李洋洋，石 路，張延猛，肖嬋娟，劉洪濤

（1.上海交通大學(xué)海洋水下工程科學(xué)研究院有限公司，2.上海交通大學(xué)海洋水下工程科學(xué)研究院，3.上海交通大學(xué)-千葉大學(xué)國(guó)際合作研究中心，上海200231）

潛水時(shí)，隨著周圍壓力的增加，氧分壓和氮分壓都會(huì)隨之增加。一旦超過氮分壓的耐受限度（一般為4.8～5.6 ATA）人就會(huì)出現(xiàn)視聽覺延遲、即刻記憶受損等“氮麻醉”現(xiàn)象；而超過氧的耐受限度（一般為3 ATA）則會(huì)出現(xiàn)急性氧中毒、氧驚厥等癥狀?？梢娍諝鈱?duì)于大深度的安全潛水并非理想氣體［1］。我國(guó)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定空氣潛水的深度限定在60 m。氦氧潛水（heliox diving）雖然可以下潛的比較深，但“氦語音”和高壓神經(jīng)綜合征（high pressure nervous syndrome，HPNS）是其主要缺點(diǎn)［2］。

氦氮氧三元?dú)猓═rimix）潛水是國(guó)外發(fā)展的潛水新技術(shù)，可以彌補(bǔ)空氣潛水的不足：氦氣的麻醉作用比氮小，呼吸阻力也小，故能提高機(jī)體對(duì)高壓的耐受限度，可以根據(jù)下潛深度和機(jī)體耐受范圍靈活調(diào)整氮、氧分壓，從而在克服空氣潛水“氮麻醉”和“氧中毒”的同時(shí)下潛的更深［3，4］。Rostain等系統(tǒng)地概括了動(dòng)物對(duì)高氣壓的不同生理效應(yīng)，隨著壓力的升高，配制不同濃度的Trimix可以預(yù)防不同程度的HPNS的發(fā)生［5］。Bennett等亦證實(shí)在氦氧混合氣中加入適量的氮?dú)饪梢允谷藢?duì)高氣壓耐受限度可安全延伸至6.96 Mpa［6］。我國(guó)目前還沒有大深度 Trimix常規(guī)潛水技術(shù)的相關(guān)系統(tǒng)性研究。因此，明確Trimix常規(guī)潛水對(duì)機(jī)體生理、生化功能可能的影響和機(jī)制就十分迫切。本實(shí)驗(yàn)旨在通過模擬家兔100 m Trimix常規(guī)潛水，探討100 m Trimix潛水對(duì)家兔血清氧化／抗氧化指標(biāo)、組織炎性因子和濕干比的影響，為今后開展人體實(shí)潛提供理論依據(jù)和科學(xué)支持。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

健康雄性家兔16只，體重2～3 kg。將動(dòng)物隨機(jī)分為兩組（n＝8）：空白組不進(jìn)行模擬潛水；模擬潛水組按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的加減壓方案進(jìn)行模擬潛水。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備及模擬潛水方案

高、低壓兩用動(dòng)物艙，艙容0.3 m3，模擬高氣壓最大為6 MPa。模擬家兔100 m Trimix潛水加減壓方案：下潛速度為10 m／min，50 m以上家兔呼吸空氣，50 m以下往艙內(nèi)補(bǔ)入氦氣使呼吸氣成為Trimix，加壓到 100 m時(shí)艙內(nèi)氣體為 Trimix 14.5／41.8（14.5%氧，41.8%氦，43.6%氮），在 100 m停留 30 min。減壓上升速度為6 m／min，減壓至45 m時(shí)將艙內(nèi)Trimix置換為空氣；減壓至20 m時(shí)將艙內(nèi)空氣置換為富氧氣體（enriched air nitrox，EAN）（50%氧-50%氮）；減壓至6 m時(shí)將艙內(nèi)EAN置換為純氧（≥95%）。高壓暴露期間持續(xù)通風(fēng)，并于艙底放置鈉石灰以吸收家兔呼出的的CO2，暴露過程中艙內(nèi)溫度保持在 22℃～28℃。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 血清氧化／抗氧化指標(biāo) 潛水前采集家兔動(dòng)脈血2 ml，家兔安靜30 min后進(jìn)艙模擬潛水，模擬潛水減壓結(jié)束出艙后即可再采集家兔動(dòng)脈血2 ml。常溫下離心（4 000 r／min，15 min）分離血清，-20℃保存，Elisa法分析檢測(cè)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、丙二醛（malondiadehyde，MDA）和過氧化脂質(zhì)（lipid peroxide，LPO）的表達(dá)水平。

1.3.2 組織炎性因子 分別取空白組和模擬潛水組家兔肺、腦組織，對(duì)炎性因子γ干擾素（interferongamma，IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factorα，TNF-α）、白介素 6（interleukin-6，IL-6）、白介素 8（interleukin-8，IL-8）、髓過氧化物酶活力（myeloperoxidase，MPO）和基質(zhì)金屬蛋白酶 9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）的表達(dá)進(jìn)行Elisa測(cè)試。

1.3.3 組織濕干比 分別取空白組和模擬潛水組家兔肺、腦組織，在冰生理鹽水中漂洗去組織表面殘血，用濾紙吸干組織表面，稱濕重；放置80℃烤箱內(nèi)連續(xù)烘烤72 h，稱干重，計(jì)算組織濕干比。

Elisa試劑盒均購(gòu)自安迪生物科技（上海）有限公司，嚴(yán)格按照Elisa說明書進(jìn)行操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理，測(cè)定值均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。炎性因子和組織濕干比兩組均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn)，氧化／抗氧化指標(biāo)兩組均數(shù)比較采用配對(duì) t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化

模擬100 m Trimix常規(guī)潛水后，家兔血清SOD和 GSH活性較潛水前明顯降低（P＜0.01），CAT、MDA和LPO含量則較潛水前顯著升高（P＜0.01，表 1）。

Tab.1 Effects of simulated 100 m Trimix conventional diving on oxidative stress in rabbits（±s，n＝8）

Tab.1 Effects of simulated 100 m Trimix conventional diving on oxidative stress in rabbits（±s，n＝8）

SOD：Superoxide dismutase；CAT：Catalase；GSH：Glutathione；MDA：Malondiadehyde；LPO：Lipid peroxide**P＜0.01 vs pre-diving group

Group SOD（U／L）CAT（U／L）GSH（ng／L）MDA（nmol／L） ）Pre-diving 105.28±2.95 0.68±0.02 357.05±9.59 16.43±0.88 3.75±0.25 Post-diving 92.62±5.22** 0.76±0.05** 312.17±9.24** 20.25±0.69** 4.84±0.25 LPO（μmol／L**

2.2 炎性反應(yīng)指標(biāo)的變化

模擬潛水后家兔肺組織中 IL-8、IL-6、IFN-γ、TNF-α、MMP-9及MPO含量、活性均較空白組明顯升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；模擬潛水后家兔肺組織濕干比較空白組均無顯著變化（表 2）。模擬潛水后家兔腦組織中 IL-8、IL-6、IFN-γ、TNF-α、MMP-9及MPO含量、活性均較空白組明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）；模擬潛水后家兔腦組織濕干比較空白組均無顯著變化（表3）。

Tab.2 Effects of simulated 100 m Trimix conventional diving on inflammatory reaction in rabbits brain tissue（±s，n＝8）

Tab.2 Effects of simulated 100 m Trimix conventional diving on inflammatory reaction in rabbits brain tissue（±s，n＝8）

IFN-γ：Interferon-gamma；TNF-α：Tumor necrosis factor-α；IL-6：Interleukin-6；IL-8：Interleukin-8；MPO：Myeloperoxidase；MMP-9：Matrix metalloproteinase-9*P＜0.05，**P＜0.01 vs intact group

Group IFN-γ（ng／L）Wet／Dry ratio Intact 873.72±27.32 179.85±4.98 61.64±1.95 42.56±2.66 90.03±2.73 44.27±2.19 5.82±0.42 Diving 937.49±14.16**197.32±6.56**67.35±3.13**45.60±1.34*98.71±2.32**50.39±1.60**TNF-α（ng／L）IL-6（ng／L）IL-8（ng／L）MPO（U／L）MMP-9（μg／L）5.83±0.44

Tab.3 Effects of simulated 100 m Trimix conventional diving on inflammatory reaction in rabbits lung tissue（±s，n＝8）

Tab.3 Effects of simulated 100 m Trimix conventional diving on inflammatory reaction in rabbits lung tissue（±s，n＝8）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs intact group

Group IFN-γ（ng／L）Wet／Dry ratio Intact 840.22±28.27 172.58±8.44 58.84±2.53 41.25±1.83 81.17±3.56 41.25±1.43 4.98±0.19 Diving 905.46±28.56**189.79±6.24**65.07±3.36**43.87±1.90*94.09±3.10**46.84±2.04**TNF-α（ng／L）IL-6（ng／L）IL-8（ng／L）MPO（U／L）MMP-9（μg／L）4.83±0.24

3 討論

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)Haldane減壓理論計(jì)算所得的水下階段減壓表進(jìn)行了模擬家兔100 m Trimix常規(guī)潛水［7］。通過比較潛水前、后家兔血清氧化／抗氧化指標(biāo)、肺及腦組織炎性因子和濕干比的變化，明確100 m Trimix常規(guī)潛水對(duì)機(jī)體氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)的影響，國(guó)內(nèi)尚屬首次。為我國(guó)今后大深度Trimix人體實(shí)潛提供了第一手資料，具有重要的指導(dǎo)意義。

機(jī)體在潛水或高氣壓時(shí)處于應(yīng)激狀態(tài)［8］。本實(shí)驗(yàn)中，家兔潛水時(shí)的氧化應(yīng)激主要來自呼吸氣高氧分壓，家兔在100 m停留階段承受8倍常氧分壓（1.6 ATA）的壓力。Bitterman等［9，10］在人體及大鼠的實(shí)驗(yàn)中均證實(shí)，單純高壓氧（280 kPa，90 min）暴露即可引起淋巴細(xì)胞亞型的改變，CD4+／CD8+比值在暴露后明顯降低。機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，產(chǎn)生大量氧自由基，抗氧化物質(zhì)損耗加快，可引起炎性因子的改變［11，12］。

本研究結(jié)果表明，家兔潛水后血清氧化／抗氧化指標(biāo)發(fā)生顯著改變，主要表現(xiàn)為SOD及GSH活力下降，MAD和LPO含量增加，說明潛水時(shí)的氧化應(yīng)激導(dǎo)致家兔抗氧化能力降低，自由基產(chǎn)生增多。CAT活性增強(qiáng)可能是過高的自由基或過氧化物濃度刺激導(dǎo)致的代償性改變，CAT活性升高不僅可以清除H2O2和其它過氧化物，其對(duì)自由基產(chǎn)生的多種途徑也有一定的抑制作用。模擬100 m Trimix常規(guī)潛水減壓后家兔肺、腦組織炎性因子 IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-8水平均較空白組顯著升高，其可能機(jī)制是氧化應(yīng)激激活了轉(zhuǎn)錄因子如核因子NF-κ和激活蛋白，轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)多種炎性反應(yīng)介質(zhì)如IL-8和TNF-α等的釋放。另一方面，募集在肺、腦組織的多種炎性細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞又可釋放H2O2，等，加重氧化應(yīng)激。從而形成氧化應(yīng)激-炎性反應(yīng)-氧化物質(zhì)增多-氧化應(yīng)激加重一系列鏈?zhǔn)交蜴準(zhǔn)街ф湻磻?yīng)。家兔在模擬100 m Trimix常規(guī)潛水后肺、腦組織MPO和MMP-9較空白組顯著升高，可能的機(jī)制是高壓／高氧分壓導(dǎo)致的氧化應(yīng)激使得機(jī)體MPO活性增加、MMPs系統(tǒng)激活，而MPO活性的增加又通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1和激活基質(zhì)金屬蛋白酶原-2使機(jī)體產(chǎn)生更多的MMP-9，從而形成正反饋。潛水組家兔組織濕干比較空白組未見顯著改變，提示潛水后兔肺間質(zhì)及肺泡血管通透性良好，血腦屏障及腦微循環(huán)正常，機(jī)體未發(fā)生因潛水引起的肺、腦水腫，說明組織炎性因子表達(dá)升高但并未產(chǎn)生病理性炎癥反應(yīng)。

綜上，模擬100 m Trimix常規(guī)潛水時(shí)的高氧分壓使家兔處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，氧化應(yīng)激改變了機(jī)體原有的氧化-抗氧化平衡，氧化和還原產(chǎn)物的改變進(jìn)而激活促進(jìn)了機(jī)體的炎性反應(yīng)，炎性細(xì)胞因子釋放增多，反過來繼續(xù)加重氧化應(yīng)激，形成氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)相互作用、共同參與的防御機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示按照Haldane減壓理論建立的模擬兔100 m Trimix常規(guī)潛水暴露方案是可行的，但應(yīng)用到人體實(shí)驗(yàn)和實(shí)際作業(yè)時(shí)仍需進(jìn)一步深化研究和驗(yàn)證。

【參考文獻(xiàn)】

［1］ Schwerzmann M，Seiler C.Recreational scuba diving，patent foramen ovale and their associated risks［J］.Swiss Med Wkly，2001，131（25-26）：365-374.

［2］ Boussuges A.A rat model to study decompression sickness after a trimix dive［J］.J Appl Physiol，2007，102（4）：1301-1302.

［3］ Levett DZH，Millar IL.Bubble trouble：a review of diving physiology and disease［J］.Postgrad Med J，2008，84（997）：571-578.

［4］ Arieli R，Ertracht O，Oster I，et al.Effects of nitrogen and helium on CNSoxygen toxicity in the rat［J］.JAppl Physiol，2005，98（1）：144-150.

［5］ Rostain JC，Dumas JC，Gardette B，et al.Effects of addition of nitrogen during rapid compression of baboons［J］.J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol，1984，57（2）：332-340.

［6］ Bennett PB，Coggin R，Roby J.Control of HPNSin humans during rapid compression with trimix to 650 m（2131 ft）［J］.Undersea Biomed Res，1981，8（2）：85-100.

［7］ 李洋洋，石 路，張延猛，等.模擬100 m氦氮氧常規(guī)潛水水下階段減壓方案的計(jì)算與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證［J］.中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志，2015，31（3）：197-200.

［8］ 李 慈，何 佳，劉民航，等.模擬65 msw氦氧飽和潛水對(duì)人體氧化應(yīng)激的影響［J］.中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志，2011（2）：250-252.

［9］ Bitterman N，Bitterman H，Kinarty A，et al.Effect of a single exposure to hyperbaric oxygen on blood mononuclear cells in human subjects［J］.Undersea Hyperb Med，1993，20（3）：197-204.

［10］Bitterman N，Lahat N，Rosenwald T，et al.Effect of hyperbaric oxygen on tissue distribution of mononuclear cell subsets in the rat［J］.J Appl Physiol，1994，77（5）：2355-2359.

［11］ Allan IM，Lunec J，Salmon M，et al.Reactive oxygen species selectively deplete normal Tlymphocytes via a hydroxyl radical dependent mechanism［J］.Scand J Immunol，1987，26（1）：47-53.

［12］ Bose KS，Vyas P，Singh M.Plasma non-enzymatic antioxidants-vitamin C，E，beta-carotenes，reduced glutathione levels and total antioxidant activity in oral sub mucous fibrosis［J］.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2012，16（4）：530-532.