李 怡，魏薇薇，聞?wù)?/p>

（浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山 316022）

微生物發(fā)酵技術(shù)得益于其條件溫和，充足的原產(chǎn)物來源，以及價(jià)格低廉、專一的產(chǎn)物、還有對(duì)環(huán)境污染小等特點(diǎn)，使得微生物發(fā)酵在諸多領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，比如在食品工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、農(nóng)業(yè)、環(huán)境保護(hù)等方面。形成了規(guī)模較大的發(fā)酵工業(yè)。在很多發(fā)達(dá)國家，國民生產(chǎn)總值的百分之五左右為發(fā)酵工業(yè)[1]。查閱相關(guān)文獻(xiàn)可知，纖維素酶、植酸酶、蛋白酶、果膠酶、葡聚糖酶、淀粉酶和木聚糖酶約十幾種酶類枯草芽孢桿菌都可以產(chǎn)生[2]?？莶菅挎邨U菌屬于一種安全菌株，美國食品藥品監(jiān)督管理局調(diào)查發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌的使用無安全隱患的存在。美國有關(guān)部門已經(jīng)批準(zhǔn)將其作為飼料的成分去飼養(yǎng)動(dòng)物。我國農(nóng)業(yè)部也允許將枯草芽孢桿菌作為飼料添加劑[3-4]。

隨近年來捕撈技術(shù)的改進(jìn)，我國魷魚的捕撈量也隨即增加。在魷魚的處理過程中會(huì)產(chǎn)生大部分的廢物，魷魚內(nèi)臟就占其中的很大比例，雖然是魷魚加工過程中產(chǎn)生的廢物，但是其所含營養(yǎng)卻是相當(dāng)豐富的，光魷魚內(nèi)臟所含的蛋白質(zhì)就達(dá)到了百分二十左右，脂肪含量和蛋白質(zhì)相當(dāng)。除此之外，還富含人體所需的氨基酸、牛磺酸以及一些微量元素，因此將魷魚內(nèi)臟進(jìn)行加工處理后再投放市場(chǎng)能達(dá)到不錯(cuò)的經(jīng)濟(jì)效益，還能夠緩解因魷魚加工所產(chǎn)生的大量廢物帶來的環(huán)境壓力。據(jù)了解，目前把魷魚內(nèi)臟加工制作成飼料的較多，因?yàn)槠浜胸S富的氨基酸。另外，也將魷魚內(nèi)臟制成醬油和天然調(diào)味品等[5]。但在我國，讓消費(fèi)者接受內(nèi)臟產(chǎn)品是一個(gè)不小的挑戰(zhàn)[6]，在我國將魷魚內(nèi)臟做成醬油的研究比較多，段杉等[7]、徐偉等[8]在這方面做了不少研究工作。早在上個(gè)世紀(jì)末就有學(xué)者發(fā)現(xiàn)研究魷魚內(nèi)臟具有很大的市場(chǎng)價(jià)值[9]，國外學(xué)者SATOH et al[10]研究發(fā)現(xiàn)魷魚內(nèi)臟作為飼料對(duì)黑巖魚具有很好的飼養(yǎng)效果。利用枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的酶類發(fā)酵魷魚內(nèi)臟下腳料，將蛋白質(zhì)降解為小分子肽類，其可作為魚飼料的輔助添加劑，也可混以其他物質(zhì)作為農(nóng)作物肥料，易被吸收[11]。試驗(yàn)通過研究枯草芽孢桿菌發(fā)酵魷魚內(nèi)臟的工藝優(yōu)化，用魷魚內(nèi)臟作為發(fā)酵底物，測(cè)定發(fā)酵液中的可溶性肽含量來衡量發(fā)酵效果，目的是為了提高魷魚內(nèi)臟的高值化利用以及為今后用枯草芽孢桿菌發(fā)酵海產(chǎn)品下腳料提供可供參考的文獻(xiàn)資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與培養(yǎng)基

枯草芽孢桿菌（保存于實(shí)驗(yàn)室），菌種擴(kuò)大培養(yǎng)基為：葡萄糖（碳源）、蛋白胨、酵母浸粉、磷酸二氫鉀、碳酸鈣、無菌水。發(fā)酵培養(yǎng)基組成為魷魚內(nèi)臟，無菌水，碳源。

1.1.2 主要試劑

Na2CO3、NaOH、無水CuSO4、酒石酸鉀鈉等試劑。（均為分析純）

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1600型紫外分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；THZ-82B氣浴恒溫震蕩器，金壇市醫(yī)療儀器廠；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；DGG-9140A型電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；YC-260L 4℃冰箱，中科美菱；FA1004N分析天平，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；TG20-WS離心機(jī)，長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)

根據(jù)1.1.1配方按比例制作枯草芽孢桿菌擴(kuò)大培養(yǎng)基，制備好后放入滅菌鍋中121℃滅菌30 min，滅菌完成后于超凈工作臺(tái)中冷卻至室溫，用接種環(huán)挑取保存于斜面的菌種一環(huán)接種于擴(kuò)大培養(yǎng)基中，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，得到種子液，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 發(fā)酵工藝

將保存在冰箱的下腳料流水解凍后稱取2 g作為發(fā)酵底物，然后加入一定比例的無菌水和碳源，最后將擴(kuò)大培養(yǎng)的發(fā)酵種子液在無菌環(huán)境下接種到下腳料底物中進(jìn)行單因素以及正交試驗(yàn)。發(fā)酵結(jié)束后利用福林酚法測(cè)定發(fā)酵液中可溶性肽的含量，并計(jì)算出結(jié)果。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在確定單因素水平之前做預(yù)實(shí)驗(yàn)，選取多個(gè)水平進(jìn)行單因素試驗(yàn)，通過試驗(yàn)結(jié)果分析確定最后的各個(gè)因素水平范圍，試驗(yàn)將選取碳源添加量、菌種接種量、料水比以及培養(yǎng)時(shí)間這4個(gè)因素作為試驗(yàn)的單因素，根據(jù)發(fā)酵液中可溶性肽含量來判斷各因素對(duì)發(fā)酵效果的影響[12]。

1.3.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)建立在前期單因素試驗(yàn)結(jié)果上，分析各因素對(duì)發(fā)酵效果的影響大小選取碳源接種量、料

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.1 Orthogonal experimental design

水比例、菌液接種量此三因素來設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，設(shè)計(jì)表見表1。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

發(fā)酵液中可溶性肽含量采用Folin-酚法進(jìn)行測(cè)定[13]。

2 結(jié)果與討論

2.1 枯草芽孢桿菌發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 枯草芽孢桿菌單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1.1 料水比單因素試驗(yàn)結(jié)果

考察料水比單因素對(duì)發(fā)酵效果的影響是因?yàn)樗謱?duì)微生物的生長也起到了關(guān)鍵的作用，將料水比設(shè)定為1:1、1:3、1:5、1:7、1:10，發(fā)酵液中菌液接種量為10%，發(fā)酵溫度37℃，放入恒溫培養(yǎng)中發(fā)酵1 d。采用福林酚法測(cè)定發(fā)酵液中可溶性肽的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1。

從圖1中可知，1:5和1:10的料水比得到可溶性肽含量值較高，綜合考慮，選擇料水比為1:5.

2.1.1.2 碳源接種量單因素試驗(yàn)結(jié)果

將發(fā)酵料水比設(shè)定為1:5，發(fā)酵液中菌液接種量為10%，發(fā)酵溫度37℃，放入恒溫培養(yǎng)中發(fā)酵1 d，將碳源添加量設(shè)定為2%、5%、7%、10%、12%，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵液中可溶性肽含量，結(jié)果如下圖2所示。

從圖2中可知，添加10%和12%的碳源的時(shí)候可溶性肽含量幾乎相同，考慮到節(jié)約成本，試驗(yàn)采用10%的碳源添加量。

2.1.1.3 菌液接種量單因素試驗(yàn)結(jié)果

菌液接種量是發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中一個(gè)重要的因素，接種過多或過少都會(huì)對(duì)發(fā)酵液中的可溶性肽含量有影響。因此為了確定合適的菌液接種量，本次試驗(yàn)將接種量定為5%、7%、10%、12%、15%進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果如圖3。

圖1 料水比對(duì)發(fā)酵液中可溶性肽含量的影響Fig.1 Effect of feed water ratio on soluble peptide content in fermentation broth

圖2 碳源添加量對(duì)發(fā)酵液中可溶性肽含量的影響Fig.2 Effect of carbon addition on soluble peptide content in fermentation broth

圖3 接種量對(duì)發(fā)酵液中可溶性肽含量的影響Fig.3 Effect of inoculum size on solublepeptide content in fermentation broth

圖4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)發(fā)酵液中可溶性肽含量的影響Fig.4 Effect of culture time on soluble peptide content in fermentation broth

從圖3中可知，可溶性肽的含量先是隨著接種量的增加而上升的，當(dāng)接種量達(dá)到12%時(shí)出現(xiàn)峰值，含量最高；5%的時(shí)候最低，分析其原因有可能是因?yàn)榻臃N量太少時(shí)沒有充分與底物結(jié)合，所以發(fā)酵效果較次，接種量太多導(dǎo)致菌種間生長競爭，生長過快導(dǎo)致營養(yǎng)缺乏，所以發(fā)酵液中可溶性肽含量也不高；故采用12%的接種量。

2.1.1.4 發(fā)酵時(shí)間單因素試驗(yàn)結(jié)果

為了探討最佳的發(fā)酵時(shí)間，試驗(yàn)將發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間設(shè)定為1 d、2 d、3 d、4 d、5 d進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果如圖4所示。

從圖4中可以看出發(fā)酵前4 d里發(fā)酵液中可溶性肽含量的變化不是很大，第5 d有較為明顯的下降，考慮到實(shí)際的需求，發(fā)酵時(shí)間越短越好，因此確定發(fā)酵時(shí)間為1 d。

2.1.2 枯草芽孢桿菌工藝優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.1.2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表2極差R分析結(jié)果可知，發(fā)酵液中可溶性肽含量的影響因素主次順序?yàn)椋毫纤龋窘臃N量＞碳源添加量，也就是料水比是影響枯草芽孢桿菌發(fā)酵魷魚內(nèi)臟發(fā)酵液中可溶性肽含量的重要因素，其次是接種量和碳源添加量。最優(yōu)組合為A2，B2，C3，即發(fā)酵的最佳條件：料水比為1:5，碳源添加量為10%，菌液接種量為12%，發(fā)酵時(shí)間為1 d。

2.2 討論

通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)可以看出，枯草芽孢桿菌發(fā)酵魷魚內(nèi)臟試驗(yàn)過程中，單因素試驗(yàn)結(jié)果和正交試驗(yàn)結(jié)果基本一致。對(duì)枯草芽孢桿菌單因素和正交試驗(yàn)結(jié)果的進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵產(chǎn)物可溶性肽含量可達(dá)到20.87 g/L。這主要是因?yàn)榭莶菅挎邨U菌能夠產(chǎn)生一系列酶系，產(chǎn)生的酶能夠?qū)Ⅳ滛~內(nèi)臟里面的一些成分降解，使得一些不可溶和難以吸收消化的大分子物質(zhì)降解為可吸收的小分子的多肽類，小分子蛋白類；從而使得發(fā)酵液中的可溶性肽含量會(huì)有所增加。已有的研究表明枯草芽孢桿菌可提高奧尼羅非魚[14]、凡納濱對(duì)蝦[15]和印度明對(duì)蝦的消化酶活性和飼料轉(zhuǎn)化率[16]。與此同時(shí)，其代謝過程中還能合成B族維生素及VE、VK等營養(yǎng)素，還能促進(jìn)Ca、P的吸收，提高動(dòng)物的生長性能[17]。

3 結(jié)論

將微生物發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用在處理海產(chǎn)品下腳料中，用單因素和正交試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)正交試驗(yàn)分析得到了各因素對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵魷魚內(nèi)臟下腳料的影響，獲得了最佳發(fā)酵工藝條件：菌液接種量為12%，料水比為1:5，碳源添加量為10%，發(fā)酵時(shí)間為1 d?？莶菅挎邨U菌在此組合下發(fā)酵魷魚內(nèi)臟，發(fā)酵液中可溶性肽含量達(dá)到20.871 8 g/L。由此可知，利用微生物對(duì)海產(chǎn)品加工過程中剩下的廢料進(jìn)行回收處理，不僅可以對(duì)其加工成具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的生物制品，同時(shí)也對(duì)環(huán)境起到一定的保護(hù)作用，符合現(xiàn)在的綠色環(huán)保發(fā)展理念；同時(shí)也豐富了微生物的研究內(nèi)容，對(duì)這一項(xiàng)技術(shù)所能應(yīng)用的領(lǐng)域及對(duì)象得到擴(kuò)大并提供相應(yīng)的資料文獻(xiàn)用以參考。

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