徐鵬昊，羅武松，何恩明，王焱磊，蔡 楓，張 亮， 竇同海，王金秋，周 雁,

(1.復旦大學 生命科學學院 微生物學與微生物工程系，上海 200438；2.復旦大學 生命科學學院 遺傳學研究所 遺傳工程國家重點實驗室，上海 200438；3.上海人類基因組研究中心 上海市疾病與健康基因組學重點實驗室，上海 201203)

PCR引物設計中，引物與模板結合的特異性是首要考慮要素．特異性不足時，引物容易與近似序列發(fā)生非特異性結合，產(chǎn)生不純的擴增產(chǎn)物，在qPCR的時候也會影響定量結果．引物的特異性是保證理想PCR產(chǎn)物的基本條件．

一般而言，較高的引物特異性容易得到單一的PCR產(chǎn)物，但是這并不總是符合實驗設計的需求．從屬水平上來看，利用16S rDNA分析各種微生物的相對豐度時，設計的引物就需要滿足以下兩個主要條件： 一是在屬內(nèi)具有較好的覆蓋度，能夠與屬內(nèi)絕大多數(shù)物種的DNA序列結合，防止屬內(nèi)某些種不能擴增出產(chǎn)物而產(chǎn)生誤差；二是不與屬外的其他物種的DNA結合，防止非特異性擴增的發(fā)生．只有同時符合這兩個條件，才可以得到較精準的菌群分析結果．同樣，在致病菌初期篩查中，也需要控制引物的特異性．同屬的微生物種間序列相似度極大[1]，也常常具有相似的結構和習性．故在鑒定微生物致病性時，常常以屬作為分類單位，并不特指到具體的種．如黃桿菌屬(Flavobacterium)、希瓦氏菌屬(Shewanella)和假單胞菌屬(Pseudomonas)的微生物均會引起淡水魚類的皮膚潰爛[2-4]．因而，在通過PCR方法對這些致病菌進行檢測的時候，為了確定這些屬的微生物是否存在，也需要屬水平上的引物特異性．

現(xiàn)在常用的引物設計軟件，如Oligo[5]、Primer Premier和NCBI的Primer-BLAST[6]等，在設計針對屬水平的特異性引物時均存在一定局限．其中Oligo和Primer Premier主要針對引物的效率，沒有包含模板外特異性檢測的模塊．Primer-BLAST基于NCBI數(shù)據(jù)庫，設計了引物特異性檢測的相關參數(shù)，但是不能針對具體環(huán)境來設計特異性檢測數(shù)據(jù)庫，也不能檢測引物在屬內(nèi)的覆蓋率．因此，本研究嘗試對引物設計進行優(yōu)化，以滿足屬水平上引物設計的需求．

引物設計時，選擇特異性較好的基因作為模板可以提高引物的特異性，為了了解這樣的引物特異性是否滿足微生物豐度檢測的需要，我們用BLAST結果進行評估．本研究中選取細菌的16S rDNA作為模板，因為其在微生物中體現(xiàn)的高度屬間特異性和屬內(nèi)保守性，常作為微生物分類的主要依據(jù)[7]．由于16S rDNA是原核生物普遍具有的DNA序列，以其為靶基因，可以方便而又準確地檢測目標屬在樣本中是否存在，由此可以對菌群豐度進行分析，或是檢測物種是否有被致病微生物感染，產(chǎn)生疾病的風險．我們選取了一些以往實驗中使用的16S rDNA特異性引物，驗證其在淞江鱸體表微生物菌群分析的效果．發(fā)現(xiàn)這些引物都會與其他環(huán)境屬微生物的DNA發(fā)生非特異性結合，或者只能與屬內(nèi)少數(shù)幾個種匹配，因而不能滿足微生物菌群鑒定或是致病微生物檢測的需要．因此，本研究的目的，就是針對16S rDNA，在屬水平特異性上進行引物設計優(yōu)化，滿足屬間特異性和屬內(nèi)覆蓋度兩方面的需求，以期在微生物菌群分析、致病微生物鑒定等研究中實際應用．

1 設計方法

為了保證引物的屬間特異性，同時保證引物在屬內(nèi)的覆蓋度，引物經(jīng)過了兩次的篩選，第一次篩選找出屬內(nèi)保守片段，第二次保證引物的特異性，不與其他的DNA發(fā)生非特異性擴增．引物設計的流程圖見圖1．

圖1 引物設計流程圖Fig.1 Flow diagram of primer design

1.1 確定目標屬與環(huán)境屬

在引物設計中，首先確定檢測的目標屬．除此之外，為了排除其他DNA發(fā)生非特異性擴增的可能，也要確定環(huán)境中可能存在的其他屬，即環(huán)境屬．這一步中，為了確定環(huán)境屬，首先應檢索和引用已發(fā)表的測序結果或相關菌群分析結果，也可以放寬至所有理論上可能存在的屬．一般而言，如果能夠通過測序、菌群分析等手段精準地確定環(huán)境屬，則可以得到更多的備選引物對，從而為兼顧引物的效率提供更多選擇．

1.2 下載序列

得到了所有屬的列表之后，下載其16S rDNA序列作為引物設計的模板，并轉(zhuǎn)化為FASTA格式．現(xiàn)在常用的數(shù)據(jù)庫，如NCBI(http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)、RDP[8]等，都提供了多種格式的數(shù)據(jù)免費下載服務，使得這一步驟較易實現(xiàn)．此外，還需要下載所有環(huán)境屬的16S rDNA序列，這些序列構成了引物設計軟件的原數(shù)據(jù)．

此外，在確定目的基因時，要盡量保證目的基因或其同源基因在所有屬中均存在．因此，優(yōu)先選擇一些功能重要的管家基因，比如說在微生物中，就可以使用16S rDNA作為模板．也可以將目的基因序列在目標屬中進行BLAST，并以此檢驗是否有同源基因存在．同時，盡量保證該基因的屬內(nèi)保守性和屬間特異性，具有以上特點的基因可以更好地用于引物設計．

1.3 通用性篩選

通用性篩選，即篩選可以作為引物模板的，在目標屬內(nèi)普遍存在的屬內(nèi)保守片段．這些片段將作為之后引物設計的基礎．在這一步中，我們篩選得到的片段數(shù)量與目的基因的選擇直接相關.16S rDNA屬于較為保守的基因片段，可以得到屬內(nèi)保守片段的數(shù)量較多，給后續(xù)的篩選留下了較為充足的空間．

1.4 特異性篩選

特異性篩選，即確定上一步篩選的片段在屬間的特異性．將屬內(nèi)保守片段與所有環(huán)境屬序列進行比對，選擇只在目標屬之內(nèi)出現(xiàn)，與其他環(huán)境屬的序列之間都有差異的片段，軟件中設定的默認最小差異值是屬內(nèi)保守片段與其他序列至少有一個堿基的不同，以排除非特異性擴增．之后，根據(jù)產(chǎn)物長度將特異性片段進行配對，得到特異性片段對．

1.5 引物篩選

我們設計了一個簡單的引物效率計算模塊．通過控制引物之間的二級結構來保證引物的擴增效率．首先，根據(jù)引物中ATCG各堿基的比例對引物的tm(退火溫度)值進行估算，控制前后引物的tm差值在一定的范圍內(nèi)．之后，對引物序列進行分析，嚴格控制引物之間的二級結構，包括發(fā)夾結構、二聚體等，將這些具有二級結構的引物排除．最后，由于連續(xù)相同的堿基可能會對引物的效率產(chǎn)生影響，軟件也排除了這些引物．以上幾點作為引物篩選的參數(shù)，在控制引物效率方面起到了重要作用．

1.6 確定引物對

完成引物效率計算，排除tm差值較大和具有二級結構的引物之后，將特異性片段對的后部分反向互補，就得到了最終引物對．這些引物在只有環(huán)境屬的情況下，都具有較好的屬間特異性和屬內(nèi)覆蓋度．有些屬由于目的基因特異性不足，可能沒有引物對產(chǎn)生．此時取m條特異性片段，m缺省為1000，并取這些片段之后nbp位置的普通片段，將兩者進行配對，n默認為最短產(chǎn)物長度值，即200．經(jīng)過篩選后，得到的引物對前引物具有特異性，后引物的特異性不能保證，因此這樣的引物對略遜于前者，為次優(yōu)引物對．然而，由于前引物的特異性，這樣的引物對也可以在擴增中使用．最終確定引物時，可以將模板上不同位置的幾對引物，使用BLAST進行檢驗，選取其中屬間特異性好，屬內(nèi)覆蓋度高的作為最終引物對．

2 實驗驗證方法

淞江鱸是中國國家二級保護動物，是一種珍貴的生物資源，以其重要的生態(tài)和經(jīng)濟價值位列我國四大名魚之首[9]．養(yǎng)殖淞江鱸的體表常出現(xiàn)皮膚潰爛現(xiàn)象，本實驗室對淞江鱸體表菌群進行了測序分析，初步推測了其潛在致病菌[10]．為了確定引物設計的特異性和效率，本研究選擇淞江鱸作為實驗物種，通過定量PCR驗證與前期研究結果是否一致．

實驗中使用的淞江鱸采集自上海市松江區(qū)的上海四鰓鱸水產(chǎn)科技發(fā)展有限公司的生產(chǎn)基地，選取了頭部嚴重感染的個體．用2個無菌棉簽分別擦拭潰爛部位和周邊未感染部位．之后將棉簽迅速放入滅菌離心管中，-20℃保存，得到了2個樣本(表1)．

2.1 16S rDNA庫的構建

實驗參照文獻確定了淞江鱸的3個致病屬(Flavobacterium、Pseudomonas和Shewanella)以及一個輔助檢測屬(Rhodobacter)[10]，致病屬在致病淞江鱸樣本中的含量較高，并會導致輔助檢測屬的含量有一定降低，因此將其作為實驗的目標屬．輔助檢測屬Rhodobacter是淡水環(huán)境中的正常菌群[11]，同時它的豐度較大[10]，便于檢測．因而我們將其作為定量PCR的參照．之前的測序結果共發(fā)現(xiàn)154個環(huán)境屬[10]，其中在RDP數(shù)據(jù)庫中檢索獲得142個環(huán)境屬的16S rDNA全長序列(FASTA格式)，其余12屬大多為新確立的屬，相關研究較少，且豐度不高，予以排除．這142個屬的16S rDNA的序列，構成了本次實驗中所用的16S rDNA庫．

2.2 引物設計

注： 表中所有引物，屬內(nèi)覆蓋度(Cover Rate)均高于80%，且屬間特異性值為0，即不與任何環(huán)境屬序列反向互補．

實驗設計了長度在20～25bp，產(chǎn)物長度在200～300bp的引物，要求目標屬內(nèi)覆蓋率達到80%以上，與其他屬序列均存在差異．排除了兩端引物tm差值5℃以上，或具有4bp以上特殊二級結構或連續(xù)相同堿基的引物．最終，從Flavobacterium中設計出174對引物，從Pseudomonas中設計出2291 對引物．Shewanella和Rhodobacter缺乏成對的具有特異性的引物，一端使用普通引物進行補全，最終從Shewanella中得到1009對次優(yōu)引物，從Rhodobacter中得到190對引物．用NCBI的Primer-BLAST進行驗證，確定引物特異性后，每個屬中選擇了一對引物進行后續(xù)驗證實驗(表2)．

2.3 樣本16S rDNA的提取

實驗利用DNeasy Blood & Tissue Kit(QIAGEN，Chatsworth，CA，USA)的操作流程分別提取LeH和NonLeH兩個樣本中的微生物總DNA，并用16S rDNA的通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)對總DNA進行擴增得到總16S rDNA，50℃加熱3min，95℃加熱10min．之后95℃變性15s，52℃退火30s，72℃延伸40s，執(zhí)行30個循環(huán)．最后72℃延伸10min．產(chǎn)物用QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN, Chatsworth, CA, USA)回收．

2.4 目標屬片段的獲取

以回收的PCR產(chǎn)物為模板，分別加入對應的引物．進行PCR擴增，50℃加熱3min，95℃加熱10min．之后95℃變性15s，60℃退火30s，72℃延伸40s，執(zhí)行30個循環(huán)．最后72℃延伸10min．產(chǎn)物與DL2000 DNA Marker共同進行瓊脂糖凝膠電泳后驗證長度后，用QIAquick PCR Purification Kit回收．之后，將產(chǎn)物用ABI 3730測序儀測序，驗證引物的特異性．

2.5 模板的制作

利用Nanodrop 2000超微量分光光度儀測量目標屬片段的吸光度，確定其拷貝數(shù)．并梯度稀釋成1.0×106～1.0×102/μL，作為標準曲線的模板．同樣，測定LeH和NonLeH兩個未知樣本16S rDNA的吸光度，確定其拷貝數(shù)后，梯度稀釋至1.0×105/μL，作為未知樣本的模板．

2.6 Real-time PCR定量

本實驗使用上海捷瑞生物工程有限公司的Power qPCR PreMix(SYBR Green)試劑盒和Roche lightcycler 480實時熒光定量PCR儀進行Real-time PCR．實驗分成4個組，分別對應3個致病屬和一個輔助檢測屬，每一組分別為病患部位、非病患部位和5個梯度的標準曲線，并進行3次重復，一共有21個樣品．每一個樣品中含有PreMix 10μL，前后引物各1μL，DNA模板2μL，水4μL，構成20μL反應體系．混勻之后，按照95℃變性15s，60℃退火20s，72℃延伸18s進行，反應共進行40個循環(huán)．之后溫度由72℃逐漸上升至95℃，繪制溶解曲線．得到Cp值和溶解曲線，進行相對定量分析．

3 結 果

3.1 瓊脂糖凝膠電泳和序列測定

利用總16S rDNA和4個屬的特異性引物進行擴增，之后利用瓊脂糖凝膠電泳，得到電泳圖片(圖2)．可以看到目標屬片段均在250bp左右，與設計目標相符．

對得到的PCR產(chǎn)物片段進行一代雙向測序，去除雜峰得到測序結果(表3，具體序列看67頁附表1)．由于引物擴增了目標屬中的多個種，因而結果中有簡并堿基出現(xiàn)．利用BLAST工具將片段與NCBI 16S rDNA數(shù)據(jù)庫對應屬的序列進行比對．由于BLAST不能識別簡并堿基，手工將簡并堿基引起的錯配消除后，記錄錯配的位數(shù)(表3)．Shewanella的F方向測序中，有3個堿基在所有種都有錯配，R方向正確匹配，因此懷疑該錯配為測序錯誤．除此之外所有屬都有大量種與測序結果完全匹配，說明引物確實正確擴增了對應屬的序列．

圖2 瓊脂糖凝膠電泳圖片F(xiàn)ig.2 Picture of agarose gel electrophoresisM： DNA Marker，自上而下分別為2000,1000,750,500,250,100bp; 1. Flavobacterium; 2. Pseudomonas; 3. Shewanella; 4. Rhodobacter

Tab.3 Results of sequencing and BLAST

樣本產(chǎn)物長度/bp方向測序長度/bp最少錯配位數(shù)/個最多錯配位數(shù)/個Flavobacterium254F11700R18301Pseudomonas212F7602R14401Shewanella235F136310R11502Rhodobacter229F12500R16100

3.2 吸光度測定和拷貝數(shù)計算

利用Nannodrop 2000分光光度計測得PCR產(chǎn)物的吸光度，并根據(jù)擴增產(chǎn)物的長度估算產(chǎn)物的拷貝數(shù)，結果見表4．為保證LeH和NonLeH 2個未知樣本的拷貝數(shù)為1.0×105/μL，需對其進行5次10倍梯度稀釋．

3.3 溶解曲線、擴增曲線和標準曲線

Real-time PCR反應的溶解曲線如圖3(看64頁)所示．可以看到，4個屬的溶解曲線均為單峰，且峰的寬度比較窄．由于引物在屬內(nèi)具有較高的覆蓋度，因此PCR擴增得到的產(chǎn)物并不是單一的．然而，由于產(chǎn)物的長度都在200～250bp之間，且16S rDNA的序列本身較保守，因此不同的產(chǎn)物之間也應該僅有幾個堿基的細微差別，溶解溫度相近，體現(xiàn)在溶解曲線的單峰上．同時，這也說明了Real-time PCR中沒有其他的擴增產(chǎn)物生成．Real-time PCR反應的擴增曲線如圖4(看64頁)所示．

對于每一組，實驗對擴增曲線分別設置了基線和閾值，繪制標準曲線(圖5，看65頁)，并確定未知樣本的Cp值(每個反應管到達閾值所用的循環(huán)數(shù))和拷貝數(shù)．

3.4 致病菌的相對定量

對于每個樣本的3個重復，實驗舍去一個偏差較大的，其他2個求平均值，作為未知樣本的結果(表5)．最后，與16S rDNA樣本的拷貝數(shù)做對比，得到4個屬占總16S rDNA的百分比，分析結果見表5．根據(jù)Real-time PCR反應在LeH和NonLeH兩個樣本中得到的目標屬的Cp值和拷貝數(shù)，以輔助檢測屬Rhodobacter為基準，對3個致病屬Flavobacterium、Shewanella和Pseudomonas進行相對定量(表5，看65頁)．結果表明，在患病樣本LeH中，致病屬Flavobacterium的相對比例有顯著提高，大約為未患病樣本NonLeH的兩倍．而另外兩個致病屬Shewanella和Pseudomonas的比例不但沒有上升，反而還有一定的下降．由此，我們推斷，患病樣本的主要致病菌為Flavobacterium．

圖3 Real-time PCR溶解曲線Fig.3 Melting curves for Real-time PCR橫坐標為反應溫度，單位為℃.縱坐標為熒光信號強度的負一階導數(shù).4個目標屬均為單峰，峰較窄，說明產(chǎn)物特異性好.

圖4 Real-time PCR 擴增曲線Fig.4 Amplification curves for Real-time PCR橫坐標為循環(huán)數(shù)Ncycle，縱坐標為熒光強度I熒光.

圖5 Real-time PCR標準曲線Fig.5 Standard curves for Real-time PCR

屬名樣本Cp值Cp值標準偏差拷貝數(shù)標準偏差相對比例FlavobacteriumLeH22.400.153330.0185.000.505NonLeH0.150.24118.02.000.282PseudomonasLeH25.240.40683.021.500.104NonLeH28.000.2166.51.650.159ShewanellaLeH26.350.47109.07.000.017NonLeH27.630.4123.51.950.056RhodobacterLeH23.780.216590.0865.001.000NonLeH26.030.13418.05.001.000

4 討 論

本研究針對屬水平特異性引物的設計需要，對16S rDNA在屬水平上進行特異性引物設計優(yōu)化，通過多輪篩選，最終確定需要的引物對，達到在菌群分析、致病菌初期篩查等方面應用的要求．和現(xiàn)有的引物設計思路相比，本研究更加注重于引物的特異性，即從可能的環(huán)境屬入手，排除可能的錯配，達到特異性擴增的目的．

本研究的一個特點是生成了符合特定環(huán)境的引物對，即將特異性限制在一定的環(huán)境之中．本研究一開始確定了環(huán)境中可能存在的其他DNA序列，通過特異性片段的對比，排除這些序列的干擾，這樣就確保了PCR反應在這一環(huán)境中的特異性擴增．這樣的設計思路有以下兩點優(yōu)點：

第一，更容易得到特異性引物．Primer-BLAST中特異性檢測在NCBI的數(shù)據(jù)庫中進行，這樣的大型數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)量大，因此難以找到單一與目標模板匹配的引物對，這也體現(xiàn)在利用引物進行BLAST的時候，引物對往往和許多其他序列匹配，這些序列就會造成錯誤擴增．本研究只是在具體環(huán)境中進行了特異性檢測，更容易得到在具體環(huán)境中具有特異性的引物．即是引物可以和某些序列結合，但是由于這些序列并未出現(xiàn)在環(huán)境中，也不會發(fā)生錯誤擴增，產(chǎn)生干擾．

第二，大量的特異性引物有利于提高引物效率．由于本研究只是對具體環(huán)境中可能存在的微生物進行了特異性檢測，因此相對于在大型數(shù)據(jù)庫中對所有已知微生物進行的特異性檢測，可以得到更多的引物對．這些引物對允許我們對tm差值、二級結構等不利于擴增的因素進行進一步篩選，從而保證了引物效率．同時，本研究考慮到了目標屬內(nèi)的覆蓋度，保證了一對引物可以結合目標屬中的大部分序列．這一篩選過程是針對菌群分析和致病菌初期篩查等方面的應用設定的，是本研究較為核心的一部分．然而，這一步需要大量的運算，雖然我們有針對性地進行了算法優(yōu)化，但仍在引物設計過程中占用較多時間，可能需要進一步優(yōu)化．

我們使用淞江鱸體表菌群進行Real-time PCR分析，驗證了引物的特異性和效率．電泳中的條帶和測序結果表明，目標條帶確實是我們預期的理想產(chǎn)物，具有較好的屬內(nèi)覆蓋度和屬間特異性．同時，Real-time PCR反應結果也證實該方法設計的引物具有較好的特異性和較高的擴增效率．

我們將本研究使用的各步驟編寫為一個小程序(使用MIT軟件協(xié)議)，同時編寫了基于Qt的圖形界面(http：∥homepage.fudan.edu.cn/zhouyan/primer-maker/)，有專門的設置界面對每一步的篩選操作進行參數(shù)設置，同時加入了進度顯示來估計運行的時長和所需的運行時間．軟件輸出的結果表示為引物對的形式，也顯示了與模板匹配的位置和產(chǎn)物長度．

本軟件采用了多線程設計，將“后臺數(shù)據(jù)運算”與“圖形化界面”分離，使研究者可以在軟件運行時，清晰地看到數(shù)據(jù)處理的實時進度．輸入序列時，本軟件采用自動處理的模式，只需要導入全部屬的基因信息，并給出一份目標屬的清單目錄，省去了研究者手動在大量的文件中將目標屬和環(huán)境屬各自歸類的麻煩．

查找目標屬內(nèi)保守片段時，本軟件采用了自創(chuàng)的“切分”查找算法，極大地提升了查找效率．假設目標屬內(nèi)的某個種，其基因片段長達1000，而需要的特征片段長度為20，若采取傳統(tǒng)的“暴力搜索”方法，需要進行檢驗的字符串有981個．現(xiàn)采用“切分”算法，將這長度為1000的基因串切分為100段長度為10的小串．只搜索這100段小串，對于匹配成功的小串，再向左右延伸，直到達到需要的20長度．這樣不會錯過任何一個正確的答案，運行速度也有了指數(shù)級別的優(yōu)化提升．輸出部分，既支持在軟件窗口中進行快速地查看，也支持將結果保存導出為文件．

在實驗過程中，我們首先使用16S rDNA的通用引物對樣本進行擴增，得到所有樣本的16S rDNA序列，這一步和我們目的基因的選擇相關．引物設計中，如果采用環(huán)境屬的全基因組作為原數(shù)據(jù)，特異性篩選時會去掉大量的結果，部分特異性不夠的屬無法設計滿足要求的引物．于是我們選擇所有樣本的16S rDNA序列作為原始數(shù)據(jù)，這樣只能保證引物在16S rDNA中的特異性，不能保證在全基因組中的特異性．因此，在實驗過程中，要先提取所有樣本的16S rDNA作為原始樣本．如果想要在環(huán)境屬全基因組中直接擴增，可以利用BLAST，在NCBI、RDP等數(shù)據(jù)庫中進行檢測．如果結果中不含目標屬以外的屬，且引物在目標屬中匹配到了正確的位置，即可以直接在環(huán)境屬全基因組中使用，不必預先提取目的基因．我們隨機選取軟件設計出來的一些引物進行了BLAST檢測，確實出現(xiàn)某些16S rDNA中特異的引物在環(huán)境屬基因組中不具有特異性的情況(表7)．

表7 一些引物的BLAST檢測

附表1 測序結果

致謝及分工： 項目中，徐鵬昊，王焱磊，蔡楓，張亮，竇同海，周雁負責引物設計及優(yōu)化，何恩明在實驗部分提供幫助，羅武松、王金秋負責樣本采集．感謝王翌霞的前期工作對本文的啟發(fā)，感謝楊芳在實驗方面給予作者的幫助．

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