胡國宏 徐有國 金香琴 熊占山 張家松

提要：本實(shí)驗(yàn)用自配提高魚體非特異性免疫力中藥方劑，加工成藥餌飼喂虹鱒稚魚。試驗(yàn)池連續(xù)喂12天藥餌，對照池不喂藥餌。測定了試驗(yàn)魚和對照魚的組織和血液的免疫學(xué)指標(biāo)。結(jié)果試驗(yàn)池和對照池30天的死魚數(shù)分別為2487尾和4965尾，存活率分別為92.32%和76.93%。實(shí)驗(yàn)組比對照組高15個百分點(diǎn)。而且試驗(yàn)池比對照池晚發(fā)病一周。實(shí)驗(yàn)組和對照組組織樣品的免疫學(xué)指標(biāo)無顯著差異。由圖2可看出，實(shí)驗(yàn)組和對照組血液樣品的免疫學(xué)指標(biāo)差異顯著。實(shí)驗(yàn)組魚血清中的超氧化物歧化酶（SOD）、干擾素（IFN）-γ、白細(xì)胞介素（IL）-1β、過氧化氫酶（CAT）、堿性磷酸酶（ALP）、腫瘤壞死因子（TNF）-ɑ等六種免疫相關(guān)酶顯著高于對照組。這表明，我們配出的中藥方劑具有提高虹鱒稚魚非特異性免疫力的效果。

前言：我國冷水魚（尤其是虹鱒）的養(yǎng)殖技術(shù)已經(jīng)很成熟。然而，到2016年我國鮭鱒魚產(chǎn)量僅為4萬噸，遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了國內(nèi)消費(fèi)需求。每年需要大量進(jìn)口。根據(jù)我國冷水資源估算，鮭鱒魚的生產(chǎn)潛力為50～60萬噸，開發(fā)利用前景廣闊。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的逐年擴(kuò)大，病害威脅日益嚴(yán)重。特別是病毒?。▊魅拘栽煅鞴賶乃啦〉龋┙o養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大危害和經(jīng)濟(jì)損失?？梢?，疾病的發(fā)生是制約水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展和增加收益的主要因素之一。

目前，人類普遍關(guān)注食品安全問題。過去用于防治魚病的西藥，有很多已經(jīng)禁用或限用。利用高效、低毒、無殘留的中草藥防治魚病已成為必然趨勢。

1. 材料與方法

1.1中藥方劑配伍

針對免疫力低、發(fā)病率高，而配制提升魚體非特異免疫力方劑。本方組成如下：黃芪、肉叢蓉;川芎、金銀花、紅花、五味子、柴胡;魚腥草、白花蛇舌草;石斛;白術(shù)、白頭翁、絞股藍(lán)、桑螵蛸、甘草、板藍(lán)根、天麻等25味。

1.2藥餌的制作與投喂

將配好的中藥粉碎后，以1%的劑量添加到已配好的飼料原料中，充分?jǐn)嚢杌靹蚝笾瞥芍睆?.5mm的顆粒。

在2個面積5m2的流水池中，放入平均體重為4.38g 的虹鱒稚魚。試驗(yàn)池放14800尾，對照池放12600尾 。試驗(yàn)池投喂藥餌，對照池投喂正常飼料。并記錄試驗(yàn)池和對照池的死魚數(shù)。試驗(yàn)池連續(xù)喂12天藥餌，死魚數(shù)記錄30天。

1.3免疫學(xué)指標(biāo)的測定

試驗(yàn)池連續(xù)喂12天藥餌后，試驗(yàn)池和對照池各取6尾魚采組織樣品，各取10尾魚采血液樣品，用上海仁捷生物科技有限公司ELISA檢測試劑盒，分別檢測：超氧化物歧化酶（SOD）、干擾素（IFN）-γ、白細(xì)胞介素（IL）-1β、過氧化氫酶（CAT）、堿性磷酸酶（ALP）、腫瘤壞死因子（TNF）-ɑ等6種免疫相關(guān)酶。

用預(yù)冷的PBS （0.01M， pH=7.4）沖洗組織，去除殘留血液，稱重0.1g后將組織剪碎。將剪碎的組織與900μLPBS加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。最后將勻漿液于5000×g離心5～10分鐘， 取上清檢測。

將收集于血清分離管的全血在室溫放置2小時，然后1000×g離心20分鐘，取上清檢測。

具體檢測方法如下：

① 設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔， 標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品 50μL;

② 樣本孔中加入待測樣本 50μL; 空白孔不加。

③ 除空白孔外， 標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（ HRP） 標(biāo)記的檢測抗體100μL， 用封板膜封住反應(yīng)孔， 37℃水浴鍋或恒溫箱溫育 60min。

④棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（ 350μL），靜置 1min，甩去洗滌液， 吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板 5 次。

⑤ 每孔加入底物 A、 B 各 50μL，37℃避光孵育 15min。

⑥每孔加入終止液50μL，15min 內(nèi)，在450nm 波長處測定各孔的OD值。

2. 結(jié)果與討論

試驗(yàn)池和對照池30天的死魚數(shù)分別為2487尾和4965尾，存活率分別為92.32%和76.93%。實(shí)驗(yàn)組比對照組高15個百分點(diǎn)。而且試驗(yàn)池比對照池晚發(fā)病一周。

組織免疫學(xué)指標(biāo)檢測結(jié)果見圖1;血清免疫學(xué)指標(biāo)檢測結(jié)果見圖2。

由圖1可看出，實(shí)驗(yàn)組和對照組組織樣品的免疫學(xué)指標(biāo)無顯著差異。由圖2可看出，實(shí)驗(yàn)組和對照組血液樣品的免疫學(xué)指標(biāo)差異顯著。實(shí)驗(yàn)組魚血清中的超氧化物歧化酶（SOD）、干擾素（IFN）-γ、白細(xì)胞介素（IL）-1β、過氧化氫酶（CAT）、堿性磷酸酶（ALP）、腫瘤壞死因子（TNF）-ɑ等六種免疫相關(guān)酶顯著高于對照組。這表明，我們配出的中藥方劑具有提高免疫力的效果。