高立偉，蘭守麗，閆江濤，左一凡，武素芳，張暉

平煤神馬醫(yī)療集團(tuán)總醫(yī)院腫瘤二區(qū)（胸部腫瘤科），河南 平頂山 467000

肺癌是常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，近年來(lái)，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)[1-2]。肺癌的發(fā)生及發(fā)展是一個(gè)多基因、多階段的過(guò)程，因此，研究肺癌的發(fā)病原因及發(fā)病機(jī)制具有重要的意義。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是在生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的由19～25個(gè)核苷酸組成的一類(lèi)小分子RNA，近些年來(lái)在腫瘤中的作用已受到廣泛關(guān)注，已有多項(xiàng)研究顯示，miRNA與肺癌的發(fā)生發(fā)展、預(yù)后及診斷治療關(guān)系密切，如低表達(dá)的miRNA-21可以抑制肺癌細(xì)胞的增殖及分化，并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[3-4]；外周血中miRNA-143的含量可用于非小細(xì)胞肺癌的早期診斷及預(yù)后判斷[5]。miRNA-335定位于人染色體7q32.2，研究顯示，miRNA-335在乳腺癌、肺癌中呈現(xiàn)低表達(dá)，其高表達(dá)可降低腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及侵襲能力[6]。而miRNA-335在結(jié)腸癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及侵襲，說(shuō)明miRNA-335在不同腫瘤組織中發(fā)揮著不同的作用[7]。為了研究miRNA-335在肺癌中的作用，筆者利用miRNA-335的模擬物mimics轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，觀(guān)察細(xì)胞的增殖及凋亡情況，并進(jìn)一步研究其作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺癌A549細(xì)胞購(gòu)自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)室。胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）和碘化丙錠（PI）試劑盒均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；RNA提取試劑盒、LipofectamineTM2000試劑均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本Takara公司；survivin、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

人肺癌A549細(xì)胞在37℃、5%CO2、95%飽和濕度的恒溫孵育箱中用含10%胎牛血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。每2～3天換液1次，細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分為3組，即對(duì)照組（不作任何處理）、空轉(zhuǎn)染組（轉(zhuǎn)染空載體）、過(guò)表達(dá)組（轉(zhuǎn)染miRNA-335 mimics）。轉(zhuǎn)染嚴(yán)格按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.3 RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果

采用反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。取轉(zhuǎn)染48 h的上述3組細(xì)胞，采用Trizol法提取細(xì)胞中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄總RNA為cDNA。參照GenBank中的基因序列，利用Primer premier 6.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)目的基因miRNA-335及內(nèi)參基因U6的RTPCR引物，以cDNA為模板，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增。所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。應(yīng)用2-△△Ct法計(jì)算miRNA-335的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.4 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖

人肺癌A549細(xì)胞以1×104/ml的濃度接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入100 μl，每孔設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行同步化處理，根據(jù)上述分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染，取轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，在每孔細(xì)胞中加入10 μl的CCK8溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，利用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)的吸光度（absorbance，A）。計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=（轉(zhuǎn)染組細(xì)胞A值/對(duì)照組細(xì)胞A值）×100%。其中，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

細(xì)胞分組同1.2，取轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，加入預(yù)冷的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌細(xì)胞，胰蛋白酶消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，根據(jù)細(xì)胞凋亡試劑盒的操作說(shuō)明檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)survivin蛋白表達(dá)

收集轉(zhuǎn)染48 h的上述3組細(xì)胞，加入適量的細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞中的蛋白，使用BCA試劑盒檢測(cè)提取蛋白的濃度，蛋白樣品與上樣緩沖液按照1∶5的比例充分混勻后置于100℃孵育器內(nèi)煮沸變性10 min，每泳道30 μg蛋白樣品，10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離，半干法聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）轉(zhuǎn)染，5%的脫脂奶粉封閉，加入一抗（survivin抗體按照1∶500稀釋?zhuān)珿APDH抗體按照1∶1000稀釋?zhuān)?℃過(guò)夜，洗膜后加入1∶5000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，室溫孵育1 h，洗膜后增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（enhanced chemiluminecence，ECL）顯色，X線(xiàn)片曝光，顯影，定影。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人肺癌A549細(xì)胞中miRNA-335的mRNA表達(dá)

對(duì)照組、空轉(zhuǎn)染組及過(guò)表達(dá)組miRNA-335的mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為（1.00±0.18）、（1.09±0.16）、（7.79±0.59），3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=335.501，P﹤0.05）。其中，空轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組miRNA-335的mRNA表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）；過(guò)表達(dá)組miRNA-335的mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。（圖1）

圖1 3組細(xì)胞中miRNA-335的mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.2 過(guò)表達(dá)miRNA-335對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

對(duì)照組、空轉(zhuǎn)染組和過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞存活率分別為（100.00±2.36）%、（96.56±3.46）%、（65.54±5.35）%，3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=70.236，P﹤0.05）。其中，空轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組的細(xì)胞存活率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05），而過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞存活率低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。（圖2）

圖2 過(guò)表達(dá)miRNA-335對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

2.3 過(guò)表達(dá)miRNA-335對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

對(duì)照組、空轉(zhuǎn)染組和過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞凋亡率分別為（1.74±0.55）%、（1.78±0.58）%、（14.32±1.21）%，3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=225.043，P﹤0.05）。其中，空轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05），而過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。（圖3）

圖3 過(guò)表達(dá)miRNA-335對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

2.4 miRNA-335過(guò)表達(dá)對(duì)survivin蛋白表達(dá)的影響

采用Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白survivin的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，對(duì)照組、空轉(zhuǎn)染組和過(guò)表達(dá)組survivin的蛋白表達(dá)量分別為（0.554±0.047）、（0.566±0.046）、（0.102±0.016），3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=137.441，P﹤0.05）?？辙D(zhuǎn)染組與對(duì)照組的survivin蛋白表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05），而過(guò)表達(dá)組survivin的蛋白表達(dá)低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。（圖4）

3 討論

圖4 miRNA-335過(guò)表達(dá)對(duì)survivin蛋白表達(dá)水平的影響

目前，腫瘤的生物治療成為腫瘤治療的新思路，特別是利用基因治療腫瘤。近些年，miRNA作為重要的生物體基因調(diào)控分子，其與腫瘤的關(guān)系已成為生物領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。miRNA在結(jié)構(gòu)及序列上進(jìn)化保守，廣泛存在于生物體內(nèi)，可在轉(zhuǎn)錄后對(duì)一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，參與細(xì)胞的增殖、凋亡、分化及個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育等生命過(guò)程[8]。在多種腫瘤中，miRNA發(fā)揮抑癌基因或癌基因的作用，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等關(guān)系密切，如miRNA-378可參與非小細(xì)胞肺癌的腦轉(zhuǎn)移，促進(jìn)細(xì)胞的侵襲、遷移，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤血管的形成[9]；miRNA-340在侵襲能力強(qiáng)的乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，誘導(dǎo)其表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及侵襲[10]。

miRNA-335作為miRNA家族中的一員，近些年的研究發(fā)現(xiàn)，在不同腫瘤中，miRNA-335發(fā)揮不同的作用。研究顯示，卵巢癌細(xì)胞中miRNA-335的表達(dá)水平降低或缺失，其表達(dá)與耐藥呈負(fù)相關(guān)[11]；miRNA-335在胃癌細(xì)胞中可以通過(guò)靶向調(diào)控SP1的表達(dá)從而抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及侵襲[12]，而在星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miRNA-335呈高表達(dá)狀態(tài)，其表達(dá)可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲能力[13]。因此，miRNA-335在肺癌中的作用尚需進(jìn)一步的研究。

有研究顯示，miRNA-335在肺癌細(xì)胞中低表達(dá)[14]，本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miRNA-335后，肺癌細(xì)胞的增殖受到抑制，凋亡數(shù)量增加。細(xì)胞凋亡在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，其過(guò)程受到抗凋亡基因和促凋亡基因的共同調(diào)控。survivin是凋亡蛋白抑制因子（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族中的一員，也是最強(qiáng)的凋亡抑制因子，可通過(guò)抑制含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）的活性阻斷凋亡的發(fā)生，從而在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[15]。研究顯示，survivin在肺癌、胃癌等多種腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，在肺癌細(xì)胞中抑制其表達(dá)可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[16-17]。本研究中，過(guò)表達(dá)miRNA-335后檢測(cè)肺癌細(xì)胞survivin的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，survivin蛋白的表達(dá)水平降低，說(shuō)明過(guò)表達(dá)miRNA-335可以通過(guò)下調(diào)survivin誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，上調(diào)肺癌細(xì)胞miRNA-335表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，并通過(guò)下調(diào)survivin蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究從分子水平上為肺癌的發(fā)病原因?qū)ふ业搅死硐氲臉?biāo)志物，也為肺癌的診斷與治療提供了線(xiàn)索。

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