李 良

浙江省臺州醫(yī)院急救中心，浙江臨海 317000

作為臨床中一種極為常見的傳染性疾病，結(jié)核病主要由結(jié)核分枝桿菌感染引起，有數(shù)據(jù)顯示，全球受結(jié)核桿菌感染人數(shù)占1/3左右，每年死于結(jié)核桿菌感染的人數(shù)高達(dá)300多萬。結(jié)核分枝桿菌的難治性以及耐藥性與其具有獨(dú)特的逃避人體細(xì)胞免疫機(jī)制有關(guān)[1]。結(jié)核菌脂阿拉伯甘露糖（lipoarabino-mannan，LAM）是結(jié)核分枝桿菌表面的一種具有特殊多糖結(jié)構(gòu)的糖基磷脂酰肌醇（GPI），在結(jié)核分枝桿菌病表面大量表達(dá)。近年來研究表明LAM是導(dǎo)致巨噬細(xì)胞功能下降以及樹突狀細(xì)胞成熟水平降低的重要分子[2]。隨著對巨噬細(xì)胞Notch信號通路的深入研究及模式識別受體（PRRs）和Notch分子信號的內(nèi)在聯(lián)系的揭示，引導(dǎo)我們對Notch通路是否在結(jié)核免疫中起著重要調(diào)控作用產(chǎn)生新的思考。而國外一些報道指出，Notch1受體激活可下調(diào)如 IL-6、IL-1β、IL-12、TNF-α、IFN-α、IFN-β等促炎性介質(zhì)的分泌，然而在結(jié)核分枝桿菌病感染免疫上，國內(nèi)外鮮有研究。因此，本研究使用LAM作為刺激因素，探討Notch1分子信號通路是否參與LAM誘導(dǎo)的結(jié)核免疫逃避，從而為Notch1信號通路在結(jié)核免疫治療中提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料

清潔級近交系 Balb/c小鼠 （H-2d，6～8周齡，雌性），體重（19±3）g，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供。結(jié)核菌脂阿拉伯甘露糖（LAM，MS-01）購自美國HT公司，Notch信號通路阻斷劑GSI購自Calbiochem公司，一抗兔抗Notch1多克隆抗體（Rabbit anti-Notch1 polyclone IgG）、兔抗Beta-actin多克隆抗體（Rabbit anti-beta polyclone IgG），二抗 HRP-羊抗兔IgG多克隆抗體 （HRP-Goat polyclonal to Rabbit IgG）均購自Abcam公司。Trizol購自Invitrogen公司，Tarkra PrimeScriptRT reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及高保真Taq DNA聚合酶購自Tarkra公司。PCR引物均由大連寶生物設(shè)計(jì)合成。酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購自eBioscience公司，胎牛血清購自杭州四季青生物公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組以及干預(yù) BALB/c小鼠隨機(jī)分成三組，實(shí)驗(yàn)組小鼠分別腹腔注射結(jié)核菌脂阿拉伯甘露糖（lipoarabino-mannan，LAM）2 mL；Notch 信號通路抑制劑GSI（Calbiochem）+LAM 2 mL。對照組腹腔注射PBS 2 mL。5 d后頸椎脫位法處死，收集兩組小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.2 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的收集分離 頸椎脫位法處死小鼠，75%酒精浸泡5 min，于超凈工作臺內(nèi)無菌操作。剪開小鼠腹部皮膚，使用無菌注射器吸取RPMI1640培養(yǎng)液，每只小鼠腹腔注射6 mL。輕柔拍打腹壁20 min后回抽出腹腔液置于滅菌離心管中。每只小鼠重復(fù)3次，充分回收腹腔液，注意回收時避免針頭吸到腸系膜。1500 rad/min，離心10 min，棄上清，重復(fù)使用PBS洗滌細(xì)胞2次后換用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。按4×106/L的細(xì)胞濃度接種至6孔板中補(bǔ)充10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液至3 mL每孔。37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育8 h后洗去懸浮細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)，每2天常規(guī)換液1次。

1.2.3 半定量RT-PCR法測定小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中的Notch1 mRNA水平 待細(xì)胞長至90%左右融合時用臺盼藍(lán)據(jù)染法判斷細(xì)胞活性。棄上清，用4℃預(yù)冷的PBS洗滌兩次，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，測OD260/OD280，以比值大于1.8為合格樣品。嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒相關(guān)說明對RNA進(jìn)行提取，以2 μL為宜，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。Notch1引物以及內(nèi)參Beta-actin引物由大連寶生物公司設(shè)計(jì)合成，引物序列見表1。

PCR反應(yīng)要嚴(yán)格按照相關(guān)說明執(zhí)行，其反應(yīng)基本條件為：5×PrimeSTARTM Buffer 4 μL，dNTP Mixture 1.6 μL，Notch1 上、下游引物各 0.4 μL，模板 cDNA1 μL，PrimeSTARTM HS DNA Polymerase 0.2 μL，首先給予滅菌處理，然而加水稀釋，構(gòu)建20 μL反應(yīng)體系，設(shè)置預(yù)變性處理溫度，以94℃為宜，時間以4 min為宜，然后在95℃溫度環(huán)境下進(jìn)行變性50sec，當(dāng)溫度下降至60℃，退火60 sec，72℃環(huán)境下進(jìn)行50 sec延伸處理，35循環(huán)后，在72℃溫度下延伸處理，以10 min為宜。產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.4 Western Blot法測定小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中受體Notch1表達(dá)水平 待細(xì)胞長至90%左右融合時，將培養(yǎng)液去除，給予PBS冰沖洗，反復(fù)沖洗3次，確保PBS液能夠被完全吸出，刮除細(xì)胞，放置于1.5 mL EP管中進(jìn)行保存，在4℃溫度下進(jìn)行離心處理，速率為3000 rad/min，以5 min為宜，將上清液去除。選取含有1 mmol/LPMSF的IP細(xì)胞裂解液，以500 μL為宜，將其在冰上給予預(yù)冷處理，然后加入沉淀，給予反復(fù)吹打。采用12000 rad/min離心速率在冰上裂解處理，以40 min為宜，離心處理15 min后，對蛋白濃度進(jìn)行檢測。分別制備10%分離膠以及5%的濃縮膠，實(shí)施聚丙酰胺凝膠電泳處理。對PVDF膜實(shí)施平衡預(yù)處理，將其放置在電轉(zhuǎn)槽中，以250 mA恒流在冰水混合物中實(shí)施電轉(zhuǎn)，時間為90 min。取出PVDF膜，將其放置入含有5%脫脂奶粉PBST緩沖液中，并予以封閉，以1 h為宜，采用PBST洗膜反復(fù)清洗，一般為3～4次，15 min/次。按1:500加入一抗孵育44℃過夜（Rabbit anti-Notch1 polyclone IgG，Abcam，ab27526），內(nèi)參體系加入 （Rabbit anti-beta polyclone IgG，Abcam，ab8227）。 再次給予 3～4 次 PBST 洗膜，15 min/次。按照1:5000的比例在其中加入二抗，室溫孵育2 h。給予PBST溶液反復(fù)沖洗，一般為3～4次，10 min/次，然后實(shí)施ECL發(fā)光對其進(jìn)行鑒定，并對鑒定結(jié)果做出分析。以目的蛋白灰度值/內(nèi)參Beta-actin比值作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.5 ELISA法測定細(xì)胞上清液中IL-1β、INF-γ、IL-12炎性細(xì)胞因子水平 取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液50 μL，按照ABC-ELISA雙抗體夾心法試劑盒說明書測定IL-1β、INF-γ、IL-12炎性細(xì)胞因子的濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)計(jì)算在統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPPSS18.0上進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料均用（%）表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采取 t檢驗(yàn)，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 RT-PCR引物

2 結(jié)果

2.1 LAM刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞Notch1的轉(zhuǎn)錄情況

經(jīng)腹腔注射LAM 5 d刺激后，兩步法RT-PCR檢測LAM刺激組和對照組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的Notch1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平，以光密度比值Notch1 mRNA/Beta-actin mRNA衡量Notch1轉(zhuǎn)錄水平高低，LAM 刺激組（1.223±0.316）和對照組（0.771±0.320）間有顯著性差異（t=4.5，P<0.05，n=20）。

圖1 RT-PCR檢測Notch1轉(zhuǎn)錄情況

2.2 LAM刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞Notch1受體表達(dá)情況

Western Blot法檢測小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中Notch1受體表達(dá)情況，經(jīng)LAM刺激組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞表面Notch1受體表達(dá)顯著高于對照組。兩組Notch1/Beta-actin灰度值比值分別為：LAM刺激組 （0.842±0.188），對照組（0.535±0.219），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.3，P<0.05，n=20）。

圖2 Western Blot法檢測Notch1蛋白表達(dá)情況

2.3 ELISA 法測定細(xì)胞上清液中 IL-1β、INF-γ、IL-12炎性細(xì)胞因子水平

培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞上清液炎癥因子測定，LAM刺激組與LAM+GSI處理組對比，IL-1β、IL-12水平有顯著性差異（P<0.05），而INF-γ水平兩組間差異無顯著性（P>0.05），見圖 3～5。

3 討論

在醫(yī)學(xué)及醫(yī)藥技術(shù)高度發(fā)達(dá)的今天，結(jié)核病仍然是人類健康的主要威脅之一。之所以結(jié)核病難以控制以及耐藥結(jié)核、難治性結(jié)核的發(fā)病率逐漸增高，與結(jié)核分枝桿菌獨(dú)特的逃避人體免疫防御屏障有關(guān)[1，3]。其中最重要的機(jī)制便是結(jié)核分支桿菌逃避巨噬細(xì)胞殺滅的機(jī)制。

圖3 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL1-β濃度

圖4 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL12濃度

圖5 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中INF-γ濃度

目前已知的結(jié)核菌脂阿拉伯甘露糖（lipoarabinomannan，LAM），是結(jié)核分枝桿菌表面的一種具有特殊多糖結(jié)構(gòu)的糖基磷脂酰肌醇（GPI），在結(jié)核分枝桿菌病表面大量表達(dá)。近年來，LAM作為菌陰結(jié)核的診斷方法以及結(jié)核的快速診斷方法逐漸被認(rèn)可[4]。研究證實(shí)LAM是DC-SIGN的一個關(guān)鍵配基。當(dāng)ManLAM實(shí)現(xiàn)與DC-SIGN的結(jié)合，能夠直接對TLR信號途徑產(chǎn)生作用，對樹突狀細(xì)胞成熟信號會產(chǎn)生一定的干擾[5,6]。

Notch受體廣泛表達(dá)于哺乳動物中，是相當(dāng)保守的細(xì)胞表面受體[7]。在巨噬細(xì)胞表面Notch1-4均有表達(dá)[8]。Notch1信號通路是一條特殊的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，諸多研究表明Notch1信號通路跟模式識別受體有著密切的聯(lián)系[9]。臨床研究報道，配體激活Notch1后，胞內(nèi)段細(xì)胞膜將會出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象，并逐漸向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，進(jìn)而活化部分 Su（H）/CBF1（CSL 蛋白）等核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子[10,11]，其能夠有效調(diào)控下游因子，一方面能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞分化，另一方面能夠?qū)?xì)胞發(fā)育產(chǎn)生一定的影響，導(dǎo)致組織器官生物學(xué)功能及性狀發(fā)生變化[12]。然而Notch1受體在結(jié)核分枝桿菌免疫中的機(jī)制鮮有研究。本研究設(shè)計(jì)通過小鼠腹腔注射LAM，同時以腹腔巨噬細(xì)胞作為研究對象，觀察LAM刺激后Notch1受體的表達(dá)情況以及在LAM調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)釋放中的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，LAM通過上調(diào)Notch1受體水平，抑制IL-1β、IL-12等炎癥介質(zhì)的釋放。IL-1β是結(jié)核免疫反應(yīng)中的重要炎癥介質(zhì)[13]，而IL-12則是調(diào)控抗原反應(yīng)性T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化的重要細(xì)胞因子，參與了結(jié)核分枝桿菌感染的細(xì)胞免疫[14]，通過GSI阻斷Notch1通路可抑制LAM誘導(dǎo)的 IL-1β、IL-12水平下降[15,16]。表明Notch1信號通路在LAM誘導(dǎo)的結(jié)核免疫逃避中扮演了重要的角色。然而，本研究同時也證實(shí)，Notch1通路不能改變LAM誘導(dǎo)的INF-γ分泌水平，結(jié)合Yasuda K等[17]研究，本文認(rèn)為LAM并非通過下調(diào)INF-γ分泌水平來減弱巨噬細(xì)胞的吞噬功能，而是通過某種機(jī)制改變巨噬細(xì)胞對INF-γ的應(yīng)答能力來減弱巨噬細(xì)胞的吞噬功能。

隨著對Notch信號通路以及下游調(diào)控機(jī)制的深入研究[18]，Notch1在結(jié)核免疫以及結(jié)核分枝桿菌病免疫逃避中的重要作用將逐漸被認(rèn)識[19，20]。而基于Notch信號通路的治療方法在不久的將來可能為潛伏結(jié)核感染（LTBI）患者或者難治性結(jié)核病患者提供新的治療思路。

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