胡澤華，余昭芬，黃 謹(jǐn)，陳薛妃，黃德斌

（湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院，恩施445000）

深Ⅱ度燒傷是傷及皮膚真皮深層而臨界Ⅲ度的燒傷，創(chuàng)面殘留的真皮、毛囊、汗腺和皮脂腺等皮膚附件可增殖形成創(chuàng)面修復(fù)的上皮島［1］。若及時(shí)處理且方法適宜，上皮島形成快，創(chuàng)面愈合快，瘢痕少，全身并發(fā)癥也少。反之，則創(chuàng)面損傷加重，影響上皮島的形成，瘢痕多，甚至攣縮畸形。因此，深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面的早期處理對(duì)燒傷的轉(zhuǎn)歸與愈后有重要意義。研究表明，深Ⅱ度燒傷的快速愈合與創(chuàng)面早期微循環(huán)狀況和后期微血管密度密切相關(guān)［2］。燒傷后創(chuàng)面氧自由基以加重水腫、休克、炎癥反應(yīng)，阻礙修復(fù)細(xì)胞遷移與增殖等一系列氧化應(yīng)激過(guò)程而影響創(chuàng)面愈合［2］。因此，尋找抑制燒傷創(chuàng)面早期氧化應(yīng)激和促進(jìn)創(chuàng)面愈合的外用藥物，是當(dāng)今醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。馬桑水提取物（Coriaria Sinica Maxim’s extract，CSME）能促進(jìn)燒傷創(chuàng)面的修復(fù)，同時(shí)抑制其病理性瘢痕的過(guò)度增生［3］。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討其作用機(jī)制與改善燒傷創(chuàng)面微循環(huán)和抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑與器材

1.1.1 CSME的制備［3］兩年生鮮原生植物枝條，九月采集，經(jīng)植物學(xué)鑒別晾干粉碎備用。取1 kg馬桑粉為樣品，將其用1 000 ml蒸餾水浸泡30 min，煎煮90 min分別提取3次，3次提取物合并、過(guò)濾和水浴鍋濃縮成100%的馬桑提取浸膏（1 ml相當(dāng)于1 g生藥）備用［3］。隨后，按CSME與普通醫(yī)用白凡士林1∶10、5∶10、10∶10比例混合成低劑量、中劑量和高劑量三種外用燒傷軟膏。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠180只（6周，180～220 g），雌雄各半，購(gòu)于三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（中國(guó)宜昌，No.42010200000304）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)器材與試劑 CUT 4050-旋轉(zhuǎn)切片機(jī)（德國(guó)，Leica），BX53倒置顯微鏡和 JEM-1200EX透射電鏡（日本，OLYMPUS），微量移液器（德國(guó) Eppendorf艾本德股份公司），Multiskan FC-51119000酶標(biāo)儀（美國(guó)，Ameritech），ZS83-1型內(nèi)切式組織勻漿器（無(wú)錫德譜儀器制造有限公司），722S分光光度計(jì)（杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司），Optima MAX-XP低溫離心機(jī)（美國(guó)，Beckman Coulter），YLS-5Q燙傷儀（天津科技發(fā)展有限公司）。SP、ELISA試劑盒 B＆D（美國(guó)，Sigma），血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）試劑盒（上海微蒙生物科技有限公司），DAB顯色試劑盒、SP一抗和SABC二抗試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）測(cè)定試劑盒及考馬斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒（北京雷根生物技術(shù)有限公司）。內(nèi)皮素（endothelin，ET）和一氧化氮（nitric oxide，NO）試劑盒（北京杰輝博高生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組、造模及給藥［3］陽(yáng)光與陰影的晝夜節(jié)律1周（溫度24℃±3℃，濕度50%±5%）。隨機(jī)將動(dòng)物分成6組（n＝30）：對(duì)照組（NS）、凡士林組（WPL）、磺胺嘧啶銀組（SSD）、馬桑提取物組低劑量組（CSME-L）、中劑量組（CSME-M）和高劑量組（CSME-H）。常規(guī)配方飼料喂養(yǎng)和自來(lái)水飲水。所有動(dòng)物都保持在晝夜周期（12 h光照，12 h黑暗）的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下的動(dòng)物房?jī)?nèi)。自由攝取食物和水。動(dòng)物治療嚴(yán)格按照國(guó)家衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南進(jìn)行。在學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)的監(jiān)督下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。造模前禁食12 h，10%水合氯醛麻醉（0.3 ml／100 g，ip），背部剪毛3 cm×3 cm，8%Na2S脫毛，溫?zé)崴疀_洗，75%乙醇消毒處理脫毛區(qū)。除NS組外，其他各組均以燙傷儀2.5×2.5 cm探頭燙傷脫毛區(qū)（壓力 500 g，時(shí)間 15 s）［3］。傷后創(chuàng)面分別涂擦NS、WPL、SSD和 CSME燒傷軟膏（低劑量、中劑量、高劑量），腹腔注射乳酸林格氏液5 ml抗休克。每天上午9：00換藥1次，直至21 d。

1.2.2 觀察指標(biāo)及內(nèi)容 愈合率［3］：分別于傷后48 h、7 d、14 d、21 d上午 9：00計(jì)算創(chuàng)面愈合率（創(chuàng)面大小用透明膜描記法）后各組大鼠分別各取6只，以10%水合氯醛麻醉（0.3 ml／100 g，ip）開(kāi)胸暴露心臟，插管至升主動(dòng)脈，快速灌注NS 150 ml，再灌注多聚甲醛（4%，200 ml）后，分別以創(chuàng)面中心直徑 2.5 cm取圓形創(chuàng)面全層皮膚組織修塊后，一部分用于組織學(xué)觀察，另一部分保存于-80℃冰箱備用于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），MDA、SOD、HYP等檢測(cè)。創(chuàng)面愈合率數(shù)據(jù)用 Image-Pro Plus結(jié)合Excel 2000處理，測(cè)量創(chuàng)面愈合率（healing rate，HR），其與原始創(chuàng)面面積（primordial area，PA）和未愈創(chuàng)面面積（no healing area，NHA）關(guān)系為：HR＝完全愈合時(shí)間：記錄創(chuàng)面完全愈合的時(shí)間，其標(biāo)準(zhǔn)為：創(chuàng)面完全被上皮覆蓋，無(wú)殘余缺損，創(chuàng)面色均一而光滑。

1.2.3 創(chuàng)面微血管密度的檢測(cè) 通過(guò)免疫熒光、免疫酶標(biāo)或免疫電鏡法顯示血管內(nèi)皮細(xì)胞。先以石蠟切片脫蠟，干燥箱干燥（60℃，10 min），二甲苯Ⅰ和Ⅱ分別浸泡5 min，梯度乙醇各洗脫5 min，PBS洗脫5 min后，分別以0.25%胰蛋白酶消化行抗原修復(fù)、3%H2O2除內(nèi)源過(guò)氧化酶、一抗、二抗、辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素、DAB顯色劑顯色、蘇木素復(fù)染、氨水返藍(lán)等，鏡下觀察并拍照。以Pareek法計(jì)算微血管密度（microvessel density，MVD）［4］（200倍鏡下計(jì)數(shù)真皮血管豐富處10個(gè)連續(xù)而不重疊微血管數(shù)的平均值）。各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的OD值均以零孔調(diào)零，使用SPSS10.0軟件處理，分別以標(biāo)準(zhǔn)品濃度、OD值為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線，相應(yīng)曲線方程，計(jì)算樣品含量。

1.2.4 創(chuàng)面組織含水量（tissue moisture，TM）的測(cè)定［5］用電子天平精確稱取創(chuàng)面組織200 mg，置于烤箱烘烤24 h（80℃），取出稱重，干濕法計(jì)算組織含水量。計(jì)算方法為［5］：

1.2.5 創(chuàng)面組織學(xué)觀察 實(shí)驗(yàn)時(shí)取出備用創(chuàng)面全層皮膚組織進(jìn)行修塊，用于HE染色。先以多聚甲醛固定2 h，梯度酒精脫水，石蠟包埋切片（厚 5 μm），最后行HE染色，鏡下觀察組織變化情況。

1.2.6 創(chuàng)面組織 VEGF、MDA、SOD、HYP、膠原蛋白、ET和NO的測(cè)定 取創(chuàng)面全層皮膚組織500 mg左右，去痂，以NS漂洗去血液，濾紙拭干稱重。冰浴中剪碎組織，加9倍4℃NS，勻漿機(jī)勻漿后低溫離心（3 000 r／min，10 min），取上清置于液氮中保存?zhèn)溆?。相關(guān)成分檢測(cè)方法均按試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟逐一進(jìn)行檢測(cè)。消化法測(cè)定HYP，NO測(cè)定用Griess比色法測(cè)定（mol／g），按試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)標(biāo)17準(zhǔn)孔，分光光度計(jì)波長(zhǎng)為550 nm讀取OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線［5，6］。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，所有數(shù)據(jù)用SPSS 11.0軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 CSME對(duì)創(chuàng)面愈合的影響

在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，NS與WPL組均無(wú)明顯差異。48 h時(shí)，各組大鼠創(chuàng)面明顯水腫，較原始創(chuàng)面略有擴(kuò)大，無(wú)顯著性差異；7 d時(shí)，各組大鼠創(chuàng)面水腫消失，明顯收縮，創(chuàng)面面積縮小，其中SSD、CSME-L、CSMEM、CSME-H的HR無(wú)明顯差異，均顯著大于NS（P＜0.05）；14 d和 21 d時(shí)，各組創(chuàng)面進(jìn)一步縮小，SSD、CSME-L、CSME-M、CSME-H肉芽組織生長(zhǎng)良好，血管形成豐富，結(jié)痂厚薄均勻，無(wú)明顯滲出液，而NS和WPL肉芽組織少，結(jié)痂厚薄不均勻，黃色滲出液較多，SSD、CSME-L、CSME-M、CSME-H的 HR顯著大于NS（P＜0.05），其中 SSD與 CSME-M相當(dāng)而小于CSME-H（P＜0.05，表 1，圖 1，見(jiàn)彩圖頁(yè)Ⅲ）。

Tab.1 Effects of CSME on the HR of wound tissue in rats（%，±s，n＝6）

Tab.1 Effects of CSME on the HR of wound tissue in rats（%，±s，n＝6）

CSME：Coriaria Sinica Maxim’s extract；HR：Healing rate；NS：Normal saline group；WPL：White petroleum group；SSD：Silver sulfadiazine group*P＜0.05 vs NS；#P＜0.05 vs SSD；△P＜0.05 vs CSME-L；▲P＜0.05 vs CSME-M

Groups 0 h 48 h 7 d 14 d 21 d NS 0.00 -0.87±0.13 15.42±0.84 31.07±2.37 64.34±1.52 WPL 0.00 -1.02±0.10 14.95±1.04 29.84±0.63 66.76±1.44 SSD 0.00 -1.03±0.11 23.11±1.54* 61.21±1.02* 83.14±1.12*CSME-L 0.00 -1.14±0.22 22.07±1.28* 56.46±0.81* 70.24±2.49*CSME-M 0.00 -1.06±0.15 24.62±2.18* 62.61±1.38△ 82.75±1.67△CSME-H 0.00 -0.91±0.07 23.89±2.41* 71.16±1.32#▲ 91.46±2.03#▲

Fig.1 Effects of CSME on healing of wound tissue in rats

2.2 CSME對(duì)創(chuàng)面組織MVD的影響

2.2.1 CSME對(duì)創(chuàng)面組織MVD形態(tài)的影響 在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，NS組與WPL組均無(wú)明顯差異。傷后48 h，各組創(chuàng)面明顯水腫，淺層MVD受損狀況、數(shù)目與形態(tài)無(wú)明顯差異；傷后7 d和14 d，SSD組和CSME各組的MVD排列致密、形態(tài)規(guī)則、大小均勻、充盈良好，新生血管內(nèi)皮細(xì)胞排列整齊，數(shù)量眾多，成熟度良好，明顯優(yōu)于NS；傷后21 d，CSME各組的MVD大小、形態(tài)、排列以及充盈度明顯優(yōu)于SSD，但管徑、數(shù)量和分布方面呈劑量依賴性少于SSD。

2.2.2 CSME對(duì)創(chuàng)面組織MVD數(shù)量的影響 在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，NS組與WPL組均無(wú)明顯差異。燒傷后，各組大鼠創(chuàng)面的MVD隨時(shí)間的推移逐漸增加，直至21 d達(dá)最高峰；在7 d時(shí)，CSME各組的MVD顯著多于 SSD（P＜0.05），并呈現(xiàn)劑量依賴趨勢(shì)；在第 14天時(shí)，SSD與 CSME-M和 CSME-H相當(dāng)；在 21 d時(shí)，CSME各組的MVD較14 d顯著性減少，SSD的MVD繼續(xù)增加，明顯超過(guò) CSME各組（P＜0.05，表 2）。

Tab.2 Effects of CSME on the MVD of wound tissue in rats（piece／mm2，±s，n＝6）

Tab.2 Effects of CSME on the MVD of wound tissue in rats（piece／mm2，±s，n＝6）

CSME：Coriaria Sinica Maxim’s extract；MVD：Microvessel density；NS：Normal saline group；WPL：White petroleum group；SSD：Silver sulfadiazine group*P＜0.05 vs NS；#P＜0.05 vs SSD；△P＜0.05 vs CSME-L；▲P＜0.05 vs CSME-M

Group 48 h 7 d 14 d 21 d NS 8.16±1.04 12.06±2.19 21.24±1.08 32.86±3.57 WPL 7.89±0.87 11.73±3.08 20.01±3.52 30.44±3.06 SSD 8.02±0.38 17.45±4.67* 42.27±4.15* 51.67±4.16*CSME-L 7.95±0.94 15.28±2.01* 27.19±2.18*# 36.01±3.48*#CSME-M 7.78±0.46 22.37±2.53*#△ 41.08±2.43*△ 32.14±4.05*#CSME-H 8.26±0.91 28.11±3.46*#△▲ 43.27±3.39* 34.37±2.64*#

2.3 CSME對(duì)創(chuàng)面組織TM的影響

在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，NS與WPL均無(wú)明顯差異。各組TM于48 h達(dá)最高峰，之后逐漸下降恢復(fù)為損傷前水平。在48 h和7 d，CSME各組呈現(xiàn)劑量依賴性低于其他各組（P＜0.05），在各個(gè)時(shí)相SSD的TM均與NS相當(dāng)。表明SSD對(duì)燒傷后創(chuàng)面組織的急性滲出無(wú)顯著影響，而CSME可顯著減輕創(chuàng)面組織的急性滲出（圖 2）。

Fig.2 Effects of CSME on the TM of wound tissuein rats TM：Tissue moisture

2.4 CSME對(duì)創(chuàng)面組織病理形態(tài)學(xué)的影響

在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，NS與WPL均無(wú)明顯差異。傷后48 h，各組病理學(xué)特征相似，無(wú)顯著差異。第7天，NS創(chuàng)面明顯凹凸不平，可見(jiàn)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，并出現(xiàn)大片壞死組織，新生上皮增殖不明顯，未見(jiàn)初始細(xì)胞層；SSD創(chuàng)面平整度和炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯優(yōu)于NS和WPL，見(jiàn)散在片狀壞死組織，新生上皮偶有增殖，稚嫩細(xì)胞層尚未形成，排列尚可；CSME-L創(chuàng)面平整度和炎細(xì)胞浸潤(rùn)情況與SSD相似，新生上皮增殖存在，稚嫩細(xì)胞層已基本形成，排列尚可；CSME-M創(chuàng)面平整度和炎細(xì)胞浸潤(rùn)情況優(yōu)于SSD，新生上皮增殖明顯，典型稚嫩細(xì)胞層形成，排列良好；CSME-H創(chuàng)面平整度良好，炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，新生上皮增殖典型，典型稚嫩細(xì)胞層形成，排列整齊。

第14天，NS創(chuàng)面凹凸不平，炎細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重，壞死組織散在片狀分布，新生上皮明顯增殖，形成薄的細(xì)胞層，厚薄不均，排列紊亂；SSD創(chuàng)面仍然凹凸不平，較第7天明顯改善，炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，偶見(jiàn)散在片狀壞死組織，見(jiàn)新生上皮增殖，出現(xiàn)少量復(fù)層上皮細(xì)胞，已形成成熟細(xì)胞層，排列尚可；CSME-L與SSD相當(dāng)；CSME-M創(chuàng)面平整，炎細(xì)胞浸潤(rùn)少許，見(jiàn)點(diǎn)狀壞死組織，新生上皮增殖明顯，典型大量復(fù)層上皮細(xì)胞，已形成成熟的較厚細(xì)胞層，排列整齊。深部組織結(jié)構(gòu)（皮脂腺、汗腺等）表淺；CSME-H創(chuàng)面平整，炎細(xì)胞浸潤(rùn)少許，偶見(jiàn)散在點(diǎn)狀壞死組織，新生上皮增殖典型，出現(xiàn)典型多層復(fù)層上皮細(xì)胞層，形成成熟的較厚細(xì)胞層，排列整齊，厚薄均勻，深部組織結(jié)構(gòu)（皮脂腺、汗腺等）表淺。

第21天，NS創(chuàng)面凹凸不平，新生上皮組織嫩薄不均勻，成熟度差，未見(jiàn)表皮釘腳深入真皮層，少數(shù)大鼠創(chuàng)面基本愈合；SSD創(chuàng)面凹凸不平，新生上皮組織嫩薄不均勻，成熟度尚可，少見(jiàn)表皮釘腳深入真皮層，多數(shù)大鼠創(chuàng)面基本愈合；CSME-L創(chuàng)面平整，新生上皮組織厚而均勻，成熟度尚可，較多表皮釘腳深入真皮層，所有大鼠創(chuàng)面基本愈合；CSME-M創(chuàng)面平整，新生上皮組織較厚而均勻，成熟度良好，表皮釘腳廣泛深入真皮層，所有大鼠創(chuàng)面基本愈合；CSMEH創(chuàng)面平整，新生上皮組織厚而均勻，成熟度好，表皮釘腳廣泛深入真皮層，所有大鼠創(chuàng)面基本愈合（圖3，見(jiàn)彩圖頁(yè)Ⅲ）。

Fig. 3 Staining results of wound tissue（HE×100）

2.5 CSME對(duì)大鼠創(chuàng)面組織 VEGF、SOD、MDA、HYP和NO的影響

2.5.1 CSME對(duì)大鼠創(chuàng)面組織VEGF含量的影響

在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，NS組與WPL組均無(wú)明顯差異。傷后48 h，CSME各組創(chuàng)面組織的VEGF呈劑量依賴性顯著高于 NS、WPL和 SSD（P＜0.05）；隨著時(shí)間的推移，各組逐漸升高，7 d達(dá)到最高，以后逐漸下降；傷后7 d、14 d，CSME各組呈現(xiàn)劑量依賴性高于NS、WPL和 SSD（P＜0.05）；傷后 21 d，各組均降至最低，其中 CSME呈劑量依賴性低于 NS、WPL和 SSD（P＜0.05，表 3）。

2.5.2 CSME對(duì)大鼠創(chuàng)面組織 SOD、HYP和 MDA的影響 在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，NS與WPL均無(wú)明顯差異。隨時(shí)間的推移，各組各時(shí)間段創(chuàng)面組織SOD活性逐漸增強(qiáng)和HYP含量逐漸增多。傷后48 h、7 d、14 d、21 d，NS、WPL、SSD的 SOD活性和 HYP含量無(wú)顯著性差異；CSME各組SOD活性和HYP含量呈劑量依賴性強(qiáng)于 NS、WPL、SSD（P＜0.05）；傷后7 d、14 d、21 d時(shí)間段SSD的SOD活性顯著弱于其他各組。各時(shí)間段各組創(chuàng)面組織MDA活性呈劑量依賴性減弱；傷后各時(shí)間段，NS與WPL的MDA活性無(wú)顯著性差異；SSD的MDA活性顯著強(qiáng)于其他各組（P＜0.05）；CSME各組MDA活性呈劑量依賴性弱于NS、WPL、SSD（P＜0.05，表 4、表 5、表 6）。

Tab.3 Effects of CSME on the VEGF of wound tissue in rats（10-12g／g，±s，n＝6）

Tab.3 Effects of CSME on the VEGF of wound tissue in rats（10-12g／g，±s，n＝6）

CSME：Coriaria Sinica Maxim’s extract；VEGF：Vascular endothelial growth factor；NS：Normal saline group；WPL：White petroleum group；SSD：Silver sulfadiazine group*P＜0.05 vs NS；#P＜0.05 vs SSD；△P＜0.05 vs CSME-L；▲P＜0.05 vs CSME-M

Group 48 h 7 d 14 d 21 d NS 18.69±1.07 30.52±1.19 32.08±2.04 23.68±0.63 WPL 17.93±1.14*#▲ 31.79±1.27 31.17±1.71 21.02±1.35*#△SSD 20.04±1.26 29.28±1.48*#▲ 32.62±1.15 22.19±1.64*#△CSME-L 24.71±1.51*#▲ 34.83±1.08*# 27.57±1.47 17.84±1.41*#▲CSME-M 30.86±2.06*#△ 38.15±2.11*#△ 28.93±1.05 12.11±1.28*#△CSME-H 31.45±2.37*#△ 41.63±2.24*#△▲ 29.61±1.43 13.04±0.79*#△

Tab.4 Effects of CSME on the SOD activity of wound tissue in rats（NU／mg·prot，±s，n＝6）

Tab.4 Effects of CSME on the SOD activity of wound tissue in rats（NU／mg·prot，±s，n＝6）

SOD：Superoxide dismutase*P＜0.05 vs NS；#P＜0.05 vs SSD；△P＜0.05 vs CSME-L；▲P＜0.05 vs CSME-M

Group 48 h 7 d 14 d 21 d NS 4.28±0.12 6.89±0.08 10.07±0.04 14.83±0.48 WPL 3.97±0.08 6.03±0.29 10.76±0.17 15.01±0.76 SSD 4.03±0.27 4.67±0.07* 7.14±0.05* 10.39±0.62*CSME-L 5.68±0.04*# 9.28±2.01*# 12.25±0.33*# 14.62±0.46*#CSME-M 7.73±0.17#△ 11.37±0.04*#△ 15.31±0.46*#△ 17.04±0.71*#△CSME-H 8.89±0.31*#△▲ 13.35±0.52*△▲ 17.68±0.43*△▲ 18.87±0.61*△▲

Tab.5 Effects of CSME on the HYPof wound tissue in rats（μg／mg，±s，n＝6）

Tab.5 Effects of CSME on the HYPof wound tissue in rats（μg／mg，±s，n＝6）

HYP：Hydroxyproline*P＜0.05 vs NS；#P＜0.05 vs SSD；△P＜0.05 vs CSME-L；▲P＜0.05 vs CSME-M

Group 48 h 7 d 14 d 21 d NS 28.14±1.12 43.51±2.17 59.04±2.09 71.68±1.75 WPL 27.86±1.34 44.07±2.26 57.87±1.62 72.04±2.86 SSD 28.09±1.18 43.68±1.96 58.04±2.49 71.38±2.37 CSME-L 27.73±2.03 52.46±2.38*# 65.73±2.51*# 76.53±1.58*#CSME-M 29.82±1.07 59.12±1.93*#△ 73.24±1.64*#△ 82.65±1.87*#△CSME-H 33.96±2.14*#△ 67.58±2.41*#△▲ 81.61±2.84*#△▲ 89.05±2.43*#△▲

Tab.6 Effects of CSME on the MDA content of wound tissue in rats（nmol／mg prot，±s，n＝6）

Tab.6 Effects of CSME on the MDA content of wound tissue in rats（nmol／mg prot，±s，n＝6）

MDA：Malondialdehyde*P＜0.05 vs NS；#P＜0.05 vs SSD；△P＜0.05 vs CSME-L；▲P＜0.05 vs CSME-M

Group 48 h 7 d 14 d 21 d NS 7.51±0.34 5.82±0.13 4.84±0.09 2.67±0.24 WPL 7.84±0.27 6.01±0.37 5.04±0.28 2.59±0.14 SSD 8.93±0.45 7.04±0.12* 6.27±0.16* 4.84±0.09*CSME-L 6.79±0.39*# 6.01±0.03*# 4.65±0.27*# 3.73±0.17*#CSME-M 5.11±0.42#△ 4.46±0.06*#△ 3.65±0.46*#△ 2.62±0.24*#△CSME-H 4.29±0.31*#△▲ 3.35±0.22*△▲ 2.72±0.15*△▲ 1.43±0.01*△▲

2.5.3 CSME對(duì)大鼠創(chuàng)面組織NO和ET的影響

在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，NS與WPL均無(wú)明顯差異。傷后48 h，各組創(chuàng)面組織NO含量達(dá)高峰，之后下降。傷后48 h、7 d、14 d、21 d，CSME-L顯著低于 NS、WPL、SSD而高于 CSME-M和 CSME-H（P＜0.05），而 CSME-M與CSME-H相當(dāng)，而顯著低于其他組（P＜0.05，表7）。燒傷后，各組創(chuàng)面組織ET含量隨時(shí)間持續(xù)升高，7 d達(dá)高峰，隨后下降；14 d，CSME-M與CSME-H的ET相當(dāng)，顯著低于其他組（P＜0.05）；SSD顯著低于 NS、WPL，顯著高于 CSME-L（P＜0.05）。21 d CSME-M和CSME-H顯著高于其他各組和正常組織（P＜0.05），SSD顯著低于其他各組（P＜0.05，表8）。

Tab.7 Effects of CSME on the NO content of wound tissue in rats（10-9 mol／g，±s，n＝6）

Tab.7 Effects of CSME on the NO content of wound tissue in rats（10-9 mol／g，±s，n＝6）

CSME：Coriaria Sinica Maxim’s extract；NO：Nitric oxide；NS：Normal saline group；WPL：White petroleum group；SSD：Silver sulfadiazine group*P＜0.05 vs NS；#P＜0.05 vs SSD；△P＜0.05 vs CSME-L；▲P＜0.05 vs CSME-M

Group Normal tissue 48 h 7 d 14 d 21 d NS 3.03±0.07 16.93±0.51 14.74±0.08 11.47±0.15 7.28±0.05 WPL 2.97±0.04 17.68±0.46 15.03±0.21 12.19±0.13 6.02±0.04 SSD 3.15±0.12 16.75±0.62 14.39±0.13 10.92±0.08 7.84±0.03 CSME-L 2.89±0.09 13.64±0.28* 9.64±0.15*# 8.33±0.06*# 5.18±0.07*#CSME-M 2.71±0.05 12.86±0.49* 7.59±0.06*#△ 2.88±0.02*#△ 2.42±0.01*#△CSME-H 3.08±0.13 13.09±0.61* 6.13±0.03*#△▲ 3.27±0.07*#△ 2.11±0.02*#△

Tab.8 Effects of CSME on the ET content of wound tissue in rats（10-12 mol／g，±s，n＝6）

Tab.8 Effects of CSME on the ET content of wound tissue in rats（10-12 mol／g，±s，n＝6）

ET：Endothelin*P＜0.05 vs NS；#P＜0.05 vs SSD；△P＜0.05 vs CSME-L；▲P＜0.05 vs CSME-M

Group Normal tissue 48 h 7 d 14 d 21 d NS 8.174±0.622 9.468±0.372 15.315±0.127 11.238±0.513 8.542±0.146 WPL 8.381±0.413 9.371±0.294 15.103±0.206 11.175±0.218 8.298±0.325 SSD 8.097±0.564 8.624±0.316 13.316±0.318* 9.183±0.346* 5.327±0.261*CSME-L 8.411±0.616 10.537±0.425*# 11.204±0.409*# 8.048±0.257*# 9.026±0.572*#CSME-M 8.263±0.273 11.004±0.217*# 11.137±0.612*# 5.583±0.609*#△ 9.821±0.411*#CSME-H 8.029±0.348 11.831±0.104*# 10.981±0.248*# 5.796±0.517*#△ 10.005±0.152*#△

3 討論

深Ⅱ度燒傷若處理不當(dāng)，加重上皮島的損傷，影響創(chuàng)面愈合，增加瘢痕形成［4，7］。馬桑 （Coriarianepalensis Wall.），又稱千年紅，主要成分為馬桑毒素（coriamyrtin）、羥基馬桑毒素（tutin）、馬桑亭（coriatin）、含鞣質(zhì)（tannin）、多糖（polysaccharide）及樹(shù)脂等［3］。中國(guó)民間一直沿用馬桑水提取物作治療經(jīng)久不愈的皮膚潰瘍和燒傷創(chuàng)面愈合［3，8］。我們?cè)芯堪l(fā)現(xiàn)［3，9］，CSME對(duì)大鼠背部皮膚深Ⅱ度燒傷具有顯著的治療作用。本研究發(fā)現(xiàn)，CSME早期促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)，后期阻止瘢痕的過(guò)度增生的機(jī)制是：因NO為重要的細(xì)胞生長(zhǎng)雙重調(diào)控因子，ET是存在于血管內(nèi)皮的重要細(xì)胞因子，對(duì)于維持血管張力具有重要作用。NO有抑制ET合成效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)創(chuàng)面修復(fù)早期，CSME增加NO合成，減少ET含量，從而增加新生血管的數(shù)量，增強(qiáng)創(chuàng)面組織營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。但CSME呈劑量依賴性抑制NO的過(guò)多合成，減輕創(chuàng)面組織因NO作用的炎性滲出與水腫，縮短急性滲出期，加快創(chuàng)面修復(fù)。創(chuàng)面修復(fù)后期，CSME抑制NO的合成，增加ET的合成，減少新生血管密度，規(guī)則血管形態(tài)，縮小血管管徑，減少血管充盈，從而減輕瘢痕組織的填充。

大量研究證實(shí)，燒傷后創(chuàng)面氧化應(yīng)激反應(yīng)的啟動(dòng)促進(jìn)創(chuàng)面瘀滯帶擴(kuò)大，影響創(chuàng)面愈合［6，10］。燒傷創(chuàng)面的修復(fù)也就是創(chuàng)面各種修復(fù)細(xì)胞增殖、分泌蛋白及成纖維細(xì)胞的修復(fù)過(guò)程［5，11］。創(chuàng)面組織中膠原成分HYP是膠原含量的標(biāo)志，體現(xiàn)創(chuàng)面愈合的程度與質(zhì)量。燒傷后，創(chuàng)面組織產(chǎn)生氧自由基，通過(guò)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)放大活性氧作用，產(chǎn)生具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒作用的MDA、氫過(guò)氧基等脂質(zhì)過(guò)氧化物，導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂甚至細(xì)胞凋亡［7］。SOD能清除氧自由基而阻止脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，防止細(xì)胞受損。本研究認(rèn)為CSME促進(jìn)早期燒傷創(chuàng)面愈合與增強(qiáng)SOD和抑制MDA的活性而阻止細(xì)胞凋亡有關(guān)，同時(shí)，早期增加HYP的合成，加快膠原蛋白的合成。

VEGF是加速新生血管形成的重要細(xì)胞因子，在燒傷創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中，有效調(diào)節(jié)著血管內(nèi)皮的快速增殖，促使創(chuàng)面微血管快速形成以保證創(chuàng)面組織營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與氧供應(yīng)，有助于加速創(chuàng)面愈合。我們?cè)l(fā)現(xiàn)，CSME在促進(jìn)燒傷創(chuàng)面愈合的同時(shí)，通過(guò)調(diào)控Ⅰ型與Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)比值而阻止病理性瘢痕的過(guò)度增生［3］。本研究發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)面修復(fù)的早期，CSME通過(guò)促進(jìn)VEGF的合成而促進(jìn)創(chuàng)面組織新生血管的形成而加快創(chuàng)面的修復(fù)。在創(chuàng)面修復(fù)的后期，調(diào)控VEGF的合成，延緩新生血管的過(guò)度增生，同時(shí)調(diào)控Ⅰ型與Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)比值而阻止病理性瘢痕的過(guò)度增生［3］。

總之，馬桑水提取物對(duì)深Ⅱ度燒傷顯示出良好的治療作用。其主要作用機(jī)制是通過(guò)調(diào)控NO、ET、HYP、MDA、SOD而影響燒傷后全身或局部組織氧化應(yīng)激過(guò)程，減輕組織器官損傷。且早期促進(jìn)與新生血管增生有關(guān)的VEGF表達(dá)，后期抑制VEGF的表達(dá)，在促進(jìn)創(chuàng)面早期愈合的同時(shí)，阻止創(chuàng)面瘢痕過(guò)度增生，這對(duì)于燒傷治療具有重要臨床價(jià)值。

【參考文獻(xiàn)】

［1］ 谷廷敏，谷 陽(yáng)，隋志甫，等.燒傷創(chuàng)面內(nèi)表皮生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子受體、C-myc三種基因表達(dá)變化的臨床觀察［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2010，14（9）：1431-1434.

［2］ 王 瑩，代彥麗，樸金龍，等.炎癥因子、生長(zhǎng)因子以及凋亡因子在壓瘡慢性難愈合性創(chuàng)面中的表達(dá)及作用［J］.中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志，2017，33（2）：181-184.

［3］ 黃德彬，胡澤華，余昭芬，等.馬桑提取物促進(jìn)大鼠燒傷創(chuàng)面愈合的作用和機(jī)制［J］.中國(guó)病理生理雜志，2013，29（1）：138-144.

［4］ 王 達(dá).鋅—金屬硫蛋白對(duì)深Ⅱ度燙傷大鼠創(chuàng)面愈合影響的實(shí)驗(yàn)研究［D］.重慶：第三軍醫(yī)大學(xué)，2009.

［5］ 毛挺挺，方紅波，王曉慧，等.堿性成纖維生長(zhǎng)因子對(duì)大鼠成肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的作用及其機(jī)制［J］.中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志，2017，33（2）：159-163.

［6］ 王文婷，單 菲，王曉川，等.TGF-β1對(duì)糖尿病大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面愈合的影響［J］.山東大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2011，49（7）：19-23.

［7］ 唐世杰，朱鎮(zhèn)森，胡素鑾，等.TGF-β3基因轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞促進(jìn)大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面愈合的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中華損傷與修復(fù)雜志（電子版），2010，5（1）：26-29.

［8］ 廖 紅，董志傅，潔 民，等.殼聚糖對(duì)大鼠Ⅲ度燒傷創(chuàng)面EGF和PDGF表達(dá)的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2006，22（11）：1375-1378.

［9］ 黃德斌，胡澤華，余昭芬，等.馬桑水提取物對(duì)燒傷創(chuàng)面感染常見(jiàn)3種耐藥菌的抑制作用［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2016，32（10）：1388-1394.

［10］劉文忠，陳志剛，孫同柱，等.大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面愈合中血管形成與血流變化特點(diǎn)［J］.中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2009，18（3）：328-331.

［11］鄧虎平.燙傷大鼠骨骼肌AMPK的活化對(duì)蛋白分解的作用及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制［D］.北京：軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院，2010：17-113.