鄭家地 鄭紅花 聶立銘

腦出血后，炎癥反應(yīng)和自由基損傷等可以導(dǎo)致細(xì)胞鈣超載，最終造成神經(jīng)損傷，銀杏內(nèi)酯B具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用，本研究觀察銀杏內(nèi)酯B對實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠神經(jīng)細(xì)胞水腫、細(xì)胞凋亡、腦代謝的影響，探討銀杏內(nèi)酯B對于腦出血后神經(jīng)保護(hù)作用的可能機(jī)制。

1.資料與方法

1.1 主要試劑及設(shè)備 Ⅶ型細(xì)菌膠原酶(SIGMA USA)，銀杏內(nèi)酯B(ABSIN)，細(xì)胞凋亡試劑盒由PROMEGA生物工程有限公司提供(Cat#7360),9.4T磁共振(BRUKER,瑞士)，KOPF型大鼠腦立體定位儀(美國KOPF公司)，微量注射器(上海飛鴿醫(yī)療器械有限公司)，牙科鉆，手術(shù)器械等。

1.2 研究方法

1.2.1 腦出血模型的建立：健康雄性SD大鼠，由廈門大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重250～300g，4%水合氯醛(400mg/kg)溶液腹腔注射麻醉，將大鼠俯臥位固定在立體定向儀上(KOPF USA)，根據(jù)大鼠大腦立體定位圖譜調(diào)整立體定向儀使門齒溝平面比耳間線平面低3.3mm,前囟和后囟基本上在同一平面上，將頭部背側(cè)的鼠毛剪去，皮膚消毒后縱行切開頭皮1cm，暴露顱骨，用30%雙氧水腐蝕顱骨上腱膜及顱骨外膜，暴露前囟；于前囟后0.2mm，中線右旁3mm，用牙科鉆鉆一直徑約1mm的圓孔；鉆孔后將0.4units的Ⅶ型細(xì)菌膠原酶(SIGMA,USA)溶于1μl生理鹽水中，采用微量加樣器沿鉆孔方向垂直進(jìn)針5.0mm，使用緩慢推進(jìn)器勻速將其推注入腦，術(shù)畢用石蠟封閉骨口，嚴(yán)密縫合皮膚切口，待動(dòng)物蘇醒后送回動(dòng)物房飼養(yǎng)。

1.2.2 腦含水量檢測：麻醉后斷頭取腦:將其從大腦縱裂切開，然后平均分成前中后三塊并稱其濕重，置于95℃烘箱中烘烤至恒重后稱取干重，根據(jù)下式計(jì)算腦組織含水量:(濕重-干重)/濕重×100%;取平均值做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.3 腦組織凋亡細(xì)胞的檢測：采用TUNEL(terminal deoxynucleotidy1 transferase mediated dUTP nick-end-labeling)法,操作按試劑盒說明書進(jìn)行,試劑盒由PROMEGA生物工程有限公司提供(Cat#7360),高倍鏡下(400倍)細(xì)胞核呈棕黃色著色為凋亡陽性細(xì)胞。高倍鏡下在雙側(cè)紋狀體區(qū)各隨機(jī)取5個(gè)視野,計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞。陽性對照用1mg/L DNA酶I 37℃孵育10分鐘,緩沖液中含有50mmol/L Tris,10mmol/L MgSO4,0.1mmol/L DTT,蒸餾水沖洗。陰性對照:以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替DNA末端標(biāo)記中的末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶及生物素標(biāo)記的dUTP。

1.2.4 MRI參數(shù)及后處理方法：采用BRUKER 9.4T超導(dǎo)MR成像系統(tǒng)，并用EWS影像后處理工作站處理圖像，4通道大鼠專用線圈。大鼠麻醉后仰臥位，頭置于線圈中央，毛巾覆蓋體表保溫。MRS：點(diǎn)分辨自旋回波波譜(point-resolved spectroscopy，PRESS)刺激回波采集樣式(stimulated echo acquisition mode，STEAM)，在T2橫斷位像定位，置于尾殼核層面(包括腦出血區(qū)及其周圍區(qū))，體素容積為3×3×3mm，掃描前自動(dòng)勻場，采集時(shí)間為20分鐘，在右側(cè)腦出血區(qū)周圍選取4～7mm2感興趣區(qū)，統(tǒng)計(jì)該區(qū)域的各代謝物波峰下面積。

1.2.5 干預(yù)組處理方法：干預(yù)組大鼠按20mg/kg銀杏內(nèi)酯B腹腔每日注射1次。對照組大鼠注射同體積的生理鹽水。所有大鼠放回籠中常規(guī)喂養(yǎng)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布采用兩樣本t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布采用Wilcoxon非參數(shù)檢驗(yàn)；兩組間比較采用單因素方差分析One-Way ANOVA，多組間比較采用LSD檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 腦出血模型的建立及大鼠追尾征 本研究中建立的大鼠腦出血模型，均有左側(cè)肢體活動(dòng)障礙，呈現(xiàn)追尾征。3天內(nèi)干預(yù)組及對照組各死亡1只，死亡時(shí)段數(shù)據(jù)缺失，其余大鼠功能障礙隨著銀杏內(nèi)酯B的應(yīng)用，偏癱癥狀得到改善。

2.2 腦組織含水量檢測 對照組[(82.52±0.86)%]與干預(yù)組[(81.45±0.54)%]比較，具有顯著性差異(P<0.05)。

2.3 細(xì)胞凋亡檢測 腦細(xì)胞凋亡檢測，干預(yù)組(52.47±2.66)與對照組(44.22±3.11)比較，具有顯著性差異(P<0.05)。見圖1。

2.41H-MRS檢測結(jié)果

2.4.1 假手術(shù)組：假手術(shù)組MRS波形基本與腦組織磁共振波譜曲線相同，NAA峰最為明顯；Cr與Cho峰曲線下面積相近；Lac峰大部分未見。

圖1 第3天干預(yù)組與對照組細(xì)胞凋亡情況

2.4.2 干預(yù)組與對照組：干預(yù)組與對照組的第1天、第3天在腦血腫周圍均可見到NAA下降，但兩組在第1天NAA的濃度及Lac濃度均差異無顯著意義(P>0.05)，在第3天、第7天，干預(yù)組的Lac濃度均較對照組明顯降低(56.78±3.22比66.47±3.56，50.33±4.05比55.78±4.07；均P<0.05)，而膽堿復(fù)合物(Cho)、肌酸(Cr)雖然濃度略有變化，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1、表2。

表1 干預(yù)組與對照組各時(shí)間點(diǎn)NAA與Lac濃度比較

表2 干預(yù)組與對照組各時(shí)間點(diǎn)Cho與Cr濃度比較(mmol/L)

3.討論

銀杏內(nèi)酯B(GB)為一種強(qiáng)力的血小板活化因子受體拮抗劑，其具有抗血小板聚集、抗炎、抗凋亡、免疫調(diào)節(jié)等作用，并且毒副作用低，作為神經(jīng)保護(hù)劑應(yīng)用于臨床[1]，其保護(hù)機(jī)制有待進(jìn)一步闡明，是目前研究熱點(diǎn)之一。腦出血后血腫周圍存在繼發(fā)性神經(jīng)損傷，包括腦水腫、細(xì)胞凋亡、自由基損傷等。應(yīng)用GB能明顯降低腦出血大鼠的神經(jīng)功能障礙，減輕腦出血后腦水腫;并且凋亡減輕，超微結(jié)構(gòu)明顯好轉(zhuǎn)[2]，GB也能使腦梗死面積含水量明顯降低，對局灶性腦缺血大鼠有直接的神經(jīng)保護(hù)作用，這些研究結(jié)論與本研究結(jié)果基本一致[3]。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，GB可以拮抗谷氨酸誘導(dǎo)的培養(yǎng)腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，GB可以拮抗谷氨酸誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與提高線粒體膜機(jī)能有關(guān)[5]。也有研究發(fā)現(xiàn)在小鼠胚胎干細(xì)胞中，GB激活JNK，caspse3和PAK2產(chǎn)生抗凋亡效應(yīng)。總之，GB可能通過降低體內(nèi)自由基和炎癥反應(yīng)影響多條信號通路，從而抑制腦出血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡，達(dá)到神經(jīng)保護(hù)作用。

磁共振波譜(MRS)為一種無創(chuàng)性研究活體組織生化代謝的影像技術(shù)，利用MR現(xiàn)象和化學(xué)移位作用進(jìn)行特定原子核及化合物的定量分析，已經(jīng)成為研究蛋白質(zhì)、核酸、多糖等生物大分子及組織、器官活體狀態(tài)的有力工具。近年來對MRS研究顯示[6]，MRS可檢測的腦組織的代謝產(chǎn)物主要有NAA，Lac，Cho和Cr。NAA可以作為反映神經(jīng)元功能狀況的內(nèi)標(biāo)物，被認(rèn)為是神經(jīng)病理狀態(tài)的生化標(biāo)志。NAA降低提示神經(jīng)元和突觸的損失及功能異常，但僅有腦功能失調(diào)而無神經(jīng)元死亡也可引起NAA的顯著丟失[7]。Lac可反映無氧酵解的情況，當(dāng)腦缺血、氧供減少、無氧酵解率增加時(shí)，Lac含量亦增加[8]。Cho峰及其含量增加可能是細(xì)胞合成或分泌量增加的反映。Cr峰是能量代謝的一種產(chǎn)物，通常將Cr作為參照波峰，進(jìn)行半定量分析。

本研究表明，GB3天亞組和7天亞組的N-乙酰天門冬氨酸(NAA)較對照組明顯升高(34.56±2.76比26.78±3.26，62.66±2.79比56.34±1.32；均P<0.05)，乳酸明顯降低(56.78±3.22比66.47±3.56，50.33±4.05比55.78±4.07；均P<0.05)，而膽堿復(fù)合物、肌酸差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。關(guān)于Cho和Cr，不同研究得到的結(jié)論也不相同[9]。Cr是能量的緩沖劑，一般比較穩(wěn)定，當(dāng)患者能量代謝不足時(shí)，其含量增加；如石金河[10]等指出，肌酸激酶與腦血管疾病密切相關(guān)，間接反映腦組織能力代謝的變化[11，12]。

綜上所述，GB可以通過減少腦組織含水量、減少細(xì)胞凋亡、改善腦代謝，從而起到神經(jīng)保護(hù)作用，也可以通過抗炎、對星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)、抑制興奮性誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷、免疫調(diào)節(jié)、在多種疾病的模型中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，但其神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)的內(nèi)在完整機(jī)制還有待于更多實(shí)驗(yàn)來探尋。

參考文獻(xiàn)

1 黃建,劉之榮.銀杏內(nèi)酯B的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制研究進(jìn)展[J].國際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)雜志,2014,41(6):559-562.

2 王登科,張海宇,劉海洋,等.銀杏葉提取物對大鼠腦出血后神經(jīng)元保護(hù)作用的研究[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志,2011,27(3):316-320.

3 黃賤英,孫建寧,梅世昌,等.銀杏內(nèi)酯B對缺血/再灌腦損傷大鼠的保護(hù)作用[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2008,24(2):269-272.

4 蔡衛(wèi)斌,臧穎,余明.銀杏內(nèi)酯B對谷氨酸誘導(dǎo)大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元氧化損傷的影響[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)科學(xué)版),2003,24(3):256-260.

5 郭夢翔,朱曉波,羅燕,等.銀杏內(nèi)酯B對谷氨酸誘導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)科學(xué)版),2008,29(6):690-694.

6 Nelson SJ,Graves E,Pirzkall A,et al.In vivo molecular imaging for planning radiation therapy of gliomas:an application of 1H MRSI[J].J Magn Reson Imaging,2002,16(4):464-476.DOI:10.1002/jmri.10183.

7 Demougeot C,Bertrand N,Prigent-Tessier A,et al.Reversible loss of N-acetyl-aspartate in rats subjected to long-term focal cerebral ischemia[J].J Cereb Blood Flow Metab,2003,23(4):482-489.DOI:10.1097/01.WCB.0000050066.57184.60.

8 Dani K A,A n L,H enn ing E C,et a1.Multivoxel M R spectroscopy in acute ischemic stroke comparison to the stroke protocol M R I[J].Stroke，2012，43 (11) ：2962-2967 .

10 石金河,戶瑞麗,楊亞勤,等.心電圖QT離散度與急性腦血管病患者血清酶學(xué)變化相關(guān)性研究[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2013,38(11):1341-1344.

11 Weidusehat N，Mao X，Beal MF，et al.Sex differences in cerebral energym etab-olism in Parkinson’s disease：aphosphoru s magnetic resonance spectroscopic imaging study[J].Parkinsonism Relat Disord,2014,20(5):545-548.doi:10.1016/j.parkreldis.2014.02.003.

12 Bakker F C,Klijn C J M,Jennekens-Schinkel A,et al.Cognitive Impairment Is Related to CerebralLactate in Patients With Carotid Artery Occlusion and Ipsilateral Transient Ischemic Attacks[J].Stroke,2003,34(6):1419-1424.DOI:10.1161/01.str.0000069725.09499.14.