丁慧昕，施 慧，謝建軍，王庚申，汪 瑋，何 杰，許文軍

（1.浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海水增養(yǎng)殖重點實驗室，浙江舟山 316021；2.浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山 316022）

蝦肝腸胞蟲Enterocytozoon hepatopenaei（EHP）歸屬于孢子蟲綱Sporozoa，隱孢子蟲目Cryptosporidium，腸上皮微孢子蟲科，是目前凡納濱對蝦養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)的一種重要寄生蟲病原，主要寄生于對蝦肝胰腺小管的上皮細胞內(nèi)，已被證實與對蝦生長緩慢癥關(guān)系密切。其最早發(fā)現(xiàn)于泰國養(yǎng)殖的生長緩慢的斑節(jié)對蝦，感染該寄生蟲的對蝦往往吃料正常，不會發(fā)生爆發(fā)性死亡，但生長緩慢或停滯，并出現(xiàn)大小不一的情況[1]。自2013年以來，我國所有的凡納濱對蝦養(yǎng)殖主產(chǎn)區(qū)均已發(fā)現(xiàn)了蝦肝腸胞蟲病[2]，并造成重大危害，嚴重影響對蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康與持續(xù)發(fā)展。

EHP的個體微小，大小為（1.1±0.2）～（0.7±0.1）μm，臨床上普通的光學(xué)顯微鏡很難觀察或診斷，主要依靠實驗室檢測才可確診。關(guān)于EHP的檢測方法的研究報道較多，SANTHOSHKUMAR，et al[3]運用組織病理學(xué)方法觀察到了在人工感染試驗對蝦體內(nèi)處于不同發(fā)育階段的EHP；TANGPRASITTIPAP，et al[4]建立了套式PCR檢測法和地高辛標記核酸探針原位雜交法；劉珍等[2]將實時熒光定量PCR法運用于EHP的實驗室檢測；SUEBSING，et al[5]建立EHP的LAMP技術(shù)方法，使臨床檢測EHP更簡單、快速；但目前尚無有關(guān)EHP在養(yǎng)殖水環(huán)境中分布情況的報道。為了了解EHP在水環(huán)境中分布情況以及傳播途徑，本研究采用巢式PCR檢測方法，對舟山地區(qū)凡納濱對蝦養(yǎng)殖水環(huán)境中采集的其它水生生物以及水樣等樣本進行EHP檢測，初步分析了EHP在對蝦養(yǎng)殖水體環(huán)境中的分布情況；同時以不同方式保存的病蝦對健康對蝦進行了人工感染試驗，分析了EHP在養(yǎng)殖水環(huán)境中的傳播方式。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料

水樣分別為出現(xiàn)生長緩慢的對蝦養(yǎng)殖場進水、養(yǎng)殖塘水、養(yǎng)殖塘排水渠中尾水，生物樣本主要為養(yǎng)殖場排水渠中魚、蝦類和蟹類。EHP感染蝦采集自浙江省海洋水產(chǎn)研究所試驗場；人工感染試驗所用的健康凡納濱對蝦取自舟山市旭旺養(yǎng)殖場，體長為7.5±0.5 cm。

1.1.2 試劑

組織DNA提取試劑盒QlAampDNA Mini Kit購自Qiagen公司；高保真Ex Taq DNA聚合酶、dNTPs、DL 2000 Marker、UNIQ-10柱式膠回收試劑盒購買自TAKARA公司；其它均為國產(chǎn)分析純級試劑。

1.2 儀器和設(shè)備

實驗使用的主要儀器：AL204型電子天平，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；Centrifuge 5424R臺式冷凍離心機，德國Eppendorf公司；Nikon Eclipse 50i生物顯微鏡，美國尼康公司；Bio-Rad DNA Engine多槽PCR儀和Bio-Rad GDXI型凝膠成像系統(tǒng)，美國伯樂公司；漩渦振蕩器，德國IKA公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 養(yǎng)殖水環(huán)境樣本的采集

于2017年4月至2017年10月，分3批次采集，共4個種類的108個樣；其中，魚類共采集了鯔魚7尾，彈涂魚10尾；蟹類共采集寄居蟹11只，招潮蟹12只；蝦類采集綠籽蝦26尾，口蝦蛄1尾。將樣本冰鮮保存帶回實驗室，每種采樣信息和分析樣本數(shù)量見表1。

表1 養(yǎng)殖環(huán)境中生物采樣信息Tab.1 Biological sampling information in aquaculture environment

1.3.2 人工感染試驗方法

采用巢式PCR檢測健康蝦體內(nèi)EHP攜帶情況，經(jīng)PCR確認EHP核酸陰性后，暫養(yǎng)1周備用；感染用病蝦運用巢式PCR檢測EHP，確認EHP核酸陽性后，一部分病蝦-20℃凍存，一部分暫養(yǎng)備用。

從采集的健康凡納濱對蝦中挑選大小均一、體格健壯的對蝦用于感染實驗，試驗期間連續(xù)充氣，水溫為24～26℃。感染實驗共設(shè)A、B、C、D四組，每組均設(shè)立平行對照，A組投喂冰凍病蝦的肝胰腺組織，B組投喂鮮活病蝦的肝胰腺組織，C組為健康蝦與病蝦混合飼養(yǎng)，D組為對照組，每組24尾蝦。試驗期間前2周，A組和B組只投喂病蝦的肝胰腺組織，C組和D組投喂正常人工配合飼料，每日早晚投喂1次。實驗期間每天清理試驗對蝦的殘餌和排泄物，隔天換水1次。連續(xù)投喂兩周以后，全部投喂正常人工配合飼料，1周之后隨機取樣，每組3尾，每周取樣1次，共采集4周。

1.3.3 PCR模板制備

水樣本使用0.22 μm濾膜進行抽濾，濾膜用適量生理鹽水沖洗，洗液離心后棄上清，取沉淀提取DNA樣本；采集的魚樣本取腸道組織提取DNA樣本；采集的蝦蟹樣本和人工感染試驗組對蝦，取肝胰腺組織提取DNA樣本；上述樣本分別稱取20～25 mg，使用QlAamp DNA Mini Kit，按照說明書提取總基因組DNA。

1.3.4 巢式PCR擴增

樣品檢測主要采用亞太水產(chǎn)養(yǎng)殖中心網(wǎng)絡(luò)（NACA）推薦的巢式PCR檢測方法，引物包括一對外引物ExF/ExR 和一對內(nèi)引物 InF/InR：ExF：5′–TTG ACG TGA AGC AAT TGG AG–3′；ExR：5′–AAG CAG CAC AAT CCA CTC CT–3′；InF：5′–GGT GGG CAA AGA ATG AAA TC–3′；InR：5′–CGA GCG TAC TAT CCC CAG AG–3′，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系（25 μL）為：2.5 μL 10×buffer、2 μL dNTP（2.5 mM）、Primer 1 和 2（10 μM）各 0.25 μL、0.25 μL Taq DNA 聚合酶、5 μL DNA模板，用滅菌去離子水補充反應(yīng)總體積至25 μL，將混合物置PCR儀中反應(yīng)。PCR循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min后開始循環(huán)，94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，共35個循環(huán)，最后72℃延伸7 min。取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外凝膠成像儀中照相記錄。二次PCR模板為一次PCR擴增產(chǎn)物，PCR反應(yīng)體系及循環(huán)參數(shù)同一次PCR，獲得的PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行序列測定。

2 結(jié)果

2.1 養(yǎng)殖場采集樣品檢測結(jié)果

從攜帶EHP對蝦養(yǎng)殖塘中采集的水樣，經(jīng)PCR檢測，EHP均呈核酸陽性，但養(yǎng)殖塘進水口和排水渠中采集的水樣未有EHP檢出，采集的水生生物樣本中蝦和蟹類的部分樣本PCR檢測EHP呈核酸陽性，采集的魚類樣本未有EHP檢測，具體結(jié)果見表2。

表2 養(yǎng)殖環(huán)境采集樣品的PCR結(jié)果以及陽性檢出率Tab.2 Detection of EHP in samples of aquaculture environment by PCR and positive rates

2.2 樣品檢測基因擴增測序結(jié)果

采集樣本的二次PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后,在250～500 bp處可見特異性單一條帶。將獲得的PCR擴增產(chǎn)物進行序列測定，應(yīng)用DNAMAN軟件進行比對分析,獲得一個223 bp大小的基因片段。該序列經(jīng)BLAST同源檢索分析,與TANGPRASITTIPAP，et al[4]之前報道的感染斑節(jié)對蝦Penaeus monodon的EHP的基因序列（KF362130）結(jié)果一致。

圖1 養(yǎng)殖場采集蝦、蟹類樣本EHP PCR檢測結(jié)果Fig.1 Detected results of the E.hepatopenaei infection of P.vannamei samples by PCR

2.3 人工感染實驗樣品檢測結(jié)果

病蝦肝胰腺組織投喂組投喂2周后停止投喂，改為投喂正常飼料，1周后開始取樣，每隔7 d取樣1次進行PCR檢測，前3次每次3尾，最后一次6尾，共計24個樣本，陽性檢出率為12.5%；混合飼養(yǎng)組混養(yǎng)1周后開始取樣，7 d取樣1次，每次3尾，共取樣5次，共計24個樣本，陽性檢出率為54.2%；對照組取樣次數(shù)和尾數(shù)同混合飼養(yǎng)組，未有EHP檢出，結(jié)果見表3。

3 討論

微孢子蟲是一類古老的細胞內(nèi)寄生微生物，所有微孢子蟲的生活史均起始于成熟孢子在適當環(huán)境下擠出極絲，釋放出具有侵染性的孢原質(zhì)，孢子在被寄主吞入消化道后迅速活化并在寄主體內(nèi)迅速增殖并繼續(xù)侵染[6-7]。TOURTIP，et al[8]研究發(fā)現(xiàn)EHP在斑節(jié)對蝦的肝胰腺管上皮細胞中發(fā)育成成熟的帶有極絲的孢子。本研究分別從攜帶EHP對蝦的養(yǎng)殖水體、蝦塘進水口及排水渠中均采集了水和生物樣本，PCR檢測結(jié)果顯示，發(fā)病蝦塘中水體中EHP陽性檢出率100%，雖然蝦塘的進水口和排水渠水樣本中未有檢出EHP，但排水渠采集的蝦蟹等甲殼類樣本中檢出了EHP。在人工感染試驗中，與健康蝦和病蝦混合飼養(yǎng)組陽性檢出率54.2%相比，冰凍或活蝦肝胰腺組織投喂組EHP陽性率檢出率相對比較低，分別只有12.5%和45.8%。這可能與孢子蟲的生活史特征也有關(guān)聯(lián)，由于病蝦體內(nèi)EHP不可能都處于成熟階段，在養(yǎng)殖試驗過程中，這些未成熟的EHP會繼續(xù)發(fā)育成熟，從而形成出更多成熟孢子并釋放到養(yǎng)殖環(huán)境中，增加了混養(yǎng)的健康蝦接觸這些具有侵染性的孢子的機會，而投喂冰凍或活蝦肝胰腺組織組，投喂的組織中成熟孢子有限，健康蝦攝食到侵染性孢子的機會少，降低了感染機率。試驗結(jié)果說明EHP感染對蝦后在蝦肝胰腺管細胞內(nèi)形成孢原質(zhì)，成熟后又通過糞便排出體外，在水環(huán)境中形成孢子體，散在分布于水體或附著于藻類、碎屑、飼料表面以及池壁和底泥環(huán)境中，孢子可在養(yǎng)殖環(huán)境中累積，從而導(dǎo)致疫情的傳播。

表3 人工感染樣品的PCR結(jié)果以及陽性檢出率Tab.3 Detection of EHP in samples of artificial infection by PCR and positive rates

圖2 凡納濱對蝦樣本EHP PCR檢測結(jié)果Fig.2 Detected results of the E.hepatopenaei infection of P.vannamei samples by PCR

本試驗采集了感染EHP養(yǎng)殖塘排水渠中的蝦、蟹及魚類等水生動物樣本進行EHP攜帶情況檢測，結(jié)果在蝦和蟹類樣本中檢出了EHP，但采集的所有魚類樣本中并未有EHP檢出。本試驗結(jié)果表明對蝦可以通過攝食攜帶EHP的對蝦直接感染EHP，結(jié)果與劉珍等[2]試驗結(jié)果相同。王維娜等[6]認為感染對蝦的微孢子蟲其中間宿主主要是各種魚類，但本試驗結(jié)果表明EHP的增殖并不需要中間宿主，但不排除魚類是EHP傳播過程中宿主的可能性。本研究中對蝦塘進水口和排水渠水樣中沒有檢測出EHP，是因為進水口和排水渠均為相對開放的的一個水環(huán)境，且流速一般比較大，附著孢子的浮游生物極易隨流水進入外海，所以進水口和排水渠水樣相對養(yǎng)殖塘比較難檢測到EHP。

微孢子蟲表面包裹著一層致密特殊結(jié)構(gòu)，使得微孢子蟲能抵御外界環(huán)境、維持自身形態(tài)和滲透壓等方面發(fā)揮著重要作用。游信毅等[9]利用10%的甘油、乙二醇、水等作為冷凍保護劑，將東方蜜蜂微孢子蟲的孢子在-80℃保存5個月后對意蜂工蜂進行感染，結(jié)果幾種冷凍保存劑保存的孢子都能夠侵染意蜂。本試驗中攝食冷凍保存的病蝦肝胰腺組織健康蝦在一段時間后，部分對蝦肝胰腺EHP檢測呈核酸陽性，但冰凍組總陽性檢出率低于鮮活病蝦肝胰腺組織投喂組，說明低溫環(huán)境使部分EHP喪失了侵染性，但仍然有部分EHP可以存活并仍具有感染力，結(jié)果與劉珍等[10]的實驗結(jié)果吻合。JAROENLAK，et al[10]研究發(fā)現(xiàn)輪蟲和鹵蟲可以攜帶EHP，而兩者又是對蝦苗種生產(chǎn)中主要餌料，這將增加對蝦感染EHP的可能性，因此建議在養(yǎng)殖生產(chǎn)中應(yīng)對投喂的鮮活餌料進行巴氏消毒處理，以預(yù)防對蝦感染EHP。劉珍等[11]和陳祿芝等[12]研究認為對蝦EHP的載量與養(yǎng)殖環(huán)境有緊密聯(lián)系，環(huán)境不同其EHP的載量指數(shù)不同。目前EHP對養(yǎng)殖對蝦的危害程度還不十分清楚，而感染EHP的對蝦缺乏可供判斷的特征性臨床病征，只有通過PCR等實驗室檢測手段才可以確診，同時由于EHP無有效治療措施，因此在對蝦養(yǎng)殖過程中，對養(yǎng)殖水體、飼養(yǎng)餌料以及養(yǎng)殖尾水等環(huán)境因素進行嚴格把關(guān)，對控制對蝦感染EHP病原極為重要。

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