季宇琪 王慧 梁承月 何加林

摘要：苯并[α]芘（BaP）是一種廣泛分布且具有極強致癌、致畸、致突變的高環(huán)多環(huán)芳烴類物質(zhì)。為獲得苯并芘的高效降解菌群，本實驗從長期受石油污染的土壤中富集馴化得到能以苯并[α]芘為唯一碳源生長的高效降解菌群BaP1。該菌群在30℃、150r/min震蕩培養(yǎng)條件下，對20mg/LBaP30d降解率達(dá)62.8%。為優(yōu)化降解條件，本實驗探究環(huán)境因子中溫度、pH值及營養(yǎng)物添加對BaP最終降解的影響。結(jié)果表明，在溫度為25℃～37℃，pH值在6.0～8.0的范圍內(nèi)，BaP1始終有高效降解能力；隨著溫度升高，BaP1降解能力先增高后降低，最適溫度為30℃；30d時降解率高達(dá)72.95%。隨著pH值的增高，BaP最終降解率升高；在pH=8.04體系中，30d降解率為77.93%。酵母提取物或白胨的添加（5mg/L）同樣顯著提高降解菌群的最終降解率，后者促進(jìn)作用更明顯，達(dá)73.8%。研究發(fā)現(xiàn)，降解菌群BaP1對苯并[α]芘降解能力較高，降解周期短，具有較高的開發(fā)利用價值。

關(guān)鍵詞：對苯并[α]芘；降解菌群BaP1；降解效率；環(huán)境因子

多環(huán)芳烴（PAHs）是一類廣泛分布并穩(wěn)定存在于自然環(huán)境中的含兩個以上苯環(huán)的有毒有機污染物，具有三致作用——致癌、致畸、致突變，對人類健康和生態(tài)環(huán)境具有很大的潛在危害[1]，因而PAHs污染成為一個全球迫切需要解決的環(huán)境問題。研究表明，微生物降解是環(huán)境中PAHs消失的最主要的途徑[2]。

對苯并[α]芘（BaP）是一種含5個環(huán)的PAH類物質(zhì)，具有極強的三致效應(yīng)，而且其結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，疏水性更強，更難直接被微生物利用。同時，它與其它多環(huán)芳烴的含量有一定的相關(guān)性，被認(rèn)為大氣致癌物的代表，是國內(nèi)外檢測污染的重要指標(biāo)。因此，研究對苯并[α]芘污染的微生物修復(fù)具有重要意義。

目前，從自然界分離得到的降解BaP的微生物主要有降解細(xì)菌及少量的真菌和藻類。其中分離得到的BaP降解菌主要來自變形菌綱和放線菌綱。如Walteretal.[3]分離的Rhodococcussp.UW1在芘存在的條件下，在2周內(nèi)將250mg/L的BaP降解11%；Mycobacteriumsp.strainRGJH135可以在酵母提取物或蛋白胨存在的條件下，32天后能將0.4mg/LBaP降解40%[4]；而Burkholderiacepacia在有芘存在的條件下，即使在56天后，對50mg/L的BaP的降解率僅為1.46.2%[5]；李艷秋等[6]從石油污染土壤中篩選出一株BaP高效降解菌SL1，該菌株鑒定為假單胞菌（Pseudomonassp.），28℃培養(yǎng)10d后，菌株SL1對BaP（5mg/L）的降解率為35.7%。從上述的研究中，我們可以看到目前分離的BaP降解菌的降解效率普遍偏低，而且通常需要有其他的底物或營養(yǎng)物質(zhì)，以共代謝的方式降解BaP。而且單一的降解菌株作為一種生物強化的手段添加至污染環(huán)境中時，往往競爭不過土著的非降解菌，成不了優(yōu)勢菌屬，也就無法強化修復(fù)效果。經(jīng)過單一底物富集馴化的高效降解菌群BaP1，降解效率普遍增高且穩(wěn)定，菌群中的細(xì)菌互相協(xié)作，往往更易形成共代謝，對于BaP這種難降解物質(zhì)更具優(yōu)勢。因而，富集篩選高效的BaP降解菌群BaP1將為BaP的污染修復(fù)提供重要的技術(shù)支撐。

除此之外，BaP的降解還與許多環(huán)境因子相關(guān)。當(dāng)缺乏必要營養(yǎng)物質(zhì)如（N、P、K）或生長底物、適宜溫度及pH值、合適的供氧量時，BaP的降解都有可能不發(fā)生。目前已有的生物修復(fù)強化方法包括提高BaP濃度，但當(dāng)濃度超過閾值時，會對降解菌株產(chǎn)生毒性，減緩BaP的降解。還可以尋找合適溫度、調(diào)節(jié)PH、添加碳源和氮源、葡糖糖等添加劑和重金屬離子等強化微生物修復(fù)能力。但這些影響因子與降解菌密切相關(guān)，不能一概而論，需要逐一驗證。如盛下放等[7]發(fā)現(xiàn)Zn2+、Cd2+和Pb2+的存在基本不影響降解菌JL14對對苯并[α]芘的降解效能，而Cu2+（50mg·L1）、Cr2+（50mg·L1）對JL14降解對苯并[α]芘有很強的抑制作用。

因此，本實驗從石油污染土壤中富集篩選以對苯并[α]芘為唯一碳源和能源的高效降解菌群BaP1并研究其降解特性，以期對對苯并[α]芘污染的微生物修復(fù)提供重要的理論基礎(chǔ)與技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1土樣

本研究所用的土壤來自山東省勝利油田（黃海岸邊）受到石油污染土壤。

1.1.2主要試劑

酵母提取物、牛肉膏、苯并[α]芘（98%純，SigmaAldrichCo.，USA）、礦物培養(yǎng)基試劑（MgSO4·7H2O，CaCl2·6H2O，KH2PO4，Na2HPO4·7H2O，NaCl，NH4Cl，超純水）、丙酮；以上均為分析純。

1.1.3主要儀器與器材

可見光分光光度計（V1100D，美譜達(dá)，上海）；滅菌鍋；超凈臺；生化培養(yǎng)箱（上海）；恒溫振蕩培養(yǎng)箱（HZQF160，上海）；100μL微量進(jìn)樣器（上海）；電子天平；凝膠成像系統(tǒng)（SOP04402，伯樂）；微濾膜（0.22μm）；臺式冷凍離心機（日立，CR22G）；高效液相色譜（HPLC，島津10Avp，日本）；5mL玻璃注射器（上海）；移液管（10mL）；錐形瓶（250mL）；離心管等。

1.1.4主要培養(yǎng)基及其配制

5×鹽溶液的配制（200mL）：分別稱取3.0gKH2PO4，12.8gNa2HPO4·7H2O，0.5gNaCl，1.0gNH4Cl，加入超純水定容至200mL，高壓滅菌待用。

礦物鹽培養(yǎng)基的配制：分別配制5×鹽溶液、1MCaCl、1MMgSO4，置于高壓滅菌鍋中121℃，30min，進(jìn)行高壓滅菌，然后在超凈臺中往已滅菌干燥的容量瓶中，依次加入200mL5×鹽溶液、2mL1MMgSO4、適量體積的超純水，然后再加入0.1mL1MCaCl，最終加入超純水定量至1L。

苯并[α]芘母液的配制：稱取20mg對苯并[α]芘加入20mL丙酮溶解，配制成濃度為10mg/mL的苯并[α]芘母液，過濾除菌待用。

1.2實驗方法

1.2.1苯并[α]芘降解菌群BaP1的富集

向添加有100mL礦物鹽培養(yǎng)基的250mL錐形瓶加入苯并[α]芘母液至最終苯并[α]芘濃度為10mg/L，于30℃，150rpm恒溫振蕩培養(yǎng)箱過夜，使丙酮揮發(fā)至盡。稱取10g石油污染土壤和適量的玻璃珠加入該錐形瓶中，30℃，150rpm恒溫振蕩培養(yǎng)箱富集馴化，15天后，取10mL上清菌液于新鮮MSM中傳代，如此3代以后，提高苯并[α]芘終濃度為20mg/L，繼續(xù)如上進(jìn)行傳代富集馴化，直至得到穩(wěn)定降解菌群BaP1（測定各代的苯并[α]芘降解率，至前后兩代的降解效率相近為止）

1.2.2苯并[α]芘降解菌群BaP1群落結(jié)構(gòu)分析

收集足夠量的穩(wěn)定降解菌群BaP1的菌懸液，離心去上清收集菌體，利用FastDNAR1SPINKitforSoil試劑盒按照其操作流程提取菌群的全基因組，由測序公司對其16SrRNA基因擴(kuò)增，然后進(jìn)行二代測序分析。

1.2.3菌懸液的制備

無菌條件下，降解菌群BaP1培養(yǎng)物接種到含苯并[α]芘無機鹽培養(yǎng)基中，在30℃，150rpm條件下培養(yǎng)6d，5000rpm離心5min，去除上清液，用適量新鮮無機鹽培養(yǎng)基（已滅菌）重懸，重復(fù)上述步驟2次，最后定容到OD600=0.425。所有降解實驗均以此菌懸液為初始接種物。

1.2.4降解菌群BaP1苯并[α]芘降解曲線

將過濾除菌的苯并[α]芘母液添加到200mL經(jīng)121℃，高溫滅菌20min的礦物鹽培養(yǎng)基中至苯并[α]芘的初始濃度為20mg/L，將其放置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中過夜以確保丙酮揮發(fā)盡。取5mL2.2.3中的菌懸液接種至上述培養(yǎng)基中，30℃，150rpm振蕩培養(yǎng)。設(shè)置接種滅活菌液為對照組。在第0d、3d、6d、15d、20d、30d取樣。二個對照平行樣，測定苯并[α]芘殘余量及OD600值。

1.2.5環(huán)境因子對苯并[α]芘降解菌群BaP1降解苯并[α]芘的影響

選擇T和pH作為環(huán)境因子代表，探究其對降解菌群BaP1對苯并[α]芘降解的影響。其中溫度設(shè)置為25℃、30℃、37℃三個處理，每個處理兩個平行；pH值分為6.03、7.13、8.04三個處理，通過HCl和NaOH進(jìn)行調(diào)節(jié)，每個處理兩個平行。其它操作同2.24。在0d、15d、30d取樣測定芘殘余量。

1.2.6營養(yǎng)添加物對苯并[α]芘降解菌群BaP1降解苯并[α]芘的影響

蛋白胨和酵母粉分別溶解于高純水，經(jīng)0.22μm濾膜除菌后備用。向反應(yīng)體系分別添加酵母粉和蛋白胨，至各自的終濃度為5.0mg/L。其它操作同2.24。在0d、15d、30d取樣測苯并[α]芘殘余量。設(shè)置只添加苯并[α]芘的礦物鹽培養(yǎng)基為對照組，每個處理兩個平行。

1.2.7實驗分析方法

OD600測定：利用分光光度計，測定600nm波長下菌液吸光度。

PAHs測定：向2mL樣品中加入5mL二氯甲烷，全部轉(zhuǎn)移至20mL萃取瓶中，20rpm旋轉(zhuǎn)萃取1.0h，5mL玻璃注射針吸取有機相經(jīng)0.22um濾頭過濾至棕色進(jìn)樣瓶，進(jìn)行HPLC測定；

HPLC（島津，日本）測定條件：參考文獻(xiàn)[8]的條件設(shè)置；

實驗初始制作苯并[α]芘的濃度與峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線：稱取一定量的苯并[α]芘，以二氯甲烷為溶劑，制定梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，對PAHs標(biāo)準(zhǔn)濃度與HPLC獲得的色譜峰值進(jìn)行擬合，即獲得各PAHs標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示擬合度均在0.996以上。

1.3數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)的分析使用OriginPro9.0。

2結(jié)果與討論

2.1苯并[α]芘降解菌群BaP1的群落結(jié)構(gòu)（測序公司尚未將測序結(jié)果返回）

2.2苯并[α]芘降解菌群BaP1的降解曲線

圖1顯示的是苯并[α]芘降解菌群BaP1的降解曲線及其生長曲線。從圖中可以看出，降解菌群BaP1接種到新鮮培養(yǎng)基中，仍保持較強的活力，無延滯期，菌株快速生長，細(xì)胞數(shù)急劇增加，苯并[α]芘也在被利用。第10d時，OD600達(dá)到最大值（OD600=0.825），而降解菌群BaP1在第610天降解速率達(dá)到最大值，在第2030天幾乎不再降解苯并[α]芘。經(jīng)過30d的培養(yǎng)，苯并[α]芘的終濃度為12.39mg/L，總降解率為62.8%。對照組菌群OD600和苯并[α]芘濃度幾乎保持不變，即無降解無生長。

由于苯并[α]芘的難降解性，目前分離得到的苯并[α]芘降解菌群BaP1較少。如與鄭天凌等[1]自熱帶太平洋中部和東部的多金屬結(jié)核區(qū)深海沉積物中分離得到幾組苯并[α]芘降解深海微生物群DS2、DS10（60d后分別對BaP代謝了40.87%、41.39%），另外還有多組混合菌DS8、DS24、DS26（降解率都接近40%）。而近期費瑩瑩等[9]檢測發(fā)現(xiàn)新疆煤炭污染土壤中重度污染樣品中的群體微生物對苯并[α]芘的降解率明顯高于輕度和中度污染樣品，達(dá)到78.4%，輕度（L）、中度（M）、重度（H）煤炭污染土樣菌群在脅迫培養(yǎng)第1代后，對苯并[α]芘的降解率達(dá)到65.8%、81.9%、54.7%。比較而言，本研究富集得到苯并[α]芘降解菌群BaP1降解效率雖然較新疆煤炭污染土壤中重度污染樣品降解菌群BaP1的低，但是降解周期短，仍具有較好的應(yīng)用價值。

2.3環(huán)境因子對苯并[α]芘降解菌群BaP1降解苯并[α]芘的影響

溫度會影響降解菌群BaP1對苯并[α]芘的降解（圖2），隨著溫度的升高，苯并[α]芘的降解率也增加。在低溫時，T=25℃，降解菌群BaP1的降解率明顯降低，培養(yǎng)30天后，降解率仍不足40%。當(dāng)溫度提升至T=30℃，培養(yǎng)30天后，降解菌群BaP1的降解率高達(dá)72.95%，相較于T=25℃（36.16%），降解率約提升了一倍。而當(dāng)溫度繼續(xù)升高時，溫度對降解菌群BaP1的降解效率的影響就不是那么顯著了，T=37℃時，最終降解效率約提升了10%左右（相較于T=30℃）。溫度對微生物降解效率的促進(jìn)，往往主要有兩個可能，一是促進(jìn)了微生物的生長，大多數(shù)的微生物最適溫度約為30℃左右；二是提高酶活，在達(dá)到酶的最適溫度之前，溫度每升高10℃，降解速率提高二到四倍。

不同pH條件下降解菌群BaP1也顯示出不同的苯并[α]芘降解能力（圖3），隨著pH的升高，降解率略有升高。培養(yǎng)30天后，pH=6.03，7.13，8.04體系中降解菌群BaP1的降解率依次為：63.01%，73.05%，77.93%。而在最初的過程中（前10天），體系呈酸性（pH=6.03）或堿性（pH=8.04）都對降解菌群BaP1的降解存在抑制作用，很有可能是酸性或堿性環(huán)境使得降解菌群BaP1的延滯期加長，而在20天以后，隨著pH的升高，降解菌群BaP1降解率升高。

pH是改變環(huán)境中污染物的水溶性和控制將胞外化合物轉(zhuǎn)運到胞內(nèi)這一過程的關(guān)鍵因素之一。通常認(rèn)為，堿性環(huán)境比酸性環(huán)境更適合污染物生物降解。本研究中的苯并[α]芘降解菌群BaP1也表現(xiàn)出相似的降解現(xiàn)象。Pseudoxanthomonassp.DMVP2也是在堿性條件下獲得最高的菲降解率[10]。M.vanbaaleniiPYR1則通過將酸性代謝產(chǎn)物芘二氫二醇更多地轉(zhuǎn)化為甲基化衍生物來減輕酸性環(huán)境對其產(chǎn)生的壓力[11]。

2.4營養(yǎng)添加物對苯并[α]芘降解菌群BaP1降解苯并[α]芘的影響

酵母提取物和蛋白胨對降解菌群BaP1降解苯并[α]芘的影響呈相似的規(guī)律（圖4）。在初始10d內(nèi)，外加酵母提取物、蛋白胨均抑制降解菌群BaP1對苯并[α]芘的降解，降解效率分別為25.3%和23.1%，顯著低于未添加組（36.39%）?？赡茉蚴墙湍柑崛∥锖偷鞍纂说纳锟衫眯员缺讲α]芘高，降解菌群BaP1優(yōu)先利用它們生長。隨著營養(yǎng)物不斷被消耗，降解菌群BaP1轉(zhuǎn)而利用苯并[α]芘為生長底物，20d后，添加酵母提取物的實驗組中苯并[α]芘降解率升高至68.2%，而添加蛋白胨實驗組的降解率也增加為61.3%，都顯著高于未添加組的53.3%。培養(yǎng)30天后，酵母提取物與蛋白胨均促進(jìn)了降解菌群BaP1的苯并[α]芘降解，其中蛋白胨的促進(jìn)作用更明顯一些，降解率高達(dá)73.8%，未添加組約為62.95%。一般而言，對于高分子量的PAHs即四環(huán)以上的，由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性以及在水環(huán)境中的低溶解度，難以被微生物直接降解。研究表明，大多數(shù)微生物對4環(huán)以上的高分子量PAHs的降解是以共代謝的方式進(jìn)行的[1]。共代謝的存在大大促進(jìn)了一些難降解物質(zhì)在環(huán)境中被微生物降解的可能性[12]。如ChenandAiken[13]在預(yù)先培養(yǎng)的PseudomonassacchaiophilaP15降解BaP體系添加菲或水楊酸時，48h后，BaP的礦化率分別是未添加組的22倍和33倍。周海燕等[14]則表示向鹽環(huán)境中添加酵母粉、蛋白胨等微量營養(yǎng)物能克服環(huán)境中高鹽度和營養(yǎng)不足等極端影響因素，促進(jìn)微生物生長和加快底物利用，酵母粉能明顯促進(jìn)海旋菌TSL51對芘和苯并[α]芘的降解，而蛋白胨能使得原本不能利用苯并[α]芘為唯一碳源和能源生長的海旋菌TSL52利用苯并[α]芘，并且在25天后對苯并[α]芘的降解率達(dá)到38%。

3結(jié)論

（1）通過以苯并[α]芘為唯一碳源從石油污染土壤中富集馴化得到一個能高效降解苯并[α]芘的菌群BaP1。菌群16SrRNA基因高通量測序結(jié)果表明，該菌群主要以……

（2）在以苯并[α]芘（20mg/L）為唯一碳源的礦物鹽培養(yǎng)基中，降解菌群BaP1BaP1幾乎沒有延滯期，在10d內(nèi)OD600達(dá)到最大值0.825，而降解菌群BaP1在第610天降解速率達(dá)到最大值，在第2030天幾乎不再降解苯并[α]芘，30天后，苯并[α]芘總降解率約為62.8%。與其他苯并[α]芘降解菌群BaP1的降解效率相比，菌群BaP1表現(xiàn)出較高的苯并[α]芘降解能力，具有一定的開發(fā)利用價值。

（3）降解菌群BaP1BaP1對苯并[α]芘的降解受溫度與pH的影響。當(dāng)溫度由30℃降低至25℃，降解菌群BaP1的降解率明顯降低，培養(yǎng)30天后，降解率不足40%（T=25℃），相較于T=30℃（降解率為72.95%）約降低了一倍。而當(dāng)溫度繼續(xù)升高時，溫度對降解菌群BaP1的降解效率的影響就不是那么顯著了，T=37℃時，最終降解效率約提升了10%左右（相較于T=30℃）。在pH=6.08.0的范圍內(nèi)，隨著pH的升高，降解菌群BaP1最終降解率升高。但在培養(yǎng)初期，酸性條件與堿性條件均不利于苯并[α]芘的降解。

（4）酵母提取物或白胨的添加，均在初期抑制菌群對苯并[α]芘的降解，而后促進(jìn)菌群對苯并[α]芘的降解。在初始10d內(nèi)，外加酵母提取物或蛋白胨的實驗組中苯并[α]芘的降解效率分別為25.3%和23.1%，顯著低于未添加組（36.39%）。培養(yǎng)30天后，外加酵母提取物或蛋白胨的實驗組中苯并[α]芘的降解效率均顯著高于未添加組（62.95%），其中蛋白胨的促進(jìn)作用更明顯一些，降解率高達(dá)73.8%。

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指導(dǎo)教師：王慧，梁承月，何加林。