倉(cāng)艷琴 陸庭嫣 呂焱

不孕癥的病因有諸多，如合并生殖道感染、多次流產(chǎn)史[1]。近年來(lái)，罹患不孕不育癥的人數(shù)呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)。據(jù)WHO估計(jì)，全球約有近6 000萬(wàn)～8 000萬(wàn)人罹患不孕癥，約占育齡人口的13.0%～15.0%，且發(fā)展中國(guó)家的發(fā)病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于發(fā)達(dá)國(guó)家[2]。研究發(fā)現(xiàn)一系列的感染與流產(chǎn)、死胎和早產(chǎn)有關(guān)，其中約15%的早期流產(chǎn)和66%的晚期流產(chǎn)由感染引起[3]。而多次流產(chǎn)本身又是不孕癥的主要原因之一，因其可導(dǎo)致輸卵管堵塞的概率增大，從而造成繼發(fā)性不孕癥[4]。本研究通過(guò)對(duì)我院門(mén)診不孕癥女性人群生殖道感染微生物檢出的情況進(jìn)行匯總和回顧性分析，并與普通體檢女性人群比較，探討生殖道感染與女性不孕之間的關(guān)聯(lián)性。

對(duì)象與方法

1.對(duì)象：標(biāo)本來(lái)源于2015年1月—2016年9月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬國(guó)際和平婦幼保健院微生物室收集的生殖道標(biāo)本，試驗(yàn)組采樣均來(lái)自我院輔助生育和不孕癥門(mén)診的女性患者，共納入16 244人；對(duì)照組為同期我院常規(guī)健康體檢的女性，共納入35 952人。

2.采集方法：采用陰道宮頸拭子取樣。用無(wú)菌潤(rùn)滑劑的擴(kuò)張器使宮頸可見(jiàn)，用拭子擦去宮頸外溢的粘液分泌物，丟棄拭子，用另一支無(wú)菌拭子插入宮頸內(nèi)2 cm，旋轉(zhuǎn)拭子，停留2秒，拭子避免碰及陰道壁。取分泌物之前應(yīng)避免性生活、陰道沖洗和用藥。標(biāo)本采集后應(yīng)正確蓋好，防止泄漏或容器外部留有殘留物。所有標(biāo)本均于采集后2 h內(nèi)常溫送至實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行微生物學(xué)檢測(cè)。

3.實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

(1)一般菌培養(yǎng)：接種血瓊脂平板，35 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察各類平板上菌落形狀后行細(xì)菌屬、種、型的鑒定。本文中羅列的常見(jiàn)菌屬有鏈球菌屬(如無(wú)乳鏈球菌、巴氏鏈球菌等)、腸桿菌屬(如大腸埃希菌、肺炎克雷伯氏菌等)、腸球菌屬(如糞腸球菌等)。如同一平板超過(guò)三種形態(tài)菌落生長(zhǎng)則不予鑒定。陰道加德納菌是一種革蘭氏染色陰性或染色不定、厭氧、嗜血的病原菌。若在觀察血平板時(shí)發(fā)現(xiàn)有陰道加德納菌就做菌種鑒定，并結(jié)合標(biāo)本直接涂片革蘭染色進(jìn)行Nugent評(píng)分確認(rèn)，最終報(bào)告陰道加德納菌是否生長(zhǎng)。Nugent診斷標(biāo)準(zhǔn)：半定量評(píng)估陰道分泌物中3組優(yōu)勢(shì)菌(乳桿菌、陰道加德納菌或擬桿菌、動(dòng)彎桿菌)的形態(tài)分值之和，達(dá)7～10分即可考慮為細(xì)菌性陰道病(bacterial vaginosis,BV)。

(2)念珠菌培養(yǎng)：接種科瑪嘉顯色平板，35 ℃培養(yǎng)18～24 h。菌落或光滑或較粗糙，不同顏色顯示不同菌種：綠色提示為白色念珠菌；紫色提示為光滑假絲酵母菌；藍(lán)色提示為熱帶假絲酵母菌；粉紅提示為克柔假絲酵母菌；白色提示為需進(jìn)一步上機(jī)鑒定其他菌種如近平滑假絲酵母菌、無(wú)名假絲酵母菌等。

(3)生殖道支原體檢測(cè)：采用上海奧普生物醫(yī)藥有限公司提供的泌尿生殖道病原性支原體培養(yǎng)鑒定與計(jì)數(shù)參考診斷試劑盒，用于檢測(cè)解脲支原體(Uu)和人型支原體(Mh)。加樣后石蠟油封存，37 ℃放置48 h后準(zhǔn)時(shí)觀察加樣孔培養(yǎng)基顏色。若孔1、3變色，則考慮Mh感染，且菌量濃度≥104CCU/ml。若孔1、2、4變色，則考慮Uu感染，且菌量濃度≥104CCU/ml。若孔1～5均變色，則考慮同時(shí)感染Uu、Mh，且兩者菌量濃度均≥104CCU/ml。其余情況或只要孔1不變色，則菌量濃度<103CCU/ml。

(4)沙眼衣原體(chlamydia trachomatis,Ct)抗原測(cè)定：采用艾博生物醫(yī)藥提供的沙眼衣原體抗原檢測(cè)試劑盒，加樣后10～20分鐘觀察檢測(cè)區(qū)與質(zhì)控區(qū)是否顯現(xiàn)紅色條帶。結(jié)果判定如下：陽(yáng)性為兩條紅色條帶出現(xiàn)，表明樣本內(nèi)含有衣原體抗原；陰性為僅質(zhì)控區(qū)顯色，而檢測(cè)區(qū)未顯色，表明樣本檢測(cè)不出衣原體抗原或是含量低于可檢測(cè)范圍。在規(guī)定的觀察時(shí)間內(nèi)，不論該色帶顏色深淺，即使只有非常弱的色帶也應(yīng)判為陽(yáng)性結(jié)果。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)經(jīng)Microsoft Office Excel 2003錄入及分類匯總，采用SPSS 20.0軟件分析。組間比較采用χ2檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用二項(xiàng)分布,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

不孕癥女性生殖道微生物檢出陽(yáng)性者1 555例，普通健康體檢女性中生殖道微生物檢出陽(yáng)性者783例，生殖道感染在不孕女性和體檢女性中檢出率分別為9.6%和2.2%，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著，見(jiàn)表1。其中不孕女性生殖道檢出病原體前3位依次為支原體、念珠菌、衣原體，與體檢組相比統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著；體檢女性生殖道檢出前3位病原體依次為支原體、念珠菌、鏈球菌屬。詳見(jiàn)表2。

不孕癥女性生殖道支原體檢出率為8.3%，位居首位，檢出率遠(yuǎn)高于其他菌屬，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其他檢出病原體為(按菌種、菌型分類)：念珠菌119人(包括白假絲酵母菌56人、光滑假絲酵母菌56人、近平滑假絲酵母菌3人、熱帶假絲酵母菌3人、無(wú)名假絲酵母菌1人)；衣原體103人；鏈球菌5人，均為無(wú)乳鏈球菌(B群)；腸桿菌4人(大腸埃希菌2人、肺炎克雷伯氏菌2人)；腸球菌3人，均為糞腸球菌(D群)。另用一般菌培養(yǎng)法檢出陰道加德納菌4人。

表1 不孕與體檢女性生殖道標(biāo)本檢出陽(yáng)性情況

*兩組比較，P<0.001

表2兩組女性生殖道感染微生物檢出情況，按菌屬分類[例(%)]

不孕組(n=16244)體檢組(n=35952)支原體1354(8.3)748(2.1)念珠菌119(0.7)17(0.0)衣原體103(0.6)8(0.0)鏈球菌屬5(0.0)11(0.0)腸桿菌屬4(0.0)4(0.0)腸球菌屬3(0.0)2(0.0)

普通健康體檢女性生殖道支原體檢出率為2.1%，位居首位，檢出率高于其他菌屬，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其他檢出病原體為(按菌種、菌型分類)：念珠菌17人(包括白假絲酵母菌9人、光滑假絲酵母菌6人、近平滑假絲酵母菌2人)；鏈球菌11人(無(wú)乳鏈球菌(B群)10人、巴氏鏈球菌1人)；衣原體8人；腸桿菌4人(大腸埃希菌2人、肺炎克雷伯氏菌2人)；腸球菌2人，均為糞腸球菌(D群)。另用一般菌培養(yǎng)法檢出陰道加德納菌1人。

因此，在同等檢測(cè)條件下觀察到無(wú)論不孕癥與普通體檢女性，導(dǎo)致其生殖道感染的首位病原體均為生殖道支原體，其檢出量由多及少均為Uu>Uu+Mh>Mh。但是不孕組感染支原體的總體比例和Uu、Uu+Mh的構(gòu)成比均明顯高于體檢組，體檢組感染Mh的患者合并其他病原體的感染的比例明顯高于不孕組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。見(jiàn)表3、表4。

表3 兩組女性生殖道標(biāo)本支原體檢出的比例

*不孕組和體檢組比較，P<0.001

表4不孕組和體檢組生殖道支原體感染人群中檢出類型構(gòu)成比[例(%)]

支原體分型不孕組(n=1354)單純感染合并其他體檢組(n=748)單純感染合并其他Uu952(70.3)*37(2.7)490(65.5)52(7.0)Mh120(8.7)3(0.2)#67(9.0)33(4.4)Uu+Mh231(17.1)*11(0.8)68(9.1)38(5.1)

*不孕組和體檢組單純感染組比較，P<0.001；#不孕組和體檢組合并其他類型比較，P<0.001

討論

本文調(diào)查的結(jié)果提示，跟普通體檢女性相比，不孕女性的生殖道更容易出現(xiàn)生殖道支原體、念珠菌、沙眼衣原體的感染，其中支原體感染率明顯領(lǐng)先，均為Uu>Uu+Mh>Mh，且以單純感染Uu或Uu+Mh居多。合并生殖道感染及多次流產(chǎn)等均可致不孕，且某些生殖道感染又與流產(chǎn)間有正相關(guān)性，可致繼發(fā)性不孕。那么是這些病原體感染直接導(dǎo)致了不孕的發(fā)生，還是通過(guò)導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)再繼發(fā)不孕的呢？下面就本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)的不孕女性生殖道排名前三的病原體分別為生殖道支原體(Uu、Mh)、念珠菌、沙眼衣原體展開(kāi)討論。

2016年一篇meta分析對(duì)2009—2014年期間所有以“流產(chǎn)”、“感染”為關(guān)鍵詞，圈定對(duì)象為人、使用英文發(fā)表的臨床試驗(yàn)，并排除了動(dòng)物試驗(yàn)與個(gè)案病例報(bào)道，共有327篇論著，其中有44篇研究觀察了不同病原體與流產(chǎn)之間的關(guān)聯(lián)，包括細(xì)菌感染、病毒感染、原蟲(chóng)感染三種。其中與流產(chǎn)有顯著相關(guān)的為細(xì)菌性陰道炎(包括人型支原體和解脲支原體)、布魯桿菌病、梅毒、巨細(xì)胞病毒、黃病毒、HIV、風(fēng)疹病毒、瘧疾。有些嚴(yán)重的母體感染，例如流感、HIV、登革熱和瘧疾，母體的應(yīng)答或許會(huì)導(dǎo)致流產(chǎn)而非直接的胎盤(pán)感染[3]。Allanson B等[5]對(duì)101名孕婦研究發(fā)現(xiàn)，采樣(絨毛膜、羊膜、臍帶)中有25%為流產(chǎn)的標(biāo)本檢出Uu陽(yáng)性；其次檢出的常見(jiàn)病原體為Mh和B族鏈球菌，約11%。而所有對(duì)照組孕婦均未發(fā)現(xiàn)有感染，提示即使本身能受孕的婦女處于妊娠期內(nèi)，如感染Uu、Mh后易流產(chǎn)、繼而致不孕。Rajkumari N等[1]開(kāi)展一項(xiàng)前瞻性的臨床研究，對(duì)象為100對(duì)不孕癥女性與有健康生育力的女性，取其首段尿、宮頸內(nèi)拭子、子宮內(nèi)膜活檢標(biāo)本，行PCR檢測(cè)生殖道支原體，證實(shí)了北印度人群的不孕癥與生殖道支原體感染呈正相關(guān)，并建議孕前應(yīng)常規(guī)篩查該病原體。提示生殖道支原體可能在不孕癥女性體內(nèi)長(zhǎng)期且多部位生存。而2016年發(fā)布的中國(guó)生殖道支原體感染診治的專家共識(shí)中明確提及根治解脲支原體相當(dāng)困難，這可能與藥物在陰道酸性環(huán)境下失活以及對(duì)臨床中常用的紅霉素、林可霉素、四環(huán)素等耐藥有關(guān)[6]。

本研究中無(wú)論不孕組女性還是體檢組女性，其生殖道感染的第二位病原體均為念珠菌，而我院2009—2014年住院和門(mén)診患者的分離菌中共有白念珠菌439株(6.9%)，位列第四，且主要標(biāo)本來(lái)源于生殖道[7]?？梢?jiàn)念珠菌感染在女性生殖道感染中的重要地位，且很可能與不孕癥的發(fā)生相關(guān)。唐曉華等[8]于2014年發(fā)表一篇采集不孕婦女陰道分泌物樣本，采用科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基做培養(yǎng)鑒定，結(jié)果收集的454例樣本中共分離出86株念珠菌，其中占前三位的為白念珠菌48株(55.8%)、光滑念珠菌24株(27.9%)、熱帶念珠菌8株(9.3%)。所幸的是針對(duì)念珠菌的臨床治療效果比較滿意，根據(jù)我院2009—2014年分離菌的耐藥分析提示氟康唑的敏感率可達(dá)86.0%～94.0%[7]。

本次調(diào)查研究所得不孕癥女性生殖道衣原體的感染率達(dá)到0.6%(103/16 244)，不僅遠(yuǎn)高于本研究中體檢組女性的感染率，也遠(yuǎn)高于中國(guó)性病監(jiān)測(cè)點(diǎn)報(bào)道2015年我國(guó)Ct感染報(bào)告發(fā)病率37.18/10萬(wàn)[9]。表明Ct感染在不孕癥女性的發(fā)病中極有可能扮演著重要的角色。但是根據(jù)前述Giakoumelou S的Meta分析總結(jié)可得出衣原體感染與繼發(fā)性不孕的最常見(jiàn)病因“流產(chǎn)”之間并不相關(guān)。其他的研究諸如：Abdella RM等[10]使用ELISA法及RT-PCR技術(shù)來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化血清學(xué)檢測(cè)原因不明的不孕女性衣原體感染陽(yáng)性率高達(dá)40%；丁楠等[11]的meta分析發(fā)現(xiàn)單純的Uu或是Ct感染與女性不孕癥相關(guān)。綜上所述，均提示Ct感染與不孕癥的發(fā)生確是息息相關(guān)的，但是具體通過(guò)哪條途徑(是直接病因還是間接致病)現(xiàn)在尚未發(fā)現(xiàn)其確切的致病機(jī)制。但是，對(duì)整個(gè)人口水平而言，防控女性感染后遠(yuǎn)期合并癥才是生殖道沙眼衣原體感染最重要的責(zé)任[12]?？梢?jiàn)Ct感染后所致的輸卵管粘連等可能對(duì)排卵受孕這一基本前提條件造成持續(xù)性破壞，有必要對(duì)Ct做到早干預(yù)、早發(fā)現(xiàn)、早治療。

本研究中采用一般菌培養(yǎng)法在兩組中陰道加德納菌檢出率都很低。但因普通健康體檢套餐項(xiàng)目包含BV快速試驗(yàn)，本次調(diào)查中體檢組所有標(biāo)本均額外檢測(cè)BV快速試驗(yàn)感染陰道加德納菌(采用鄭州安圖綠科公司生產(chǎn)的細(xì)菌性陰道病聯(lián)合測(cè)定試劑盒；根據(jù)唾液酸酶結(jié)果判定：檢測(cè)孔顏色變藍(lán)色或綠色，為陽(yáng)性；不變色，為陰性)。與一般菌培養(yǎng)法所得出的結(jié)論不同，體檢組中測(cè)得唾液酸酶陽(yáng)性者占6.2%(2 224/35 952)(單純BV陽(yáng)性2 108人、合并其他感染116人)。這可能與上述兩種陰道加德納菌檢測(cè)方法不同的特異性和敏感性有關(guān)。但無(wú)論如何，不難看出陰道加德納菌扮演著普通女性生殖道

環(huán)境內(nèi)的重要角色。正常健康女性的生殖道菌群絕大部分為乳酸桿菌，另一部分為潛在的可能產(chǎn)生毒力的微生物例如陰道加德納菌、B組鏈球菌、金黃色葡萄球菌、解脲支原體和人型支原體，致病時(shí)取代了陰道內(nèi)的乳酸桿菌優(yōu)勢(shì)菌群地位，導(dǎo)致細(xì)菌性陰道病[3]。實(shí)際臨床工作中可通過(guò)BV快速試驗(yàn)檢測(cè)唾液酸酶來(lái)判定是否感染陰道加德納菌[13]。遺憾的是，本文中輔助生育和不孕癥門(mén)診的女性患者未常規(guī)篩查該項(xiàng)目，故陰道加德納菌感染是否與本地區(qū)不孕癥發(fā)生相關(guān)有待進(jìn)一步完善研究去證實(shí)。

生殖道感染無(wú)論對(duì)健康女性或不孕人群來(lái)說(shuō)，都是不容忽視的健康問(wèn)題。從本研究結(jié)果來(lái)看，不孕人群比普通體檢人群生殖道感染率顯著增高，極有可能是影響不孕人群生育力的高危因素，應(yīng)繼續(xù)推行生殖道病原體的常規(guī)篩查，并針對(duì)性進(jìn)行相應(yīng)治療。

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