王曉萌，趙 彤，成 祥，郭 寧，朱玲玲，施 明，吳奎武△

（1.軍事科學院軍事醫(yī)學研究院認知與腦科學研究所，北京100850；2.徐州醫(yī)科大學腫瘤生物治療研究所，江蘇徐州221004）

炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）包括潰瘍性結腸炎和克羅恩病，是一種胃腸道的炎癥性疾病，伴隨著嚴重的病理學變化，預后不佳，病因未明［1］。IBD在歐美國家高發(fā)，在亞洲和南美洲，IBD的患病率也日益增高［2，3］。IBD的病因主要與環(huán)境、免疫、遺傳等因素有關，反復發(fā)作的機制尚不清楚。部分觀點認為，腸道慢性炎癥的發(fā)生與腸道粘膜免疫缺陷有關［4，5］。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，細胞黏附分子在腸道炎癥發(fā)展的過程中起重要作用［5，6］。CHL1是一種在人體內(nèi)普遍表達的神經(jīng)細胞黏附分子（neural cell adhesion molecule，NCAM），在以往的研究中，發(fā)現(xiàn)它對成人神經(jīng)回路軸突形成、神經(jīng)元的生長和存活有著至關重要的作用［7，8］。另一方面，CHL1與結直腸癌刪除分子（deleted in colorectal carcinoma，DCC）有相似的結構域。有研究表明，CHL1在結腸癌病人的結腸組織中表達降低［9，10］。但CHL1與炎癥性腸病之間的關系尚缺乏探討。本研究利用葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導小鼠結腸炎模型，探討CHL1缺失對DSS誘導的小鼠結腸炎癥的影響，以揭示CHL1在炎癥性腸病的發(fā)生中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 C57BL／6小鼠，雄性，16～20 g，購自軍事科學院醫(yī)學研究院動物中心；C57BL／6背景的CHL1（-／-）小鼠，雄性，16～20 g，繁殖于軍事醫(yī)學科學院動物中心。

1.1.2 試劑和儀器 DSS（MP Biochemical，US）；其他常用化學試劑和實驗器材均購自軍事科學院醫(yī)學研究院試劑庫及條件處。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物實驗 C57BL／6遺傳背景的 CHL1（+／+）和 CHL1（-／-）小鼠飼養(yǎng)于軍事科學院醫(yī)學研究院SPF動物室，恒溫23℃～26℃，恒濕40%～60%，保持每日 12 h（8：00～20：00）光照時間。使用普通生長飼料和三蒸水飼養(yǎng)，自由飲水飲食，每日加食，換水。每次實驗前，隨機區(qū)組設計法分組，參照體重值將小鼠分為數(shù)個體重相近的區(qū)組，之后按照隨機數(shù)表，分為對照組，DSS模型組，CHL1缺失組，CHL1缺失DSS模型組（n＝5）。

1.2.2 CHL1（-／-）小鼠炎癥性腸病模型的建立 將10只C57／BL6為遺傳背景的 CHL1（+／+）型小鼠按照隨機原則分為數(shù)量相等的對照組和DSS模型組（n＝5）；將 10只 C57／BL6為背景的 CHL（-／-）型小鼠按照隨機原則分為數(shù)量相等的CHL1缺失組和CHL1缺失DSS模型組（n＝5）；采用 DSS飼養(yǎng)小鼠誘導炎癥性腸病模型；DSS模型組和CHL1缺失DSS模型組自主飲用7 d含1.5%DSS蒸餾水，隨后改為蒸餾水飼喂2 d；對照組和CHL1缺失組飲用9 d蒸餾水，9 d后處死小鼠。

1.2.3 糞便隱血評分 用200μl槍尖隨機挑取糞便至載玻片，用50μl PBS稀釋，蓋上載玻片，于高倍鏡下觀察紅細胞個數(shù)。糞便隱血的評分由多名專業(yè)人員采取雙盲法進行評分頂級，隱血評分根據(jù)紅細胞的個數(shù)分為6個等級：（1）無隱血：鏡下沒有紅細胞；（2）懷疑隱血：1～9個；（3）有隱血：10～30個；（4）輕度隱血；鏡下紅細胞大于30個；（5）中度隱血：鏡下紅細胞占2／3個視野；（6）重度隱血：鏡下紅細胞占全視野。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SAS 9.1進行統(tǒng)計學分析，計量資料均用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間方差齊采用方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用Bonferroni法；生存資料采用Log-Rank生存分析；計數(shù)資料采用Kruskal-wallis秩和檢驗。

2 結果

2.1 CHL1缺失對DSS誘導的炎癥性腸病模型小鼠體重的影響

與對照組相比，DSS模型組小鼠炎癥性腸病的表現(xiàn)并不強烈，只是出現(xiàn)了一定程度體重減輕，但是CHL1缺失DSS模型組小鼠從刺激的第7天開始，體重明顯減輕（P＜0.01，表1）。

Tab.1 Comparison of body weight，the percent of weight change among different groups（±s，n＝5）

Tab.1 Comparison of body weight，the percent of weight change among different groups（±s，n＝5）

A：CHL1（+／+）；B：DSS-induced CHL1（+／+）；C：CHL1（-／-）；D：DSS-induced CHL1（-／-）**P＜0.01 vs A group

Time Body weight（g ）A B C D A Percent of weight change（%）B C D Day 1 17.80±0.91 18.05±0.88 20.02±3.06 18.71±1.57 0±0 0±0 0±0 0±0 Day 3 18.94±1.04 19.03±1.81 21.97±2.40 20.45±1.9 6.35±0.89 5.30±6.32 10.40±6.36 9.21±1.28 Day 5 18.67±0.68 18.87±1.12 21.30±2.22 17.85±1.77 4.91±1.64 4.52±1.62 7.08±6.23-4.71±2.67 Day 7 19.06±0.25 18.34±1.19 21.98±1.97 14.80±1.86**7.24±4.25 1.55±1.89 10.77±8.71-21.08±4.70**Day 9 19.91±0.74 18.19±2.11 22.10±1.54 11.49±2.09**11.88±1.96 0.54±7.41**11.66±10.59-37.30±8.06**

2.2 CHL1缺失對DSS誘導的炎癥性腸病模型小鼠死亡率的影響

隨著炎癥性腸病的發(fā)展，以C57／BL6為背景的DSS模型組小鼠并未出現(xiàn)死亡。但是，CHL1缺失模型組小鼠小鼠從第7天開始死亡，至DSS誘導的第9天死亡率高達80%，進行生存分析后顯示，Log-Rank值為 15.42（P＜0.01）。

2.3 CHL1缺失加重DSS誘導的炎癥性腸病模型小鼠便血

以C57／BL6為背景的DSS模型組，炎癥性腸病的表現(xiàn)并不明顯，僅出現(xiàn)一定程度的糞便隱血（P＜0.01）。與DSS模型組相比，CHL1缺失 DSS模型組小鼠，糞便隱血增多，從刺激的第7天開始，出現(xiàn)了明顯的便血，便血評分明顯升高（P＜0.01，表2）。

Tab.2 Comparison of fecal blood score and colon length among different groups

2.4 CHL1缺失對DSS誘導的炎癥性腸組織的影響

小鼠結腸測量長度分析顯示：CHL1缺失DSS模型組小鼠，與DSS模型組對比，其結腸組織明顯縮短（P＜0.01，圖 1，表 2），這些現(xiàn)象都提示了 CHL1缺失加重了DSS誘導的炎癥性腸病。

Fig.1 Changes of colon length after CHL1 deficiency on DSS-induced colitis

3 討論

CHL1屬于神經(jīng)細胞黏附分子L1家族成員，是由CHL1基因（又名 L1CAM2）編碼。2002年，CHL1基因敲除小鼠構建成功。這大大促進了對CHL1體內(nèi)功能的研究。已有研究表明，CHL1在神經(jīng)細胞的生存、增殖和分化中發(fā)揮重要作用。例如，在創(chuàng)傷修復過程中，CHL1參與神經(jīng)突觸形成、神經(jīng)突觸發(fā)生、神經(jīng)突觸可塑性和神經(jīng)再生等過程［11］。在CHL1基因敲除小鼠中可觀察到大腦皮質(zhì)、嗅球和海馬部位的形態(tài)改變和神經(jīng)突觸功能異常［12］。本實驗室的前期工作中發(fā)現(xiàn)，敲除CHL1可抑制神經(jīng)干細胞的增殖和分化［13］。最近的研究發(fā)現(xiàn)，CHL1還參與除神經(jīng)系統(tǒng)以外的病理生理過程。例如，有研究報道CHL1在多種腫瘤中表達降低，是潛在的抑癌分子［14］。但截至目前為止，還沒有CHL1參與炎癥調(diào)控的相關報道。本研究應用DSS誘導的小鼠炎癥性腸病模型發(fā)現(xiàn)，CHL1缺失可顯著加重炎癥性腸病的進展。這可能對于發(fā)現(xiàn)CHL1的新功能具有重要意義。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)與腸道聯(lián)系起來的神經(jīng)、內(nèi)分泌網(wǎng)絡成為“腦-腸軸”。腦-腸通訊把中樞神經(jīng)信號，腸神經(jīng)系統(tǒng)及包括免疫反應在內(nèi)的腸功能有機聯(lián)系在一起。參與腦-腸對話的任一環(huán)節(jié)功能異常均就有可能影響腸道的炎癥反應［15］。慢性心理應激誘發(fā)的腎上腺素能神經(jīng)信號可加速DSS誘導的小鼠炎癥性腸病進程，伴隨著炎癥因子 IL-1β、IL-6及TNF-α的升高，以及 NF-κB信號通路的激活［16-18］。這些結果提示，神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)信號參與了炎癥性腸病的發(fā)生發(fā)展。見于CHL1在神經(jīng)系統(tǒng)中的重要工作，本研究的發(fā)現(xiàn)可能為闡明“腦-腸軸”或神經(jīng)信號調(diào)控腸道炎癥反應的機制提供了重要線索。

但是，由于本研究應用的 CHL1動物模型為CHL1基因全身敲除小鼠，目前還不能準確解析CHL1參與炎癥性腸病進程的精確機制。后續(xù)的研究需要應用CHL1基因組織特異性敲除的小鼠進行深入研究。

【參考文獻】

［1］ Mikocka-Walus AA，Turnbull DA，Moulding NT，et al.Controversies surrounding the comorbidity of depression and anxiety in inflammatory bowel disease patients：a literature review［J］.Inflamm Bowel Dis，2007，13（2）：225-234.

［2］ Ng WK，Wong SH，Ng SC.Changing epidemiological trends of inflammatory bowel disease in Asia［J］.Intest Res，2016，14（2）：111-119.

［3］ Kaplan GG.The global burden of IBD：from 2015 to 2025［J］.Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2015，12（12）：720-727.

［4］ Ahmad R，Sorrell MF，Batra SK，et al.Gut permeability and mucosal inflammation：bad，good or context dependent［J］.Mucosal Immunol，2017，10（2）：307-317.

［5］ Cromer WE，Mathis JM，Granger DN，et al.Role of the endothelium in inflammatory bowel diseases［J］.World J Gastroenterol，2011，17（5）：578-593.

［6］ Nieves JR，Gorfu G，Ley K.Leukocyte adhesion molecules in animal models of inflammatory bowel diseases［J］.Inflamm Bowel Dis，2008，14（12）：1715-1735.

［7］ Rolf B，Lang D，Hillenbrand R，et al.Altered expression of CHL1 by glial cells in response to optic nerve injury and intravitreal application of fibroblast growth factor-2［J］.JNeurosci Res，2003，71（6）：835-843.

［8］ Nishimune H，Bernreuther C，Carroll P，et al.Neural adhesion molecules L1 and CHL1 are survival factors for motoneurons［J］.J Neurosci Res，2005，80（5）：593-599.

［9］ Holm J，Hillenbrand R，Steuber V，et al.Structural features of a close homologue of L1（CHL1）in the mouse：a new member of the L1 famliy of neural recognition molecules［J］.Eur J Neurosci，1996，8（8）：1613-1629.

［10］Fearon ER，Cho KR，Nigro JM，et al.Identification of a chromosome 18q gene that is altered in colorectal cancers［J］.Science，1990，247（4938）：49-56.

［11］Jakovcevski I，Wu J，Karl N，et al.Glial scar expression of CHL1，the close homolog of the adhesion molecule L1，limits recovery after spinal cord injury［J］.J Neurosci，2007，27（27）：7222-7233.

［12］Schmalbach B，Lepsveridze E，Djogo N，et al.Age-dependent loss of parvalbumin-expressing hippocampal interneurons in mice deficient in CHL1，a mental retardation and schizophrenia susceptibility gene［J］.J Neurochem，2015，135（4）：830-844.

［13］Huang X，Zhu LL，Zhao T，et al.CHL1 negatively regulates the proliferation and neuronal differentiation of neural progenitor cells through activation of the ERK1／2 MAPK pathway［J］.Mol Cell Neurosci，2011，46（1）：296-307.

［14］Senchenko VN，Krasnov GS，Dmitriev AA，et al.Differential expression of CHL1 gene during development of major human cancers［J］.PLoSOne，2011，6（3）：15612.

［15］Bonaz BL，Bernstein CN.Brain-gut interactions in inflammatory bowel disease［J］.Gastroenterol，2013，144（1）：36-49.

［16］Deng Q，Chen H，Liu Y，et al.Psychological stress promotes neutrophil infiltration in colon tissue through adrenergic signaling in DSS-induced colitis model［J］.Brain Behav Immun，2016，57：243-254.

［17］于 正，劉紅菊，頓桓桓，等.白頭翁湯對炎癥性腸病中促炎細胞因子表達的影響［J］.中國應用生理學雜志，2011，27（4）：416-419.

［18］黃循銣，王承黨，王瑞幸，等.潰瘍性結腸炎小鼠腸道通透性改變與 TNF-α及NF-κB P65的關系［J］.中國應用生理學雜志，2016，32（2）：112-115.