戴沈艷，溫 騰,2,3,4，張金波,2,3,4*，蔡祖聰 ,3,4

?

酸性土壤中亞硝態(tài)氮提取方法的改進①

戴沈艷1，溫 騰1,2,3,4，張金波1,2,3,4*，蔡祖聰1,3,4

(1 南京師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院，南京 210023；2 江蘇省地理環(huán)境演化國家重點實驗室培育建設(shè)點，南京 210023；3 江蘇省地理信息資源開發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210023；4 南京師范大學(xué)虛擬地理環(huán)境教育部重點實驗室，南京 210023)

亞硝態(tài)氮(NO– 2-N)是土壤硝化和反硝化過程中很重要的一種中間產(chǎn)物，與土壤中含氮氣體的產(chǎn)生密切相關(guān)。NO– 2-N在土壤中的轉(zhuǎn)化極其迅速，尤其在強酸性條件下NO– 2-N極不穩(wěn)定，2 mol/L KCl溶液提取過程中會大量發(fā)生分解。為了更準(zhǔn)確地研究酸性土壤中的NO– 2-N變化，必須選擇合適的提取劑，以實現(xiàn)土壤中NO– 2-N的高效提取。本文采用15N標(biāo)記方法，系統(tǒng)比較了不同方法提取土壤NO– 2-N和NH4+-N的回收率，提出了改進措施。結(jié)果顯示：調(diào)節(jié)強酸性土壤初始pH為6.0和8.0處理，經(jīng)2 mol/L KCl溶液提取，提取液的pH分別保持在4.8和5.8左右，顯著高于對照(3.8)。pH與振蕩時間對酸性土壤NO– 2-N和NH4+-N的回收率存在顯著的交互影響。振蕩時間30 min以內(nèi)，pH 6.0和pH 8.0處理，NO– 2-N的回收率最高；而振蕩時間為30 min時，未調(diào)節(jié)pH和pH 6.0處理NH4+-N的回收率最高。綜合考慮，提取土壤無機氮時，土壤/KCl懸浮液的pH保持在5.0 ~ 6.0，振蕩時間30 min，能同時滿足對土壤NO– 2-N和NH4+-N的提取。對于強酸性土壤(pH<6.0)，本研究推薦使用KCl溶液和pH8.4的緩沖液混合溶液(KCl溶液/緩沖液比為4/1)作為提取液(土/液比為1/5)。對于pH在7.5以上的土壤樣品，推薦使用KCl溶液和pH 7.5的緩沖液混合溶液(KCl溶液/緩沖液比為4/1)作為提取液(土/液比為1/5)。對于pH在6.0 ~ 7.5的土壤樣品，可以直接使用2 mol/L KCl溶液提取。

亞硝態(tài)氮；回收率；pH緩沖液；酸性土壤

亞硝態(tài)氮(NO– 2-N)是硝化和反硝化過程中很重要的一種中間產(chǎn)物[1-2]，由于NO– 2-N在土壤中的轉(zhuǎn)化極其迅速[3]，長期以來被大多數(shù)學(xué)者認為是瞬間產(chǎn)物，在土壤氮的動態(tài)研究中經(jīng)常被忽略[4-6]。但是當(dāng)一些環(huán)境因素導(dǎo)致NO– 2-N的消耗速率低于產(chǎn)生速率時，NO– 2-N會在環(huán)境中積累。土壤中積累的NO– 2-N可能會引起一系列的環(huán)境問題，NO– 2-N具有一定的毒性，能降低血液的載氧能力，導(dǎo)致高鐵血紅蛋白血癥，甚至誘發(fā)硝化系統(tǒng)癌變[7-8]，因此當(dāng)土壤中的NO– 2-N進入水生生態(tài)系統(tǒng)時，會對人類和其他生物的健康產(chǎn)生影響。此外，NO– 2-N會與土壤中其他物質(zhì)反應(yīng)，生成NO、NO2、N2O和CH3ONO等物質(zhì)，可能會破壞平流層中的臭氧[9-11]，還會引起對流層中臭氧的形成，導(dǎo)致酸雨、溫室氣體增多等現(xiàn)象[1,12-13]。目前，NO– 2-N在食物、水體、土壤中的來源及重要性愈加受到關(guān)注。準(zhǔn)確地測定土壤中NO– 2-N的含量，將有助于加深對土壤氮轉(zhuǎn)化過程的認識。

2 mol/L KCl溶液提取土壤無機氮是一種普遍使用的經(jīng)典方法，但在提取酸性土壤NO– 2-N時，由于回收率遠低于100%，土壤NO– 2-N含量會被大大低估[14]。國內(nèi)學(xué)者在研究土壤NO– 2-N動態(tài)時，常忽略KCl提取劑的這一問題[8,15-17]。Stevens和Laughlin[14]及Homyak等[18]嘗試解決這一問題，已有的結(jié)果表明：當(dāng)用去離子水取代2 mol/L KCl溶液時，土壤/水懸浮液較土壤/KCl懸浮液難過濾，而且水提取液儲存過程中NO– 2-N更不穩(wěn)定；改用KOH溶液提高土壤/KCl懸浮液的pH，會明顯增加NO– 2-N的回收率，但是由于酸性土壤具有較強的緩沖能力，振蕩后提取液的pH仍會下降，NO– 2-N還是會有所損失，而且此方法操作繁瑣，增加了試驗的時間。另外，pH較高的條件下，容易發(fā)生氨揮發(fā)損失，所以需要綜合考慮提取條件，以實現(xiàn)土壤樣品NH4+-N、NO– 3-N、NO– 2-N的同時提取。

為此，本文選用5種不同pH的土壤，研究了不同pH、不同提取時間對于酸性土壤中NO– 2-N、NH4+-N回收率的影響；同時研究了不同緩沖溶液對于土壤/KCl懸浮液pH的調(diào)節(jié)能力，以期簡化KOH溶液調(diào)節(jié)土壤/KCl懸浮液pH的繁瑣過程，改進土壤NO– 2-N提取方法，同時滿足NH4+-N、NO– 3-N的提取要求。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

選取5種不同pH的土壤，分別為江西雙圳林場紅壤(SZ，pH水4.5)、江西龍虎山水稻土(LHS，pH水5.2)、江蘇宜興水稻土(YX，pH水6.2)、內(nèi)蒙古錫林浩特栗鈣土(NM，pH水7.4)和四川鹽亭紫色土(YT，pH水7.8)。采樣深度為0 ~ 15 cm，過2 mm篩后，一部分于4℃保存?zhèn)溆?，另一部分在室溫下風(fēng)干，測定土壤理化性質(zhì)。供試土壤的主要理化性質(zhì)見表1。

表1 供試土壤基本理化性質(zhì)

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 pH和提取時間對土壤中NO– 2-N、NH4+-N回收率的影響試驗 選取一種強酸性土壤(SZ，pH水4.5)，稱取新鮮土(相當(dāng)于烘干土20 g)置于250 ml三角燒瓶中。設(shè)置pH和提取時間交互處理試驗，3個pH處理，即未調(diào)節(jié)pH(pH 4.5左右)、pH 6.0、pH 8.0處理，每個pH處理再設(shè)置4個提取時間，即振蕩10、20、30、60 min，共12個處理。每個處理分別設(shè)置15NO– 2-N和15NH4+-N兩組標(biāo)記，即一組加入Na15NO2溶液(15N豐度2 atom%)，另外一組加入(15NH4)2SO4溶液(15N豐度5.34 atom%)，3次重復(fù)，共72瓶。由于酸性土壤中NO– 2-N背景值較低，為能準(zhǔn)確地檢測NO– 2-N濃度和豐度的變化，本試驗NO– 2-N的加入量為3 mg/kg，與Stevens和Laughlin[14]的研究相似；而NH4+-N的加入量參照了供試土壤NH4+-N背景值(11.1 mg/kg)，設(shè)置為10 mg/kg。使用KOH溶液調(diào)節(jié)土壤/2 mol/L KCl懸浮液pH到試驗設(shè)定值(土/水=1/2.5測定pH)，迅速加入標(biāo)記物后，馬上按照預(yù)定提取時間振蕩提取，過濾后測定濾液中的NH4+-N、NO– 3-N、NO– 2-N含量和15NH4+-N、15NO– 2-N中15N豐度，同時測定提取液pH。

1.2.2 pH緩沖溶液調(diào)節(jié)提取液pH效果試驗 配制pH緩沖溶液：將1/15 mol/L的磷酸二氫鉀溶液和磷酸氫二鈉溶液[19]按不同比例混合，配制成pH為7.5、8.0、8.4的磷酸鹽緩沖溶液。同時配制濃度為2、2.5和3.33 mol/L的KCl溶液。以SZ、LHS、YX、NM、YT五種土壤為研究對象，每個土壤稱取若干份新鮮土(相當(dāng)于烘干土10 g)至100 ml三角燒瓶中，設(shè)置3種處理：①對照，即不加緩沖液，直接加50 ml 2 mol/L KCl溶液后搖勻，靜置，測定pH，后置于搖床，200 r/min，分別振蕩10、20、30、60 min后測定pH；②10 ml緩沖溶液處理，即提取液為40 ml 2.5 mol/LKCl溶液和10 ml緩沖溶液混合溶液，其中SZ和LHS加入pH 8.4的緩沖溶液，YX加入pH 8.0緩沖溶液，NM和YT加入pH 7.5緩沖溶液，其余操作同①；③20 ml緩沖溶液處理，即提取液為30 ml 3.33 mol/L KCl溶液和20 ml緩沖溶液混合溶液，其中SZ和LHS加入pH 8.4的緩沖溶液，YX加入pH 8.0的緩沖溶液，NM和YT加入pH 7.5的緩沖溶液，其余操作同①。研究不同緩沖液處理對pH的調(diào)節(jié)效果。

1.2.3 土壤NO– 2-N動態(tài)試驗 選取SZ和YT兩種土壤，每個土壤稱取新鮮土(相當(dāng)于烘干土10 g)，置于100 ml三角燒瓶中，共45個瓶子，調(diào)節(jié)含水量至40%WHC，預(yù)培養(yǎng)3 d后，調(diào)節(jié)含水量至60%WHC，保鮮膜封口，扎孔保證通氣，置于25 ℃恒溫箱培養(yǎng)，并每隔3 d稱重補水。在培養(yǎng)的0、1、3、5、10 d進行破壞性取樣。設(shè)置3種不同提取方法處理：①加50 ml 2 mol/L KCl溶液(CK)；②加入40 ml 2.5 mol/L KCl溶液和10 ml緩沖液混合溶液(T1)；③加入30 ml 3.33 mol/L KCl溶液和20 ml緩沖液混合溶液(T2)，置于搖床，200 r/min，振蕩30 min后過濾，測定濾液中的NO– 2-N含量。

1.3 分析方法

NH4+-N、NO– 3-N、NO– 2-N含量測定：使用連續(xù)流動分析儀(SKALAR SAN++)測定。15N豐度測定：使用同位素比值質(zhì)譜儀(Thermo delta V plus)測定，其中15NH4+-N中15N豐度樣品采用擴散法制備[20]，15NO– 2-N中15N豐度樣品采用N2O產(chǎn)生法制備[21]。土壤pH測定：采用pH計(METTLER TOLEDO S220 Seven Compact)測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

回收率計算：

式中：為回收率，%；1為加入的氮濃度，mg/kg；2為提取測定的氮濃度，mg/kg；1為添加的15N豐度，atom%；2為提取后測定的15N豐度，atom%。

測定得到的數(shù)據(jù)采用Excel 2010進行數(shù)據(jù)處理，使用方差分析(SPSS16.0)檢驗各處理間的差異顯著性，采用Origin 8.0繪圖。

2 結(jié)果

2.1 提取過程中土壤提取液pH的變化

表1數(shù)據(jù)表明，2 mol/L KCl/土壤懸濁液pH要明顯低于水/土壤懸濁液。試驗1供試土壤(SZ)2 mol/L KCl/土壤懸濁液pH僅為3.8。振蕩10 min時，不同處理KCl提取液的pH均明顯下降，pH 4.5、pH 6.0和pH 8.0處理的pH分別為3.8、4.8和5.8(圖1)。之后，提取液pH相對穩(wěn)定。

圖1 不同振蕩時間下提取液pH變化

2.2 不同pH和振蕩時間對酸性土壤NO– 2-N、NH4+-N回收率的影響

試驗結(jié)果表明，不同pH處理的NO– 2-N回收率差異顯著(圖2)。隨著pH的升高，NO– 2-N的回收率也隨之升高。未調(diào)節(jié)pH處理(pH 4.5)，NO– 2-N回收率僅為21% ~ 63%；雖然振蕩10 min后，調(diào)節(jié)pH處理的pH均大幅下降，但是NO– 2-N回收率(>90%)均顯著高于未調(diào)節(jié)pH處理。振蕩時間也影響NO– 2-N的回收率(圖2)。隨著振蕩時間的增加，NO– 2-N回收率下降，與振蕩時間為10、20、30 min相比，振蕩時間60 min NO– 2-N回收率下降更多，這種現(xiàn)象在未調(diào)節(jié)pH處理尤為明顯，其振蕩60 min后NO– 2-N的回收率僅為振蕩10 min時的30%。除振蕩60 min外，pH 6.0和pH 8.0處理間差異不顯著，NO– 2-N回收率均>92%。振蕩60 min時，pH 6.0處理NO– 2-N回收率顯著低于pH 8.0處理。雙因素方差分析結(jié)果表明，pH與振蕩時間對NO– 2-N的回收率存在顯著的交互影響。振蕩時間30 min以內(nèi)，pH 8.0處理NO– 2-N的回收率最高，但是與pH 6.0處理差異不顯著。

(圖中不同小寫字母表示不同pH處理在同一振蕩時間回收率差異在P＜0.05水平顯著；不同大寫字母表示同一pH處理在不同提取時間回收率差異在P＜0.05水平顯著；下同)

NH4+-N的回收率與NO– 2-N有所不同(圖3)。除振蕩30 min處理外，調(diào)節(jié)pH對NH4+-N的回收率影響不大；而振蕩時間對NH4+-N的回收率有顯著的影響，振蕩30 min NH4+-N的回收率最高，顯著高于其他振蕩時間，振蕩10 min和20 min NH4+-N的回收率最低。雙因素方差分析結(jié)果表明，pH與振蕩時間對NH4+-N的回收率存在顯著的交互影響。振蕩時間為30 min，未調(diào)節(jié)pH和pH 6.0處理回收率最高，顯著高于其他處理。

2.3 緩沖溶液對土壤提取液pH的影響

加入緩沖液后，隨著振蕩時間的增加，所有供試土壤的pH均逐漸下降，特別是強酸性土壤(SZ)，pH在振蕩10 min內(nèi)就迅速下降，振蕩60 min后，加入10 ml和20 ml緩沖液處理，pH從開始的6.18分別下降為5.0和6.0。其余土壤pH隨著振蕩時間的變化幅度小于SZ，振蕩過程中pH均能保持在6.0 ~ 7.0。

2.4 NO– 2-N提取方法的改進效果

結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)時間的增加，供試土壤中NO– 2-N含量逐漸增加。強酸性土壤(SZ)添加10 ml和20 ml緩沖液處理提取測定的NO– 2-N含量差異不大，均明顯高于CK處理，培養(yǎng)10 d后，測定的土壤NO– 2-N含量是CK的2.5倍(圖5A)。四川鹽亭堿性紫色土(YT)，隨著培養(yǎng)時間的增加，土壤中NO– 2-N含量也逐漸增加。但是在整個培養(yǎng)過程中，3種不同處理的NO– 2-N含量均未有顯著差異(圖5B)。

圖3 不同pH、不同振蕩時間下NH4+-N的回收率

(圖中SZ為江西雙圳林場紅壤，LHS為江西龍虎山水稻土，YX為江蘇宜興水稻土， NM為內(nèi)蒙古錫林浩特栗鈣土；YT為四川鹽亭紫色土)

(CK為不加緩沖液，T1為加入10 ml緩沖液，T2為加入20 ml緩沖液)

3 討論

本研究結(jié)果表明，未調(diào)節(jié)土壤/KCl懸浮液pH條件下，2 mol/L KCl溶液提取強酸性土壤NO– 2-N的回收率僅為21% ~ 63%，而調(diào)節(jié)初始pH為6.0和8.0后(土/水=1/2.5)，NO– 2-N的回收率顯著高于對照，說明土壤中的NO– 2-N的提取測定結(jié)果與提取液pH密切相關(guān)。由于土壤的緩沖能力和KCl溶液的影響，提取過程中pH 6.0和pH 8.0處理的土壤/KCl懸浮液pH保持在4.8和5.8，該條件下NO– 2-N回收率均達到90% 以上。Nelson and Bremner[22]的研究也發(fā)現(xiàn)，pH在4.8 ~ 6.0(土/水=1/2.5)之間時NO– 2-N的回收率平均為69%，但是當(dāng)pH為7.1 ~ 7.8時，平均回收率達95%。如果考慮到KCl溶液會明顯降低懸浮液pH，Nelson 和 Bremner[22]的結(jié)果與本研究的結(jié)果應(yīng)該基本一致。已有的研究表明，在強酸性環(huán)境下，NO– 2-N極易轉(zhuǎn)化為HNO2，HNO2隨后自我分解，主要產(chǎn)生NO，再進一步氧化為NO2[23]。當(dāng)pH升高時，NO– 2-N的分解受到限制，所以NO– 2-N損失減少[17,24]。同時NO– 2-N的回收率還與提取時間有關(guān)，隨著提取時間的增加，回收率顯著下降。Stevens 和Laughlin[14]也觀測到提取時間為10 min時NO– 2-N平均回收率(86%)是提取70 min的3倍。本研究結(jié)果表明，pH與振蕩時間對NO– 2-N的回收率存在顯著的交互影響，振蕩時間30 min以內(nèi)，提取液pH保持在5.0左右，NO– 2-N的回收率可> 92%。雖然在提取過程中保持pH越高(如pH 7 ~ 8之間)可以保證獲得較高的NO– 2-N回收率[22]，但是較高的pH環(huán)境和長時間的振蕩可能會促進氨的揮發(fā)損失，從而低估土壤NH4+-N的含量。本研究的結(jié)果表明，提取液pH保持在5.0左右，振蕩時間為30 min時，NH4+-N的回收率最高。綜合考慮，提取酸性土壤無機氮的最優(yōu)條件是：提取液pH保持在5.0 ~ 6.0，振蕩提取時間30 min，能同時保證土壤NH4+-N和NO– 2-N的提取效率。

2 mol/L KCl溶液提取強酸性土壤NO– 2-N時會低估NO– 2-N的實際含量，通過調(diào)節(jié)提取液pH的方法可以有效地避免這一問題。已有研究中常用的方法是使用KOH溶液調(diào)節(jié)土壤/KCl懸浮液pH，但是這種方法較為繁瑣，而且由于酸性土壤具有較強的緩沖能力，土壤/KCl懸浮液pH不容易保持。相比之下，使用低濃度的磷酸鹽緩沖溶液調(diào)節(jié)pH方法更簡便，易于操作，并且在振蕩60 min后都能保持較高的pH。本研究結(jié)果證明，磷酸鹽緩沖液能有效地保持提取過程中提取液的pH，滿足提取條件的要求。

目前尚未完全清楚在2 mol/L KCl溶液提取時亞硝酸鹽發(fā)生變化的準(zhǔn)確機制。NO– 2-N的反應(yīng)速率取決于pH、有機質(zhì)、反應(yīng)時間和其他至今尚未確定的因素[14]。因此，提取過程中影響NO– 2-N動態(tài)的機理有待于深入研究，這對于進一步優(yōu)化提取方法具有重要的意義。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，強酸性土壤NO– 2-N提取過程中，土壤/KCl懸浮液的pH應(yīng)該保持在5.0 ~ 6.0，振蕩時間30 min，能同時保證土壤NH4+-N和NO– 2-N的提取效率。對于強酸性土壤(pH < 6.0)，推薦使用KCl溶液和pH 8.4的緩沖液混合溶液(KCl溶液/緩沖液比為4/1)作為提取液(土/液比為1/5)。對于pH在7.5以上的土壤樣品，推薦使用KCl溶液和pH 7.5的緩沖液混合溶液(KCl溶液/緩沖液比為4/1)作為提取液(土/液比為1/5)。對于pH在6.0 ~ 7.5的土壤樣品，可以直接使用2 mol/L KCl溶液提取。

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Improving Extraction Method in Determining NO– 2-N in Acidic Soil

DAI Shenyan1, WEN Teng1,2,3,4, ZHANG Jinbo1,2,3,4*, CAI Zucong1,3,4

(1 School of Geography Science, Nanjing Normal University, Nanjing 210023, China; 2 State Key Laboratory Cultivation Base of Geographical Environment Evolution, Nanjing 210023, China; 3 Jiangsu Center for Collaborative Innovation in Geographical Information Resource Development and Application, Nanjing 210023, China; 4 Key Laboratory of Virtual Geographic Environment (Nanjing Normal University), Ministry of Education, Nanjing 210023, China)

Nitrite (NO– 2-N) is a key intermediate in both nitrification and denitrification, which is also closely related to the emission of nitrogen gas from soil. Since its rapid reaction in soil and instability in acidic condition, a large number of decomposition will occur in the extraction process using 2 mol/L KCl. In order to enhance the accuracy of study on NO– 2-N changes in the acidic soil, a more appropriate extraction method should be investigated to improve the effeciency of the nitrite extraction. In this study, we put forward some suggestions in improving NO– 2-N extraction based our resutls of NO– 2-N recovery measured by using15N-labelling method. The results showed that pH and shaking time could both significantly affect the recovery of NO– 2-N and NH4+-N in acidic soils. Within 30 min shaking, the recovery of NO– 2-N was highest in the adjusted pH 6.0 and pH 8.0 treatments, while the recovery of ammonium was highest in the unadjusted and adjusted pH 6.0 treatments. In addition, even after shaking, the pH of extraction solution in the adjusted pH 6.0 and pH 8.0 treatments were maintained at about 4.8 and 5.8, respectively, which were significantly higher than that of control (3.8). In all, the pH of extraction solution should be adjusted to 5.0–6.0 and shaking time should be 30 min to get a more efficient extraction of both NO– 2-N and NH4+-N. For strongly acidic soils (pH<6.0), a mixture of KCl and pH 8.4 buffer (KCl︰buffer = 4︰1) should be used as extraction solution (the ratio of soil to extraction solution was 1︰5). For alkaline soils (pH≥7.5), a mixture of KCl and pH 7.5 buffer (KCl︰buffer = 4︰1) should be used as extraction solution (the ratio of soil to extraction solution was 1︰5). For the soil samples with pH ranged from 6.0 to 7.5, it can be extracted directly by 2 mol/L KCl solution.

Nitrite; Recovery; pH buffer; Acidic soil

10.13758/j.cnki.tr.2018.02.017

國家自然科學(xué)基金項目(41330744)資助。

(zhangjinbo@njnu.edu.cn)

戴沈艷(1984—)，女，江蘇啟東人，博士研究生，主要研究方向為土壤中亞硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)化。E-mail：daishenyan0519@163.com

S151.9

A