王鵬 李路偉 郭金鳳 徐凱莉 董哲

摘 要：在丙酸桿菌（Propionibacterium freudenreichii）厭氧發(fā)酵生產(chǎn)脫氧腺苷鈷胺素（deoxyadenosylcobalamin，簡稱ADO）的過程中，中間體腺苷鈷啉醇酰胺（adenosylcobinamide，簡稱CBI）和5，6-二甲基苯并咪唑（DMB）結(jié)合后生成產(chǎn)物ADO。目前維生素B12脫氧腺苷鈷胺素發(fā)酵過程中的實時在線檢測方法相對匱乏，為了解決該問題，提高維生素B12的發(fā)酵單位，以CBI為目標，運用代謝調(diào)控方法改善DMB的加入時間，研究不同時間加入DMB對丙酸桿菌生長以及ADO合成的影響。在分批次發(fā)酵情況下，實時檢測了菌體發(fā)酵過程中具體的CBI合成量、ADO產(chǎn)量，并進一步繪制了菌體的生長曲線。結(jié)果表明，DMB對丙酸桿菌生長的抑制作用并不明顯，但是可以抑制單位菌體產(chǎn)量，發(fā)酵周期為120 h，最佳添加時間為90～100 h，相比60 h添加DMB可提高發(fā)酵單位59.08%。方法簡便、快捷、高效，對維生素B12的發(fā)酵調(diào)控研究具有一定的參考價值。

關(guān)鍵詞：發(fā)酵工程;脫氧腺苷鈷胺素（ADO）;丙酸桿菌;腺苷鈷啉醇酰胺（CBI）;5，6-二甲基苯并咪唑（DMB）

中圖分類號：Q815?文獻標志碼：A

文章編號：1008-1542（2018）06-0546-06

維生素B12別稱鈷胺或氰基鈷胺，是一類含鈷的咕啉類有機化合物的總稱，主要以5種天然形式存在：甲基鈷胺（methylcobalamin）、脫氧腺苷鈷胺（deoxyadenosylcobalamin）、羥基鈷胺（hydroxycobalamin）、水合鈷胺（aquacobalamin）和硝基鈷胺（nitrylcobalamin）[1-2]。廣泛應用于商品用途的維生素B12是由細菌菌體發(fā)酵合成的鈷胺素轉(zhuǎn)化而來的[3-4]。維生素B12與人們的生產(chǎn)、生活聯(lián)系密切，例如在農(nóng)業(yè)上主要用作飼料添加劑，在臨床上用來治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病和惡性貧血等。

目前，工業(yè)生產(chǎn)中的脫氧腺苷鈷胺素（ADO）發(fā)酵采用好氧和厭氧工藝。第1種工藝是假單孢菌好氧發(fā)酵，發(fā)酵單位較高，但發(fā)酵過程需要曝氣及高功率攪拌，能耗較高。第2種工藝則為丙酸桿菌厭氧發(fā)酵，雖然厭氧發(fā)酵工藝產(chǎn)率較低，但發(fā)酵過程中不需要曝氣和高功率攪拌，能耗較低。工業(yè)上應用最普遍的維生素B12產(chǎn)生菌之一是丙酸桿菌（Propionibacterium freudenreichii）[5-7]，在其生長發(fā)酵中不會產(chǎn)生內(nèi)、外毒素[8]，

發(fā)醇廢液含有細菌類物質(zhì)及丙、乙酸鹽類，都具有生物抗菌作用，可作為天然、綠色、安全的食品和飼料防腐劑[9]，符合美國食品和藥物管理局GRAS標準。綜合考慮2種發(fā)酵工藝的成本相差不大，故選擇丙酸桿菌厭氧發(fā)酵工藝。丙酸桿菌厭氧發(fā)酵生產(chǎn)ADO分2個階段：第1個階段，以增加菌體數(shù)量為目的培養(yǎng)發(fā)酵菌體，同時積累中間產(chǎn)物腺苷鈷啉醇酰胺（CBI）;第2個階段，向培養(yǎng)基中加入5，6-二甲基苯并咪唑（DMB），促使菌體合成維生素B12脫氧腺苷鈷胺素[10-11]。相關(guān)研究討論了DMB合成以及在生產(chǎn)中添加DMB的必要性[12-14]。

目前對于維生素B12的厭氧發(fā)酵過程，企業(yè)缺乏實時在線監(jiān)控方法，大多采用鏡檢，人為影響因素較大，發(fā)酵不穩(wěn)定。此外，關(guān)于在發(fā)酵生產(chǎn)維生素B12的過程中，添加DMB是否對丙酸桿菌生長有影響，以及在什么時間添加DMB可得到最優(yōu)產(chǎn)量的研究并不多。筆者采用簡便、快捷、高效的液相色譜實時在線監(jiān)控方法，探討了添加DMB對菌體生長及合成ADO的影響，并運用代謝調(diào)控的方法對發(fā)酵過程進行優(yōu)化，提高了維生素B12的發(fā)酵單位。

1?材料與方法

1.1?菌種來源

菌種丙酸桿菌Propionibacterium freudenreichii，CICC：10019，由中國工業(yè)微生物菌種保藏中心提供。

1.2?培養(yǎng)基配方

種子培養(yǎng)基配方（質(zhì)量分數(shù)，下同）：葡萄糖3.5%（需要單獨滅菌），玉米糖漿2.1%，碳酸鈣0.4%，磷酸二氫鉀0.4%，硫酸銨0.5%，氯化鈷0.000 5%。用自來水配制，pH值為6.8～7.0，加碳酸鈣。

發(fā)酵培養(yǎng)基配方：葡萄糖6%，玉米糖漿4%，磷酸二氫鉀0.46%，氯化鈷0.001 27%。用自來水配制，pH值為6.8～7.0，加碳酸鈣。

1.3?主要設(shè)備和試劑

美國Waters公司 2695高效液相色譜儀，Beckman C18（4.6 μm×25 cm，5 μm）色譜柱，福特斯（FTS）冷凍干燥機，Sigma 3K30高速離心機，Sartorius arium 611UF純水機，Beckman J6-MC大體積離心機，Sonics & Materials公司生產(chǎn)的Uibracell超聲波細胞破碎儀。

標準品ADO來自于Sigma公司;乙腈，色譜純;冰乙酸，色譜純;氫氧化鈉，分析純。

1.4?丙酸桿菌的發(fā)酵

取穿刺培養(yǎng)的細菌，用生理鹽水沖洗，接種到種子培養(yǎng)基，在30 ℃靜置培養(yǎng)50 h。取10%的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30 ℃下發(fā)酵培養(yǎng)，用氨水調(diào)節(jié)pH 值為6.8～7.0。在細菌菌體發(fā)酵過程中于不同時間加入DMB，促使丙酸桿菌積累ADO。

1.5?丙酸桿菌的收集與處理

在離心轉(zhuǎn)速4 000 r/min時收集丙酸桿菌發(fā)酵液，菌體凍干。取單位質(zhì)量的干菌配制成2.5%的懸浮液，然后在沸水浴中加熱30 min使細胞破壁ADO釋放。在轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心收集上清液，取1 mL通過0.2 μm纖維素濾膜過濾，最后用高效液相色譜儀檢測ADO產(chǎn)量[15]。整個操作過程在避光下進行，以防止光降解。

1.6?分析方法

1.6.1?生物量的測定

采用7200型分光光度計測量吸光度。取1 mL發(fā)酵液，參數(shù)波長為600 nm，光程1 cm比色皿比濁，以O(shè)D表示生物量。

1.6.2?CBI及ADO的檢測方法

液相條件：流動相1為乙腈，流動相2為醋酸鈉緩沖液（pH值為3.5），檢測波長為254 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為25 ℃，進樣量為10 μL。

洗脫條件：15%乙腈恒速洗脫5～10 min，15%～30%乙腈梯度洗脫10～15 min。

質(zhì)譜條件：噴霧電壓為4.5 kV，自加熱金屬毛細管溫度為300 ℃，電噴霧離子源殼氣速為50 arb。全掃描檢測模式，掃描范圍為m/z 300～1 200，精確質(zhì)量數(shù)與二級質(zhì)譜（MS/MS）的掃描方式為數(shù)據(jù)依賴型。

全部數(shù)據(jù)是經(jīng)3次試驗所取的平均值。

2?結(jié)果與分析

2.1?發(fā)酵過程中CBI的合成研究

筆者在原有實驗基礎(chǔ)上，已經(jīng)得到一個關(guān)鍵且穩(wěn)定的中間體，并通過光譜和液-質(zhì)聯(lián)用分析推測此中間產(chǎn)物為腺苷咕啉醇酰胺（CBI），相對分子質(zhì)量為1 239。CBI結(jié)構(gòu)如圖1所示。研究發(fā)現(xiàn)，丙酸桿菌在發(fā)酵過程中，CBI隨菌體的生長而積累，到一定程度時加入5，6-二甲基苯并咪唑（DMB），可以快速轉(zhuǎn)化為維生素B12即ADO，但是不加DMB，丙酸桿菌將不能生成ADO[16]。

對中間產(chǎn)物采用液-質(zhì)聯(lián)用分析，結(jié)果如圖2所示。

該中間體在被離子化后呈現(xiàn)出了+1價，相對分子質(zhì)量為1 239.5，恰好同ADO-CBI厭氧生物合成途徑中的脫氧腺苷鈷啉醇酰胺（ADO）一致。ADO-CBI的分子結(jié)構(gòu)中相對于ADO-CBI缺少了磷酸基團、核糖基團以及DMB基團（ADO-CBI分子質(zhì)量比為1 580）。另外，圖2中988.7 nm處對應的峰同ADO-CBI缺少了腺苷（ado-）基團的鈷啉醇酰胺一致。由此可以得出結(jié)論：從實驗中分離得到的關(guān)鍵中間產(chǎn)物應該是CBI。圖2中，1 240.6 nm處對應的是CBI的加H峰。

2.2?DMB添加時間對ADO合成的影響

發(fā)酵過程中以不添加DMB為對照，分別在24，36，…120 h（間隔12 h）添加DMB，在120 h左右發(fā)酵結(jié)束后檢測最終ADO合成量，對照定時取樣測定CBI的合成量和OD值。結(jié)果如圖3和圖4所示。

由圖3可以看出，在丙酸桿菌厭氧發(fā)酵生產(chǎn)ADO的過程中，OD值一直增大，在90～96 h之間生物量OD值最大，最后逐步平穩(wěn);CBI在60 h前后初次生成，90 h達到了最大值，隨后略微減小。由圖4可知，ADO合成量與CBI的生成有密切聯(lián)系，在84 h CBI的合成量達到最大時添加DMB，合成終止后ADO可以達到最大產(chǎn)量;對比在60 h加入DMB，維生素B12即ADO產(chǎn)量可以提高59.08%，產(chǎn)量大幅提高，效果明顯。

2.3?DMB對合成CBI的影響

2.3.1?DMB在CBI最大量左右時加入

在丙酸桿菌厭氧發(fā)酵生產(chǎn)ADO的過程中，以不加入DMB為對照，在96 h時加入DMB，全過程按小時定時取樣測定生物量OD值、CBI以及ADO合成量。結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，隨著發(fā)酵的進行OD值不斷升高，在96 h時到達最高值，后續(xù)逐步穩(wěn)定。對照中間產(chǎn)物CBI在60 h前后開始生成，96 h達到最大值，然后有小幅度降低，但仍保持在較高的水平。在96 h加入DMB后CBI不斷減少，同時開始生成鈷胺素ADO。隨著反應的進行ADO合成量越來越多，123 h 時CBI徹底消失，ADO達到最大量，在124 h中間產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物脫氧腺苷鈷胺素。

2.3.2?DMB不在CBI最大量時加入

在丙酸桿菌厭氧發(fā)酵生產(chǎn)ADO的過程中，以不加入DMB為對照，于74 h時加入DMB，全過程定時取樣測定生物量OD值、CBI以及ADO合成量。結(jié)果如圖6和圖7所示。

由圖6可知，未加DMB和加DMB兩者的OD值都持續(xù)增大，在90 h時到達最大值后逐步穩(wěn)定，加不加DMB對OD值的變化沒有直接的影響。由此可知，DMB對丙酸桿菌的毒害效應不是很明顯。加與不加DMB的發(fā)酵液兩者的OD值不同，但無明顯規(guī)律。對照CBI不斷生成，在96 h到達最大量后逐步穩(wěn)定。由圖7可知，添加DMB后，CBI量快速減少，此時產(chǎn)物ADO開始生成并且產(chǎn)量逐步增大。在102 h 時CBI徹底消失，ADO產(chǎn)量在108 h達到最大值。由此可知，由CBI全部轉(zhuǎn)化為ADO大約需要34 h。

2.4?DMB對細菌菌體生長的影響

在丙酸桿菌厭氧發(fā)酵生產(chǎn)維生素B12的過程中，DMB分別于發(fā)酵早期0 h，24 h和對數(shù)生長期48 h加入，以不加入DMB為對照，全過程定時取樣測定生物量OD值（間隔12 h）、CBI以及ADO合成量，檢驗分析DMB對丙酸桿菌菌體的生長是否有毒害作用。結(jié)果如表1和圖8所示。

由表1和圖8可以看出，DMB對細菌生長有略微的毒害作用，但是作用并不明顯。在菌體厭氧發(fā)酵完全結(jié)束停止后測定脫氧腺苷鈷胺素ADO的產(chǎn)量，綜合分析可知DMB加入的時間越早，ADO的產(chǎn)量越低。

優(yōu)化發(fā)酵過程也可從代謝工程的角度出發(fā)，利用基因工程操縱代謝途徑[17]，在丙酸桿菌厭氧發(fā)酵脫氧腺苷鈷胺素的過程中，強化目標產(chǎn)物途徑，控制或消除副產(chǎn)品途徑[18-19]，特別是對ADO發(fā)酵過程中的丙酸桿菌、副產(chǎn)物丙酸抑制菌體的生長[20]，從而進一步影響ADO的發(fā)酵單位。因此，新型發(fā)酵工藝是另一種可以顯著提高ADO產(chǎn)量和效價的途徑，比如采用產(chǎn)物原位分離技術(shù)[21-22]。

3?結(jié)?語

1）目前，在維生素B12的發(fā)酵生產(chǎn)中，添加DMB的時間只是根據(jù)生產(chǎn)經(jīng)驗進行判斷，并沒有較為科學的理論可遵循。筆者認為，可采用生物發(fā)酵代謝工程手段來確定適宜誘導物DMB的加入時間，從而得到更高的發(fā)酵單位。例如：隨著丙酸桿菌菌體的生長發(fā)酵，CBI在菌體內(nèi)持續(xù)生成并不斷累計，該合成直接關(guān)系到ADO的最終產(chǎn)值;在丙酸桿菌厭氧發(fā)酵生產(chǎn)維生素B12的過程中，全程定時取樣跟蹤檢測CBI產(chǎn)量，當其生成量到達最大值時加入DMB，CBI將快速轉(zhuǎn)化生成產(chǎn)物ADO，有效提高了發(fā)酵單位。在發(fā)酵90～96 h添加DMB，維生素B12的產(chǎn)量可以提高到59.08%。

2）在丙酸桿菌厭氧發(fā)酵合成ADO的過程中，DMB對丙酸桿菌菌體的毒害作用不是很明顯，生物量也沒有明顯減少;但是過早加入誘導物DMB則情況相反，其會抑制合成中間體CBI，減少菌體量，降低維生素B12脫氧腺苷鈷胺素最后的產(chǎn)量。

3）本研究為維生素B12發(fā)酵過程檢驗檢測技術(shù)的開發(fā)提供了理論依據(jù)。在丙酸桿菌厭氧合成ADO的次級代謝途徑中，DMB為何對CBI的合成有抑制作用有待今后作進一步的研究。

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