高危局限性前列腺癌的10年復(fù)發(fā)率分別為54%和71%[2]，中國(guó)前列腺癌患者近10年死亡率緩慢上升[1]。在內(nèi)分泌治療18～24個(gè)月后，大部分患者會(huì)進(jìn)展為激素非依賴(lài)性前列腺癌[3]；雖然仍然可以選擇行放化療，但預(yù)后差，進(jìn)展迅速。因此，亟待尋找新的治療方法，而基因靶向治療也是近年一直探索的方向。ZIC5(Zic family member 5)是ZIC家族中一員。ZIC蛋白家族參與調(diào)控許多發(fā)育過(guò)程，ZIC1、ZIC2、ZIC3參與調(diào)控轉(zhuǎn)錄活動(dòng)，可以抑制I-mfa。但關(guān)于ZIC5的研究甚少，有研究報(bào)道ZIC5具有促癌作用。Satow等報(bào)道了ZIC5受PDGFD調(diào)控，增強(qiáng)黑色素瘤的侵襲性。本研究旨在探討ZIC5在前列腺癌中的表達(dá)水平及其對(duì)前列腺癌生物學(xué)特性的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3和LNCaP購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。LNCaP為雄素依賴(lài)性前列腺癌細(xì)胞。PC3細(xì)胞源于骨轉(zhuǎn)移的前列腺癌，具有雄激素非依賴(lài)性。兩種細(xì)胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液(Gibco，上海立菲生物科技有限公司)中，置于37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。人前列腺正常上皮細(xì)胞RWPE-l購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)，使用KSMF培養(yǎng)液(Gibco，上海立菲生物科技有限公司)培養(yǎng)。293細(xì)胞使用DMEM(10%胎牛血清和1%抗生素)培養(yǎng)液培養(yǎng)。抽提PC3、LNCaP和RWPE-1細(xì)胞的RNA和蛋白。選取2013年1月至2016年12月于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院收集的前列腺癌根治術(shù)標(biāo)本以及配對(duì)的癌旁正常組織標(biāo)本38例，平均年齡(70.8±7.6)歲。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

人前列腺癌細(xì)胞LNCaP和PC3接種于6孔培養(yǎng)板并貼壁后，使用陽(yáng)離子脂質(zhì)載體LipofectamineTM2000將ZIC5 siRNA轉(zhuǎn)染入LNCaP和PC3細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度為70%～85%，轉(zhuǎn)染空白載體組(negative control, NC)組作為陰性對(duì)照組，siRNA和NC組轉(zhuǎn)染終濃度為50nmol/L，轉(zhuǎn)染48h后抽提總RNA，72h后抽提總蛋白。ZIC5 siRNA序列由上海吉瑪制藥有限公司設(shè)計(jì)，并合成為siRNA Oligo用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。其中ZIC5 siRNA-3序列如下。上游引物： 5′-CGUAGCAAAGGAACAGCA-TT-3′，下游引物： 5′-UGCUGUUCCUUUGCUAC-GGTT-3′。NC序列： 上游引物5′-UUCUCCGAAC-GUGUCACGUTT-3′；下游引物5′-ACGUGACACG-UUCGGAGAATT-3′。

1.3 熒光定量RT-PCR

TRIzol(Invitrogen，美國(guó))法提取各實(shí)驗(yàn)組LNCaP和PC3細(xì)胞以及液氮中凍存的前列腺癌組織標(biāo)本總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA后進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件如下： 94℃變性；94℃變性20s，57℃退火40s，72℃延伸40s，32個(gè)循環(huán)；72℃孵育10min。qRT-PCR引物如下。ZIC5上游引物： 5′-GTCTATGGGCCTGATTGTGTAGT-3′；下游引物： 5′-GCCAAATCCGCTAATCTCA-GC-3′；GAPDH上游引物： 5′-GGAGCGAGATC-CCTCCAAAAT-3′；下游引物： 5′-GGCTGTTGT-CATACTTCTCATGG-3′。miR-449熒光定量則使用TaqMan microRNA檢測(cè)試劑盒和TaqMan探針。2-ΔΔCt法分析相對(duì)表達(dá)量。

1.4 Western印跡法分析

轉(zhuǎn)染siRNA ZIC5 72h，使用RIPA細(xì)胞裂解液(江蘇碧云天公司，P1003B)提取蛋白，二辛可酸(bicinchonininc acid, BCA)試劑盒(江蘇碧云天公司)測(cè)定蛋白濃度，并調(diào)整待測(cè)樣本的蛋白質(zhì)含量。每孔加30μg的蛋白樣品，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，按1∶1000稀釋一抗孵育，置4℃孵育過(guò)夜。PBST中洗膜3次，每次10min，分別按1∶1000稀釋二抗孵育1h，PBST中洗膜3次，每次10min。通過(guò)Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)(美國(guó)LICOR公司)讀取目的電泳條帶的光密度值。ZIC5(貨號(hào)： ab115566)、E-cadherin(貨號(hào)： ab15148)、Vimentin(貨號(hào)： ab92547)購(gòu)于A(yíng)bcam公司。

1.5 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)

siRNA組和NC對(duì)照組細(xì)胞從6孔板中消化下來(lái)，將細(xì)胞密度調(diào)整為3×105/mL，取0.2mL接種到Transwell小室，將Transwell小室置于24孔板內(nèi)，上室內(nèi)為含1%血清的培養(yǎng)液，下室添加含10%血清的培養(yǎng)液0.5mL。培養(yǎng)18h后用棉簽頭擦掉小室內(nèi)細(xì)胞，甲醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色，洗凈風(fēng)干后于Leica熒光倒置顯微鏡200倍視野下拍照，隨機(jī)選取4個(gè)視野拍照，計(jì)數(shù)細(xì)胞。

1.6 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

將Matrigel在4℃冰箱中融化成液體，1∶8稀釋后，在上室加入稀釋后的Matrigel(BD公司)60～80μL，37℃ 30min使Matrigel聚合成凝膠。siRNA組和NC對(duì)照組細(xì)胞從6孔板中消化下來(lái)，調(diào)整細(xì)胞密度為4×105/ml，取0.2mL接種到Transwell小室，并將Transwell小室置于24孔板內(nèi)，上室內(nèi)為含1%血清的培養(yǎng)液，下室為含10%滅活血清的培養(yǎng)液。培養(yǎng)20h后用棉簽頭擦掉小室內(nèi)細(xì)胞，甲醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色，洗凈風(fēng)干后于Leica熒光倒置顯微鏡200倍視野下拍照，隨機(jī)選取4個(gè)視野拍照，計(jì)數(shù)細(xì)胞。

1.7 miRNA預(yù)測(cè)及雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

使用Target Scan和miRanda生物信息平臺(tái)分析，在ZIC5 3’UTR區(qū)320～326位點(diǎn)上可能是miR-449家族的結(jié)合位點(diǎn)，體外合成該位點(diǎn)的DNA片段(wild type, WT)及該位點(diǎn)缺失的突變體的DNA片段(Mutant，MUT)，并將這兩個(gè)片段克隆至含雙熒光素酶報(bào)告基因的載體psiCHECK-2中。WT和MUT質(zhì)粒與miR-449家族mimics(hsa-miR-449a： UGGC-AGUGUAUUGUUAGCUGGU；hsa-miR-449b： AGG-CAGUGUAUUGUUAGCUGGC)[5]分別轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞中，48h后熒光素酶檢測(cè)試劑盒測(cè)熒光素酶活性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 ZIC5在前列腺癌中表達(dá)水平上升

定量PCR顯示，在前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3(PC3vsRWPE-1，t=7.625，P=0.002)和LNCaP(LNCaPvsRWPE-1，t=3.519，P=0.025)中表達(dá)水平顯著高于正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1。38例前列腺癌中，28(75.7%)例前列腺癌患者標(biāo)本ZIC5表達(dá)水平較癌旁正常組織高(t=4.201，P<0.001)。高表達(dá)的ZIC5與前列腺癌Gleason評(píng)分具有相關(guān)性。根據(jù)Gleason評(píng)分將入組患者分為≥7分(23例)組和<7分組(15例)，以及根據(jù)ZIC5表達(dá)水平的中位數(shù)分為ZIC5高表達(dá)組(28例)和低表達(dá)組(10例)，結(jié)果顯示在Gleason評(píng)分≥7分組中，ZIC5高表達(dá)患者比例顯著升高(20/23)，F(xiàn)isher精確概率相關(guān)性分析顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明ZIC5表達(dá)水平與Gleason評(píng)分具有相關(guān)性(P<0.05)。

2.2 siRNA成功干擾ZIC表達(dá)水平

使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染ZIC5 siRNA。q-RT-PCR顯示，轉(zhuǎn)染siRNA后，成功干擾ZIC5 RNA在前列腺癌PC3和LNCaP中的表達(dá)水平，蛋白質(zhì)免疫印跡雜交顯示，ZIC5蛋白水平較對(duì)照組也顯著下降，見(jiàn)圖1。

圖1 si-ZIC5成功干擾ZIC5 mRNA和蛋白在前列腺癌細(xì)胞株中表達(dá)Fig.1 ZIC5 mRNA and protein were successfully knocked down by using siRNA ZIC 5A： siRNA ZIC5成功干擾；B： ZIC5蛋白在前列腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)；與NC組相比，*P<0.001

2.3 ZIC5 siRNA抑制前列腺癌細(xì)胞增殖

成功干擾ZIC5在前列腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平后，CCK-8增殖能力檢測(cè)顯示，PC3和LNCaP細(xì)胞的在24h后增殖能力出現(xiàn)下降，與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

2.4 ZIC5 siRNA抑制前列腺癌細(xì)胞遷移和侵襲

成功干擾ZIC5在前列腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平后，Transwell遷移能力檢測(cè)顯示，PC3(NCvssi-ZIC5：t=18.73，P<0.001)和LNCaP(NCvssi-ZIC5：t=16.2，P<0.001)細(xì)胞的遷移能力出現(xiàn)下降，同對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在Transwell上室鋪Matrigel基質(zhì)膠，檢測(cè)干擾ZIC5后前列腺癌細(xì)胞侵襲能力變化。結(jié)果顯示，siRNA組PC3(NCvssi-ZIC5：t=7.82，P<0.01)和LNCaP前列腺癌細(xì)胞侵襲能力同NC對(duì)照組相比顯著下降(NCvssi-ZIC5：t=4.62，P<0.01)，見(jiàn)圖3。

圖2 干擾ZIC5表達(dá)后顯著抑制前列腺癌細(xì)胞增殖Fig.2 Proliferation of prostate cancer cells was suppressed after downregulation of ZIC5A： PC3；B： LNCaP；與NC組相比，*P<0.01

圖3 干擾ZIC5抑制前列腺癌細(xì)胞遷移能力和侵襲能力Fig.3 Knock-down of ZIC 5 inhibited cell migration and cell invasion of prostate cancer cellsA： 前列腺細(xì)胞遷移能力；B： 前列腺癌細(xì)胞侵襲能力；與NC組相比，*P<0.05

2.5 ZIC5與miR-449表達(dá)呈負(fù)相關(guān)

通過(guò)miRanda和Target Scan生物信息平臺(tái)，篩選到miR-449家族可能是ZIC5上游調(diào)控miRNA。熒光定量PCR結(jié)果顯示，miR-449a(24/38)和miR-449b(25/38)在前列腺癌組織中表達(dá)水平顯著低于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖4。線(xiàn)性回歸分析發(fā)現(xiàn)，ZIC5 mRNA與miR-449a(r=-0.64，P<0.05)、miR-449b(r=-0.52，P<0.05)在前列腺癌組織中的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，見(jiàn)圖5。構(gòu)建ZIC5 3’UTR野生型載體(WT)以及miR-449a和miR-449b結(jié)合位點(diǎn)突變型載體(MUT)，突變ZIC5 3’UTR上miR-449a和miR-449b結(jié)合位點(diǎn)后，轉(zhuǎn)入miR-449a和miR-449b，相對(duì)熒光值未見(jiàn)明顯變化，而野生型中則顯著降低，見(jiàn)圖5，表明miR-449a和miR-449b，結(jié)合ZIC5 3’UTR，干擾其表達(dá)。

圖4 ZIC5與miR-449a家族在前列腺癌中的表達(dá)水平及雙熒光素酶基因驗(yàn)證Fig.4 Correlation between ZIC5 and miR-449 family in prostate cancer samples and miR-449 family targeting ZIC5 3’UTR was verifiedA：ZIC5 3’UTR 上miR-449a和miR-449b結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)；B：miR-449a和miR-449b在前列腺癌和癌旁正常組織中表達(dá)水平； C：雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證miR-449a和miR-449b靶向ZIC5 3’UTR；與癌旁正常組織相比，*P<0.05

圖5 miR-449a和miR-449b與ZIC5相關(guān)性分析Fig.5 Correlation analysis between miR-449a, miR-449b and ZIC5

2.6 miR-449和ZIC5逆轉(zhuǎn)前列腺癌EMT狀態(tài)

轉(zhuǎn)染siRNA后，EMT通路中，Vimentin蛋白表達(dá)水平顯著下降，E-cadherin水平呈現(xiàn)上升。轉(zhuǎn)染ZIC5上游抑制miRNA miR-449家族mimics后，ZIC5、Vimentin蛋白水平呈現(xiàn)下降，E-cadherin水平上升，見(jiàn)圖6。因此，miR-449家族通過(guò)靶向ZIC5，逆轉(zhuǎn)EMT通路，抑制前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。

圖6 ZIC5激活前列腺癌中的上皮間質(zhì)狀態(tài)Fig.6 ZIC5 activates epithelial-mesenchymal transition in prostate cancer

3 討 論

前列腺癌在我國(guó)的發(fā)病率正呈逐年上升的趨勢(shì)，雖然前列腺癌根治和內(nèi)分泌治療能延長(zhǎng)患者生存期，但進(jìn)展為非激素依賴(lài)性前列腺癌時(shí)，腫瘤則發(fā)展迅速?；虬邢蛑委熆蔀榉羌に匾蕾?lài)性前列腺癌帶來(lái)新的治療策略，關(guān)于治療靶點(diǎn)的研究也較多，但尚未出現(xiàn)特異和敏感性高的靶點(diǎn)。Nakata等[6]在非洲蟾蜍中鑒定出ZIC5。目前研究發(fā)現(xiàn)，ZIC基因家族編碼鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中具有重要作用，Nyholm等[7]報(bào)道了ZIC5在中腦蓋發(fā)育過(guò)程中促進(jìn)細(xì)胞增殖，組合的ZIC2-ZIC5通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。但關(guān)于ZIC5在腫瘤中作用的研究則甚少。Sun等[8]報(bào)道ZIC5在非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer, NSCLC)中表達(dá)水平上升，異常表達(dá)水平與NSCLC分級(jí)具有相關(guān)性。沉默ZIC5后，NSCLC細(xì)胞被抑制在G2期，細(xì)胞增殖能力被抑制[9]。本研究發(fā)現(xiàn)ZIC5在前列腺癌中表達(dá)水平較癌旁正常組織高，并且在Gleason評(píng)分高的組織中表達(dá)水平也高于對(duì)照組。干擾ZIC5后顯著抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和遷移。ZIC5通過(guò)調(diào)節(jié)cyclin B1和CDK1磷酸化水平調(diào)節(jié)NSCLC細(xì)胞的增殖和侵襲。ZIC5不僅與腫瘤的發(fā)生相關(guān)，在腫瘤耐藥性獲得上也具有一定作用。Satow等[4]研究發(fā)現(xiàn)，ZIC5過(guò)表達(dá)能顯著增強(qiáng)黑色素瘤細(xì)胞在體內(nèi)外的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移以及對(duì)化療藥物的耐受，ZIC5可能通過(guò)調(diào)節(jié)PDGFD和FAK促進(jìn)黑色素瘤的發(fā)生、進(jìn)展。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)以及靶基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證，ZIC5受miR-449家族調(diào)控，miR-449靶向ZIC5的3’-UTR，并且逆轉(zhuǎn)EMT通路。microRNA在前列腺癌的發(fā)生和進(jìn)展中具有重要作用[10]，miR-449家族在許多腫瘤中是癌基因，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。Bou等[11]報(bào)道m(xù)iR-449在胃癌中表達(dá)水平下降，過(guò)表達(dá)miR-449可以激活抑癌基因P53，抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。Luo等[12]研究顯示，miR-449在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)下降，過(guò)表達(dá)miR-449后抑制癌基因c-Met，抑制非小細(xì)胞肺癌的遷移和侵襲。因此，高表達(dá)的ZIC5促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展，在前列腺癌中充當(dāng)癌基因作用，ZIC5的異常表達(dá)受miR-449家族調(diào)控，其在前列腺癌中表達(dá)水平顯著下降。ZIC5可能系潛在的靶向治療的靶基因。

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