鄢少聰，應(yīng)學(xué)明

景德鎮(zhèn)市第一人民醫(yī)院腫瘤科，江西 景德鎮(zhèn) 333000

約10%的成人惡性腫瘤患者出現(xiàn)有癥狀的腦轉(zhuǎn)移，且該比例仍在上升[1-2]。肺癌是中國(guó)目前最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率均呈逐年上升趨勢(shì)，而腦部轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致肺癌患者治療失敗和死亡的常見(jiàn)原因[3-4]。血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）對(duì)維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有重要意義[5-6]，跨膜蛋白claudin 5、occludin及胞質(zhì)附著蛋白ZO-1是BBB緊密連接的主要組成部分，其表達(dá)水平的降低或缺失可能與腦轉(zhuǎn)移瘤的發(fā)生密切相關(guān)。本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤組織和正常腦組織中claudin 5、occludin及ZO-1的表達(dá)情況，旨在探討其與患者臨床特征的關(guān)系[7-8]，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

收集2008年1月至2014年6月景德鎮(zhèn)市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科收治的63例肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤患者的術(shù)后存檔石蠟標(biāo)本為轉(zhuǎn)移組。所有患者均經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診為肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤，且術(shù)前均未接受化療或放療。63例肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤患者中，腺癌25例，鱗癌14例，小細(xì)胞癌22例，腺鱗癌2例；年齡43～71歲，中位年齡57歲。另外，收集同期于本院行顳葉切除術(shù)的28例癲癇患者的術(shù)后正常腦組織石蠟標(biāo)本為對(duì)照組。兩組患者的性別、年齡等資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05），具有可比性，詳見(jiàn)表1。

1.2 主要試劑

兔抗claudin 5（1∶100，ab15106）、occludin（1∶100，ab31721）抗體及羊抗ZO-1（1∶200，ab190085）抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔、鼠抗山羊二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；DAB試劑盒、Envision試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

表1 兩組患者的基本臨床特征[n（%）]

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

蠟塊采用連續(xù)切片，厚度3 μm，按照Envision試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行免疫組化染色；每種蛋白染色均設(shè)立轉(zhuǎn)移組及對(duì)照組，以磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）代替一抗作為陰性對(duì)照，以預(yù)實(shí)驗(yàn)反復(fù)多次證實(shí)均呈陽(yáng)性的肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判斷

顯微鏡下每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野，判定染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比。染色強(qiáng)度：不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比：0～19%為0分，20%～39%為1分，40%～59%為2分，≥60%為3分。免疫組化染色結(jié)果由兩位資深病理學(xué)專(zhuān)家共同進(jìn)行評(píng)定，以?xún)身?xiàng)評(píng)分之積為最終得分，并定義如下：0～4分為低表達(dá)，5～9分為高表達(dá)。

1.5 生存隨訪(fǎng)

從術(shù)后病理診斷為肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤之日開(kāi)始，利用記錄在案的電話(huà)，對(duì)63例患者進(jìn)行隨訪(fǎng)，隨訪(fǎng)截至患者死亡、失訪(fǎng)或2015年12月31日，中位隨訪(fǎng)時(shí)間為18個(gè)月，其中4例患者失訪(fǎng)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析；生存分析采用Kaplan-Meier法。以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 claudin 5、occludin及ZO-1表達(dá)率的比較

免疫組化染色結(jié)果顯示：claudin 5、occludin、ZO-1陽(yáng)性表達(dá)信號(hào)為棕黃色顆粒，均主要定位于腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上，另可見(jiàn)少數(shù)星型膠質(zhì)細(xì)胞著色，詳見(jiàn)圖1。claudin 5、occludin、ZO-1在正常腦組織中的高表達(dá)率分別為50.0%、57.1%、75.0%，均高于肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤組織的25.4%、34.9%、33.3%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05），詳見(jiàn)表2。

圖1 claudin 5、occludin、ZO-1在不同組織中的表達(dá)情況（Envision法，×400）

2.2 claudin 5、occludin、ZO-1蛋白表達(dá)與肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤患者臨床特征的關(guān)系

claudin 5、occludin、ZO-1蛋白的表達(dá)與肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤患者的年齡、病灶個(gè)數(shù)有關(guān)（P﹤0.05），其中≥60歲、病灶單發(fā)患者腦轉(zhuǎn)移瘤組織中claudin 5、occludin、ZO-1蛋白的高表達(dá)率均分別高于﹤60歲、病灶多發(fā)的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。不同性別、腫瘤直徑、病理類(lèi)型患者腦轉(zhuǎn)移瘤組織中claudin 5、occludin、ZO-1蛋白的表達(dá)情況比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）。（表3）

2.3 肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤組織中claudin 5、occludin及ZO-1的相關(guān)性

Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示：肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤組織中claudin 5與occludin的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.338，P=0.007）；claudin 5與ZO-1的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.284，P=0.024）；occludin與ZO-1的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.259，P=0.040）。

表2 不同組織中claudin 5、occludin、ZO-1蛋白表達(dá)情況的比較[n（%）]

表3 claudin 5、occludin、ZO-1蛋白表達(dá)與肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤患者臨床特征的關(guān)系[n（%）]

2.4 claudin 5、occludin、ZO-1低表達(dá)組與高表達(dá)組肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤患者的生存情況比較

63例肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤患者中，claudin 5低表達(dá)與高表達(dá)患者的中位總生存期分別為6.3個(gè)月和8.2個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.43，P﹤0.01）；occludin低表達(dá)與高表達(dá)患者的中位總生存期分別為5.0個(gè)月和8.2個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.26，P﹤0.01）；ZO-1低表達(dá)與高表達(dá)患者的中位總生存期分別為6.3個(gè)月和7.8個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.70，P﹤0.01）。（圖2～圖4）

3 討論

BBB是由無(wú)窗孔的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及其間的緊密連接（tight junction，TJ）、星形膠質(zhì)細(xì)胞足突、細(xì)胞基膜和周細(xì)胞共同組成的一個(gè)復(fù)合體[9]，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及其間的TJ是該復(fù)合體的主要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、維持上皮極性、細(xì)胞增殖分化、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等重要過(guò)程[10]，是血腦間物質(zhì)交換的第一道屏障，也是腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散進(jìn)入腦部的必經(jīng)之路。

圖4 ZO-1高表達(dá)組與低表達(dá)組的生存曲線(xiàn)圖

Claudin是TJ的主要構(gòu)成成分，通過(guò)ZO-1連接于肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架[11-12]，是決定BBB通透性的關(guān)鍵因素[13]。在腦微血管循環(huán)內(nèi)皮系統(tǒng)中，claudin 5表達(dá)豐富，有研究認(rèn)為claudin 5是構(gòu)成BBB的主要跨膜蛋白[14-15]。occludin是緊密連接的主要結(jié)構(gòu)蛋白，是第一個(gè)被分離出來(lái)的完整的膜蛋白[16]。相關(guān)研究顯示，occludin在腦組織血管內(nèi)皮的表達(dá)明顯高于非神經(jīng)組織的血管內(nèi)皮，這也是BBB通透性明顯低于其他血屏障的重要原因[17-18]。ZO-1通過(guò)與其同源異構(gòu)體ZO-2、ZO-3形成復(fù)合體，為T(mén)J的多種跨膜蛋白及胞質(zhì)蛋白搭建腳手架樣平臺(tái)[19]，多數(shù)情況下，只要ZO-1受到破壞，TJ的功能也會(huì)隨之發(fā)生變化，因此，ZO-1常被作為評(píng)估機(jī)體內(nèi)各種組織TJ屏障功能和通透性功能的指標(biāo)[20-21]。緊密連接結(jié)構(gòu)與功能的變化是多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病病理、生理變化的核心過(guò)程。

本研究結(jié)果顯示，claudin 5、occludin、ZO-1在肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤組織中的高表達(dá)率均較正常腦組織降低，提示3種蛋白的表達(dá)減少可能與肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤的發(fā)生有關(guān)。研究顯示，claudin 5、occludin、ZO-1在多種腫瘤組織中表達(dá)異常，如在胰腺癌的進(jìn)展中，occludin表達(dá)下調(diào)與腫瘤細(xì)胞的侵襲性有著密切關(guān)系[22]。Ni等[23]的研究顯示，NSCLC組織中，ZO-1高表達(dá)率低于癌旁組織（66.35%vs 83.51%，P﹤0.05），且ZO-1 mRNA的表達(dá)水平也低于癌旁組織（0.951±0.556 vs 1.752±1.094，P﹤0.05）。但 Paschoud等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌中能檢測(cè)到claudin 5、occludin、ZO-1的表達(dá)，而在鱗癌中只能檢測(cè)到ZO-1表達(dá)，提示不同的緊密連接蛋白可能經(jīng)不同的通路參與肺癌的發(fā)生、發(fā)展。在對(duì)胃癌的研究中，發(fā)現(xiàn)幽門(mén)螺桿菌引起胃癌的一種可能機(jī)制是通過(guò)激活MLC激酶使MLC磷酸化，破壞claudin 5，進(jìn)而引起胃上皮細(xì)胞的旁滲透增加[25]。另外，occludin、ZO-1表達(dá)下降可引起腸道菌群異位，導(dǎo)致胃癌惡病質(zhì)的發(fā)生[26]。Wu等[27]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌腦轉(zhuǎn)移瘤發(fā)生過(guò)程中，基質(zhì)金屬蛋白酶-1（matrix metalloproteinase-1，MMP1）通過(guò)降低 claudin、occludin的表達(dá)，使BBB的屏障功能減弱。MMP抑制藥可阻止TJ的退化，減弱BBB的破壞，可作為腦轉(zhuǎn)移瘤治療的一個(gè)方向[28]。

本研究發(fā)現(xiàn)claudin 5、occludin、ZO-1的異常表達(dá)與患者的年齡、病灶個(gè)數(shù)有關(guān)，其中﹤60歲組患者3種蛋白的高表達(dá)率低于≥60歲組患者，病灶個(gè)數(shù)越多的患者，claudin 5、occludin、ZO-1的高表達(dá)率越低。在食管癌中，claudin 5在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)水平高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組[29]，國(guó)內(nèi)學(xué)者汪淵等[30]研究發(fā)現(xiàn)，occludin、ZO-1的異常表達(dá)與食管鱗癌的腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，隨著分化程度降低，蛋白表達(dá)逐漸減少，且無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。Ohtani等[31]則發(fā)現(xiàn)，緊密連接蛋白o(hù)ccludin、ZO-1與胃癌細(xì)胞的侵襲性相關(guān)。但在交界性惡性卵巢腫瘤中，有研究發(fā)現(xiàn)，CA125、TATI的表達(dá)水平與claudin 5呈正相關(guān)，且腹腔積液的發(fā)生率與claudin 5的表達(dá)水平有關(guān)[32]。腦轉(zhuǎn)移瘤好發(fā)于45～60歲人群，男性多于女性，70%～80%屬于多發(fā)。本研究中，3種蛋白在﹤60歲組及多發(fā)者中高表達(dá)率低，但在性別方面的表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由此說(shuō)明，claudin 5、occludin、ZO-1的表達(dá)水平與腦轉(zhuǎn)移瘤的流行病學(xué)特點(diǎn)大致相符。

另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤患者中，claudin 5、occludin、ZO-1高表達(dá)患者的中位生存時(shí)間更長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.01）。而Nissi等[32]的研究也得出類(lèi)似的結(jié)果，ZO-1高表達(dá)組肺癌患者的5年生存率較低或無(wú)表達(dá)組患者高（P﹤0.001）。這意味著claudin 5、occludin、ZO-1可能是與肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤患者生存期密切相關(guān)的指標(biāo)，但是否能作為臨床預(yù)后的決定性因素，還需要進(jìn)一步研究。

目前，有關(guān)緊密連接蛋白與各種腫瘤發(fā)生關(guān)系的研究十分熱門(mén)，而緊密連接蛋白與BBB的關(guān)系也很密切，但有關(guān)claudin 5、occludin、ZO-1與肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究卻鮮有報(bào)道。綜上所述，腦血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接蛋白claudin 5、occludin、ZO-1表達(dá)減少或缺失，使BBB的結(jié)構(gòu)功能受到破壞，為腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移提供了可能，是肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤發(fā)生的可能機(jī)制，但仍有待更深入的研究證實(shí)。

參考文獻(xiàn)

[1]Eichler AF,Chung E,Kodack DP,et al.The biology of brain metastases-translation to new therapies[J].Nat Rev Clin Oncol,2011,8(6):344-356.

[2]Ortuzar W,Hanna N,Pennella E,et al.Brain metastases as the primary site of relapse in two randomized phase III pemetrexed trials in advanced non-small-cell lung cancer[J].Clin Lung Cancer,2012,13(1):24-30.

[3]Dolecek TA,Propp JM,Stroup NE,et al.CBTRUS statistical report:primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2005-2009[J].Neuro-oncology,2012,14(Suppl 5):v1-49.

[4]Arribalzaga EB.New tumor,node,metastasis staging system for lung cancer[J].J Thorac Oncol,2009,4(10):1301;author reply 1301-1302.

[5]Jia W,Lu R,Martin TA,et al.The role of claudin-5 in blood-brain barrier(BBB)and brain metastases(review)[J].Mol Med Rep,2014,9(3):779-785.

[6]Wilhelm I,Molnár J,Fazakas C,et al.Role of the bloodbrain barrier in the formation of brain metastases[J].Int J Mol Sci,2013,14(1):1383-1411.

[7]張駿,張福林.63例肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤的病理分析及免疫組織化學(xué)研究[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,1992,15(3):135-137.

[8]胡玲.肺癌腦轉(zhuǎn)移相關(guān)分子及其作用機(jī)制的研究[D].西安:第四軍醫(yī)大學(xué),2008.

[9]Correale J,Villa A.Cellular elements of the blood-brain barrier[J].Neurochem Res,2009,34(12):2067-2077.

[10]Piontek J,Winkler L,Wolburg H,et al.Formation of tight junction:determinants of homophilic interaction between classic claudins[J].FASEB J,2008,22(1):146-158.

[11]Markov AG.Claudins as tight junction proteins:the molecular element of paracellular transport[J].Ross Fiziol Zh Im I M Sechenova,2013,99(2):175-195.

[12]Kollmar R,Nakamura SK,Kappler JA,et al.Expression and phylogeny of claudins in vertebrate primordia[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(18):10196-10201.

[13]Liu C,Wu J,Zou M H.Activation of AMP-activated protein kinase alleviates High-glucose-induced dysfunction of brain microvascular endothelial cell tight-junction dy-namics[J].Free Radical Biology and Medicine,2012,53(6):1213-1221.

[14]Cooper I,Cohen-Kashi-Malina K,Teichberg VI.Claudin-5 expression in in vitro models of the blood-brain barrier[J].Methods Mol Biol,2011,762:347-354.

[15]Li B,Li Y,Liu K,et al.High glucose decreases claudins-5 and-11 in cardiac microvascular endothelial cells:Antagonistic effects of tongxinluo[J].Endocr Res,2017,42(1):15-21.

[16]Liu WY,Wang ZB,Zhang LC,et al.Tight junction in blood-brain barrier:an overview of structure,regulation,and regulator substances[J].CNS Neurosci Ther,2012,18(8):609-615.

[17]王靜娥,田國(guó)萍,周進(jìn),等.大鼠腦缺血時(shí)緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin和claudin-5表達(dá)的變化[J].解剖科學(xué)進(jìn)展,2010,16(2):149-152.

[18]Oh-oka K,Kono H,Ishimaru K,et al.Expressions of tight junction proteins occludin and claudin-1 are under the circadian control in the mouse large intestine:implications in intestinal permeability and susceptibility to colitis[J].PLoS One,2014,9(5):e98016.

[19]廖華寧,汪寧,王艷.緊密連接蛋白與血腦屏障[J].安徽醫(yī)藥,2012,16(3):377-379.

[20]Müller SL,Portwich M,Schmidt A,et al.The tight junction protein occludin and the adherens junction protein alpha-catenin share a common interaction mechanism with ZO-1[J].J Biol Chem,2005,280(5):3747-3756.

[21]Nesmiyanov PP,Tolkachev BE,Strygin AV.ZO-1 expression shows prognostic value in chronic B cell leukemia[J].Immunobiology,2016,221(1):6-11.

[22]Cravo AS,Carter E,Erkan M,et al.Hippo pathway elements Co-localize with Occludin:A possible sensor system in pancreatic epithelial cells[J].Tissue Barriers,2015,3(3):e1037948.

[23]Ni S,Xu L,Huang J,et al.Increased ZO-1 expression predicts valuable prognosis in non-small cell lung cancer[J].Int J Clin Exp Pathol,2013,6(12):2887-2895.

[24]Paschoud S,Bongiovanni M,Pache JC,et al.Claudin-1 and claudin-5 expression patterns differentiate lung squamous cell carcinomas from adenocarcinomas[J].Mod Pathol,2007,20(9):947-954.

[25]Fedwick JP,Lapointe TK,Meddings JB,et al.Helicobacter pylori activates myosin light-chain kinase to disrupt claudin-4 and claudin-5 and increase epithelial permeability[J].Infect Immun,2005,73(12):7844-7852.

[26]Jiang Y,Guo C,Zhang D,et al.The altered tight junctions:an important gateway of bacterial translocation in cachexia patients with advanced gastric cancer[J].J Interferon Cytokine Res,2014,34(7):518-525.

[27]Wu K,Fukuda K,Xing F,et al.Roles of the cyclooxygenase 2 matrix metalloproteinase 1 pathway in brain metastasis of breast cancer[J].J Biol Chem,2015,290(15):9842-9854.

[28]Yang Y,Rosenberg GA.MMP-mediated disruption of claudin-5 in the blood-brain barrier of rat brain after cerebral ischemia[J].Methods Mol Biol,2011,762:333-345.

[29]Chiba T,Kawachi H,Kawano T,et al.Independent histological risk factors for lymph node metastasis of superficial esophageal squamous cell carcinoma;implication of claudin-5 immunohistochemistry for expanding the indications of endoscopic resection[J].Dis Esophagus,2010,23(5):398-407.

[30]汪淵,朱克超,葛騰飛.食管鱗狀細(xì)胞癌中緊密連接蛋白Occludin、ZO-1的表達(dá)及其臨床意義[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2012,47(5):537-540.

[31]Ohtani S,Terashima M,Satoh J,et al.Expression of tightjunction-associated proteins in human gastric cancer:downregulation of claudin-4 correlates with tumor aggressiveness and survival[J].Gastric Cancer,2009,12(1):43-51.

[32]Nissi R,Talvensaari-Mattila A,Kuvaja P,et al.Claudin-5 is associated with elevated TATI and CA125 levels in mucinous ovarian borderline tumors[J].Anticancer Res,2015,35(2):973-976.