王恒波 肖乃衍 張華 陳平華

摘 要 為了防止國(guó)外商業(yè)化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因番木瓜流入國(guó)內(nèi)市場(chǎng)，建立轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1轉(zhuǎn)化事件定性PCR檢測(cè)方法，對(duì)于保護(hù)國(guó)內(nèi)消費(fèi)者知情權(quán)意義重大。本研究以轉(zhuǎn)基因抗環(huán)斑病毒番木瓜55-1為研究材料，利用外源基因和番木瓜基因組序列設(shè)計(jì)了9對(duì)特異性檢測(cè)引物，通過特異性引物篩選、熔解曲線分析、退火溫度優(yōu)化、特異性驗(yàn)證、靈敏度分析及檢測(cè)限驗(yàn)證，建立轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1轉(zhuǎn)化事件定性PCR檢測(cè)方法。結(jié)果表明：本研究篩選出的檢測(cè)引物，可特異的檢出轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1轉(zhuǎn)化事件，引物的檢測(cè)靈敏度達(dá)到了0.1%的標(biāo)準(zhǔn)，高于歐盟0.9%的檢測(cè)要求，完全可滿足轉(zhuǎn)基因檢測(cè)標(biāo)識(shí)制度的順利實(shí)施。

關(guān)鍵詞 番木瓜；轉(zhuǎn)基因；定性PCR；檢測(cè)

中圖分類號(hào) S432.42 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Transgenic papaya 55-1， which has been marketed in America for many years， is a genetically modified organism not currently approved for food in China. The paper aimed to establish a qualitative PCR detection method for transgenic papaya line 55-1 and its derivative products for preventing foreign transgenic papaya products into the Chinese market. Based on the exogenous gene and the papaya genome sequence， nine pairs of specific primers were designed with transgenic papaya 55-1 as the research material， using specific primer screening， melting curve analysis and optimization of annealing temperature， specific validation， sensitivity analysis and detection limit verification. The method of transgenic papaya 55-1 and it's derivates was established with qualitative PCR detection. The resulted showed that the screened primers， which could specialize to detect the transgenic papaya line 55-1， could reach 0.1% and the detection sensitivity of primers was higher than the requirements of the detection of EU 0.9%. The method of this paper would provide a scientific and reasonable experiment reference for validating the composition of genetic modified organisms in the future in China.

Keywords papaya； transgenic； qualitative PCR； detection

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.09.011

番木瓜（Carica papaya L.）又稱木瓜，原產(chǎn)南美洲，現(xiàn)階段主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)。因其果實(shí)厚實(shí)，果肉甜美可口，同時(shí)富含維生素C，其青果中的木瓜蛋白酶可用于醫(yī)藥、食品和化妝品等領(lǐng)域，但是由于番木瓜易受番木瓜環(huán)斑病毒（Papaya ring spot virus， PRSV）的侵襲，該病害為番木瓜的一種世界性毀滅性病害，一旦植株受到侵染，便很難防治，即使通過清除病株、應(yīng)用殺蟲劑防治昆蟲傳播病毒措施均很難有效控制病害[1]。我國(guó)華南地區(qū)田間病害發(fā)病率一般都達(dá)到30%以上，該病毒會(huì)引起番木瓜植株矮縮、葉片斑駁、含糖量降低，使其產(chǎn)業(yè)受到嚴(yán)重的威脅，甚至出現(xiàn)絕收[2]。由于番木瓜栽培種中缺乏抗性資源，而野生番木瓜中的抗性基因通過常規(guī)雜交育種又很難轉(zhuǎn)入番木瓜栽培種[3]，目前，世界各國(guó)育種者通過常規(guī)雜交育種方法均未獲得滿意的抗病品種。1987年美國(guó)康奈爾大學(xué)、夏威夷大學(xué)同Up John公司合作[4]，將PRSV HA5-1株系的外殼蛋白基因轉(zhuǎn)入番木瓜中，培育出對(duì)PRSV具有抗性的轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1品系，商業(yè)名稱Sunup和Rainbow[5]，田間實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)優(yōu)良。1997年番木瓜55-1通過美國(guó)農(nóng)業(yè)部、環(huán)保局及食品藥品監(jiān)管局的批準(zhǔn)，1998年5月起在夏威夷正式投入商業(yè)化生產(chǎn)[6]，這種抗病毒轉(zhuǎn)基因番木瓜極大地振興了夏威夷的番木瓜產(chǎn)業(yè)[7]。因此，將轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用于番木瓜的研究，對(duì)于保障番木瓜產(chǎn)業(yè)的健康、可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

近年來，特別是國(guó)內(nèi)由于食品安全事件層出不窮，引發(fā)了廣大消費(fèi)者對(duì)轉(zhuǎn)基因生物食品安全的憂慮與擔(dān)心，為了保護(hù)消費(fèi)者的知情權(quán)與選擇權(quán)，世界上多個(gè)國(guó)家與地區(qū)都對(duì)轉(zhuǎn)基因生物食品實(shí)施標(biāo)識(shí)管理。加之，由于我國(guó)對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實(shí)行強(qiáng)制標(biāo)識(shí)制度，為了標(biāo)識(shí)制度的順利執(zhí)行，轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的建立也應(yīng)該緊跟轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)品商業(yè)化生產(chǎn)的步伐。目前已經(jīng)建立轉(zhuǎn)化體特異性檢測(cè)方法的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體包括MON810、MON863、NK603、T25、TC1507、Bt11、Bt176、GA21、MON513、MON1445等[8-15]。

我國(guó)對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實(shí)行強(qiáng)制標(biāo)識(shí)制度，但目前為止，全世界獲準(zhǔn)商業(yè)化生產(chǎn)的抗病毒轉(zhuǎn)基因番木瓜有5種（Event 55- 1、Event 63- 1、X17- 2、華農(nóng)一號(hào)、YK系列）。但是針對(duì)上述轉(zhuǎn)化事件的檢測(cè)方法中，對(duì)于轉(zhuǎn)基因番木瓜定性PCR檢測(cè)引物篩選方法未見詳細(xì)介紹，為了加強(qiáng)對(duì)我國(guó)政府部門，對(duì)市場(chǎng)上流通的番木瓜進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行監(jiān)測(cè)，維護(hù)消費(fèi)者知情權(quán)，迫切需要建立適合轉(zhuǎn)基因番木瓜定性PCR檢測(cè)引物篩選方法。本研究根據(jù)GenBank公布的轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1所有的轉(zhuǎn)化載體邊界序列與番木瓜基因組序列，設(shè)計(jì)了9對(duì)轉(zhuǎn)化事件特異性引物，通過引物特異性、熔解曲線、退火溫度、靈敏度等方面進(jìn)行定性PCR檢測(cè)。因此，本研究建立的引物的篩選方法，期望為以后其他作物轉(zhuǎn)基因檢測(cè)體系的建立，提供一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)引物篩選程序。同時(shí)，本研究建立的檢測(cè)方法適用于含有轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1及其衍生產(chǎn)品的檢測(cè)，為其檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供理論和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1種子（由福建農(nóng)林大學(xué)郭晉隆副研究員提供），為了證實(shí)該種子的準(zhǔn)確性，本研究依據(jù)韓建勛等[16]的檢測(cè)方法，進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證，PCR產(chǎn)物經(jīng)過測(cè)序、比對(duì)發(fā)現(xiàn)與GenBank公布的轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1序列100%同源。轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1含量為5%、1%、0.5%、0.1%的標(biāo)準(zhǔn)品DNA是通過相同含量轉(zhuǎn)基因番木瓜DNA和非轉(zhuǎn)基因番木瓜紅妃2號(hào)，按質(zhì)量比（w/w）混合制成，轉(zhuǎn)基因番木瓜16-0-1、“華農(nóng)一號(hào)”、紅妃2號(hào)（非轉(zhuǎn)基因番木瓜），轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號(hào)、TT51-1，轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2、MON89788、A2704-12、A5547-127和轉(zhuǎn)基因玉米MON810、MON863、NK603、T25、TC1507、Bt11、Bt176、GA21、MIR604、MIR612等19種，為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑和儀器 PCR反應(yīng)試劑FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）購自廈門鷺隆生物科技有限公司，ExTaq酶、dNTPs、buffer購自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司，100 bp Ladder DNA Marker購自天根生化科技（北京）有限公司。Centrifuge 5810R臺(tái)式離心機(jī)（美國(guó)），ΜLtrospec2100核酸蛋白分析儀（日本），Mastercycler EP PCR熱循環(huán)儀（德國(guó)），ABI公司7500定量PCR儀（美國(guó)），EPS301電泳儀（瑞典），BIO-RAD公司凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI公布的轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1所用的轉(zhuǎn)化載體邊界序列與番木瓜基因組序列（GenBank no. FJ467933），采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。番木瓜內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Papain檢測(cè)引物采用Wall等[17]設(shè)計(jì)序列。具體檢測(cè)引物序列和擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度見表1。引物稀釋成10 ?mol/L備用。

1.2.2 PCR反應(yīng)體系與程序 定性PCR反應(yīng)體系25 μL：10×PCR Buffer（含Mg2+）2.5 μL，dNTPs（10 mmol/L）0.5 μL，引物10 μmol/L各1 μL，ExTaq酶0.125 μL，模板DNA（100 ng/μL）1 μL，加滅菌雙蒸水18.875 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56～60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min后，4 ℃保存?zhèn)溆?。電泳時(shí)加入6×Loading buffer 1 μL，取6 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。退火溫度的優(yōu)化是在PCR上設(shè)置50～60 ℃退火溫度范圍，取10個(gè)溫度梯度，分別為50.2、50.7、51.6、52.7、54.0、55.4、56.8、58.1、59.2、60 ℃。

定量PCR反應(yīng)體系：使用廈門鷺隆生物科技有限公司提供的Roche熒光定量試劑盒，按照說明書進(jìn)行反應(yīng)。擴(kuò)增條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，60 ℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)。熔解曲線溫度范圍為65.0～95.0 ℃，每間隔0.5 ℃讀數(shù)一次，每次1 s，連續(xù)記錄熒光信號(hào)的變化，可得到產(chǎn)物的Tm值。每個(gè)試樣均做3次重復(fù)。

1.2.3 定量檢測(cè)引物熔解曲線分析 本研究按照定量PCR反應(yīng)程序，將質(zhì)量百分含量為1%的轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1為陽性對(duì)照，進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增，在相同反應(yīng)條件下，通過9對(duì)引物進(jìn)行相互間比較，分別于起峰時(shí)Ct值的大小、熔解曲線及熔解曲線高度等，選擇出轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1最佳的檢測(cè)引物。

1.2.4 55-1轉(zhuǎn)化事件特異性PCR檢測(cè) 以材料中的11種轉(zhuǎn)基因植物（轉(zhuǎn)基因番木瓜YK、轉(zhuǎn)基因番木瓜RP、轉(zhuǎn)基因玉米Bt11、轉(zhuǎn)基因玉米Tc1507、轉(zhuǎn)基因玉米MON810、 轉(zhuǎn)基因玉米MON863、轉(zhuǎn)基因玉米T25、轉(zhuǎn)基因大豆A5547-127、轉(zhuǎn)基因大豆A2704-12、科豐6號(hào)、TT51-1水稻）為測(cè)試對(duì)象，以質(zhì)量百分含量為1%的轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1為陽性對(duì)照，非轉(zhuǎn)基因番木瓜紅妃2號(hào)為陰性對(duì)照，并設(shè)置空白對(duì)照。利用55-1-2引物對(duì)進(jìn)行定性PCR擴(kuò)增，通過電泳分析PCR產(chǎn)物大小，進(jìn)而驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1轉(zhuǎn)化體檢測(cè)引物的特異性。

1.2.5 55-1轉(zhuǎn)化事件特異性PCR靈敏度檢測(cè) 將轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1 的DNA與非轉(zhuǎn)基因番木瓜DNA溶液（100 ng/μL）按照不同比例混合配成相對(duì)含量為5%、1%、0.5%、0.1%的樣品，作為PCR檢測(cè)的模板，進(jìn)行靈敏度測(cè)試，設(shè)置空白對(duì)照。PCR擴(kuò)增初始模版濃度定為100 ng/μL，PCR反應(yīng)體系和PCR擴(kuò)增程序與1.2.2節(jié)相同。

1.2.6 檢出限的測(cè)試 將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的55-1番木瓜樣品，提取基因組DNA，進(jìn)行多次PCR擴(kuò)增，每次檢測(cè)設(shè)置2個(gè)平行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系和PCR擴(kuò)增程序與1.2.2節(jié)相同。

2 結(jié)果與分析

2.1 番木瓜DNA的質(zhì)量驗(yàn)證

高質(zhì)量的DNA是PCR擴(kuò)增獲得成功的前提條件。按照轉(zhuǎn)基因檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，必須先對(duì)番木瓜的內(nèi)源單拷貝基因Papain進(jìn)行定性PCR檢測(cè)，以目的條帶擴(kuò)增產(chǎn)物的有無，來判定提取的DNA是否適合進(jìn)行PCR擴(kuò)增，避免假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。從圖1可見，所有樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均能獲得與預(yù)期片段211 bp相一致，陰性對(duì)照與空白對(duì)照正常，表明提取的DNA質(zhì)量滿足PCR檢測(cè)要求。

2.2 引物的鑒定與篩選

為了篩選出最優(yōu)組合引物對(duì)，對(duì)55-1外源基因插入位點(diǎn)的左右邊界共設(shè)計(jì)出9對(duì)特異性引物，用于擴(kuò)增外源插入載體和番木瓜基因組連接區(qū)域的序列，擴(kuò)增產(chǎn)物的大小均在200～400 bp之間。開始采用通用的PCR擴(kuò)增條件，所用擴(kuò)增模板量一致，擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)，獲得了實(shí)際擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物大小一致結(jié)果（圖2），除了引物對(duì)1與引物對(duì)3擴(kuò)增的條帶較弱外，其余引物對(duì)都擴(kuò)增出各自預(yù)期大小一致的片段，特別是引物對(duì)2、引物對(duì)6、引物對(duì)8擴(kuò)增條帶很亮，說明該引物對(duì)擴(kuò)增效率較高。

2.3 熔解曲線分析

由圖3可知，從9對(duì)引物各自的熔解曲線分析，只用引物對(duì)2與引物對(duì)5呈比較典型的單峰曲線，且峰值較高，說明該引物與模板結(jié)合性好，PCR擴(kuò)增效率高，進(jìn)而擴(kuò)增產(chǎn)物量多，但是在隨后的品系特異性驗(yàn)證過程中發(fā)現(xiàn)，引物對(duì)5對(duì)于非轉(zhuǎn)基因番木瓜有非特異性擴(kuò)增片段。其余7對(duì)引物對(duì)都在不同程度上產(chǎn)生雙峰，極大地影響了PCR的擴(kuò)增效率。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，引物對(duì)2不僅特異性強(qiáng)，且PCR擴(kuò)增效率高，為轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1品系特異性檢測(cè)最適引物對(duì)。

2.4 特異性引物退火溫度的優(yōu)化

由圖4可知，隨著退火溫度的逐漸升高，特異性引物能檢測(cè)出目的條帶，沒有非特異性條帶出現(xiàn)，說明該特異性檢測(cè)引物適宜的退火溫度范圍均較廣，其中6號(hào)泳道（55.4 ℃）擴(kuò)增產(chǎn)物顯示出濃度較高、條帶較亮，即通過引物的篩選和反應(yīng)條件的優(yōu)化，確定了最適退火溫度為56 ℃，該退火溫度也是番木瓜內(nèi)源基因Papain最適退火溫度，且兩者擴(kuò)增產(chǎn)物大小比較接近。因此，在實(shí)際檢測(cè)過程中，可將檢測(cè)內(nèi)源基因Papain和品系特異性55-1轉(zhuǎn)化事件同時(shí)進(jìn)行。

2.5 轉(zhuǎn)化事件55-1特異性引物55-1-2的PCR特異性檢測(cè)

本研究選擇了多種不同轉(zhuǎn)基因植物品系，涵蓋玉米、番木瓜、水稻、大豆等作物，驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1轉(zhuǎn)化事件檢測(cè)引物的特異性。檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，僅從轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1品系檢測(cè)出了275 bp的目的片段，其他參試材料均未擴(kuò)增出任何片段，這表明本研究建立的番木瓜55-1轉(zhuǎn)化事件檢測(cè)方法具有良好的特異性和準(zhǔn)確性。

2.6 55-1轉(zhuǎn)化事件PCR靈敏度檢測(cè)

以4種不同相對(duì)含量的轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1的樣品為模板，按照優(yōu)化后的退火溫度56 ℃進(jìn)行定性PCR擴(kuò)增（圖6）。結(jié)果顯示，在含量為0.1%以上（含0.1%）的樣品中均能穩(wěn)定擴(kuò)增到預(yù)期DNA片段，表明方法的靈敏度可達(dá)到0.1%，完全符合轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的要求。

2.7 檢出限的確定

為了進(jìn)一步測(cè)試檢測(cè)方法的檢出限，結(jié)果如圖7所示。在48次檢測(cè)中，均能穩(wěn)定檢測(cè)出275 bp的預(yù)期DNA片段，表明本標(biāo)準(zhǔn)方法的檢出限可以穩(wěn)定達(dá)到為0.1%水平。

3 討論

近年來，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的逐步發(fā)展和完善，轉(zhuǎn)基因作物及制品越來越多，其相對(duì)應(yīng)的檢測(cè)體系和檢測(cè)方法，尤其是指檢測(cè)引物更加多樣（分為篩選檢測(cè)引物、基因特異性檢測(cè)引物、結(jié)構(gòu)特異性檢測(cè)引物和轉(zhuǎn)化事件特異性檢測(cè)引物，相應(yīng)的又分為定性檢測(cè)和定量檢測(cè)引物）[18]。如何設(shè)計(jì)和篩選既適合定性PCR又適合定量PCR引物對(duì)，對(duì)于檢測(cè)者來講需要更高的技術(shù)水平。本研究所建立的引物篩選方法，以熒光染料的可視化為基礎(chǔ)，首先設(shè)計(jì)了多對(duì)特異性引物，其次是通過引物特異性、熔解曲線、退火溫度、靈敏度、檢出限等方面進(jìn)行定性PCR檢測(cè)，并且層層篩選和驗(yàn)證，最后選擇了1對(duì)特異性強(qiáng)、擴(kuò)增效率高的檢測(cè)引物，該引物不僅適合轉(zhuǎn)基因番木瓜普通的定性PCR檢測(cè)，而且也適合定量PCR檢測(cè)。該引物的篩選方法的建立解決了許多轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)方法僅僅適合定性或定量檢測(cè)單一檢測(cè)目的，實(shí)現(xiàn)了定性和定量PCR檢測(cè)引物可以共用的目的，降低了測(cè)試成本，提高檢測(cè)效率。本研究以世界上第一個(gè)商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因抗病毒番木瓜55-1為材料，篩選出的引物特異性強(qiáng)、靈敏度高，完全可以達(dá)到0.1%的檢測(cè)閾值，高于歐盟0.9%的標(biāo)識(shí)要求，建立了適合轉(zhuǎn)化事件55-1特異性檢測(cè)的定性PCR檢測(cè)方法。

對(duì)于常規(guī)的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)，一般選擇作物的種子為檢測(cè)對(duì)象。因?yàn)榉N子抽樣簡(jiǎn)單，而且易于運(yùn)輸和保存，不容易腐爛、變質(zhì)。本研究在檢測(cè)番木瓜種子時(shí)，發(fā)現(xiàn)番木瓜種子的種皮有黑色物質(zhì)，且種子堅(jiān)硬，筆者曾經(jīng)試圖通過研磨種子提取DNA，發(fā)現(xiàn)種皮的黑色物質(zhì)始終存在，即使通過吸附柱過濾，將提取的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中大部分DNA不能擴(kuò)增出條帶，該結(jié)果與韓建勛等[16]的研究發(fā)現(xiàn)類似。通過浸泡種子后，將黑色種皮剝?nèi)ィ龠M(jìn)行種子研磨，提取番木瓜種子DNA都能滿足PCR擴(kuò)增要求，未發(fā)現(xiàn)有PCR抑制物質(zhì)存在。本研究改良的方法提取番木瓜種子DNA適合進(jìn)行PCR擴(kuò)增，不僅純度高，而且易于操作。

由于定性PCR是終點(diǎn)定量法，無法說明引物的擴(kuò)增效率，本研究按照SYBR Green 染料法，將1%含量的轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1 的DNA樣品進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增，通過熔解曲線性狀和峰值大小，來判斷引物與模板退火是否適合。如果引物特異性強(qiáng)、擴(kuò)增效率高， PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量多，溶解曲線的單一，且峰值最高[19]。這種方法常應(yīng)用在熒光定量PCR的引物篩選中，但是在定性PCR檢測(cè)引物篩選中未見應(yīng)用。在隨后的品系特異性驗(yàn)證過程中發(fā)現(xiàn)，除了引物對(duì)55-1-2的特異性強(qiáng)和擴(kuò)增效率高外，其余引物對(duì)都在不同程度上產(chǎn)生雙峰，極大降低了PCR的擴(kuò)增效率，對(duì)于將要建立的轉(zhuǎn)基因番木瓜的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)而言，該引物對(duì)要經(jīng)得起多種混合DNA干擾擴(kuò)增出特異性的目標(biāo)序列。因此，引物對(duì)55-1-2為轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1轉(zhuǎn)化事件特異性檢測(cè)最適引物。

綜上所述，為了進(jìn)一步驗(yàn)證本研究建立檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性、特異性，通過在福州市各個(gè)水果批發(fā)市場(chǎng)、大型超市、小型水果商店隨機(jī)抽樣調(diào)查，共抽樣60個(gè)，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)，檢測(cè)出的陽性樣品都是臺(tái)灣中興大學(xué)研發(fā)的GM-YK系列，由于所有抽檢樣品產(chǎn)地都是國(guó)內(nèi)生產(chǎn)的番木瓜，未發(fā)現(xiàn)國(guó)外進(jìn)口的番木瓜55-1。在隨后多次的模擬檢測(cè)中，本研究建立的定性PCR檢測(cè)方法具有很高的穩(wěn)定性，能對(duì)轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1 進(jìn)行快速準(zhǔn)確的分子鑒定。

參考文獻(xiàn)

[1] Manshardt R， Lius S， Sondur S， et al. Papaya breeding for PRV resistance[J]. Acta Horticulturae， 1995（370）： 27-32.

[2] 陳 健. 番木瓜栽培關(guān)鍵技術(shù)[M]. 廣州： 廣東省出版集團(tuán)， 2004： 242.

[3] 饒雪琴， 李華平. 轉(zhuǎn)基因番木瓜研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)生物工程雜志， 2004， 24（6）： 38-42.

[4] Lius S， Manshardt R M， Fitch M M M， et al. Pathogen-derived resistance provides papaya with effective protection against papaya ring spot virus[J]. Molecular Breeding， 1997， 3（3）： 161-168.

[5] Fitch M M， Manshardt R M， Gonsalves D， et al. Transgenic papaya plants from Agrobacterium-mediated transformation of somatic embryos[J]. Plant Cell Reports， 1993， 12（5）： 245-249.

[6] Gonsalves D， Ferreira S， Manshardt R， et al. Transgenic virus resistant papaya： new hopefor controlling papaya ringspot virus in Hawaii[J]. Plant Health Progress， 2000， doi：10.1094/PHP-2000-0621-01-RV.

[7] Suzuki J Y， Tripathi S， Fermín G A， et al. Characterization of insertion sites in rainbow papaya， the first commercialized transgenic fruit crop[J]. Tropical Plant Biology， 2008， 1（3-4）： 293-309.

[8] Berdal K G， Holst-Jensen A. Roundup Ready soybean event-specific real-time quantitative PCR assay and estimation of the practical detection and quantification limits in GMO analyses[J]. European Food Research & Technology， 2001， 213（6）： 432-438.

[9] Nielsen C R， Berdal K G， Holst-Jensen A. Characterisation of the 5′ integration site and development of an event-specific real-time PCR assay for NK603 maize from a

low starting copy number[J]. European Food Research & Technology， 2004， 219（4）： 421-427.

[10] Hernández M， Esteve T， Prat S， et al. Development of real-time PCR systems based on SYBR Green I， Amplifluor? and TaqMan technologies for specific quantitative detection of the transgenic maize event GA21[J]. Journal of Cereal Science， 2004， 39（1）： 99-107.

[11] Hernández M， Pla M， Esteve T， et al. A Specific real-time quantitative PCR detection system for event MON810 in maize yield gard based on the 3′-transgene integration sequence[J]. Transgenic Research， 2003， 12（2）： 179-189.

[12] Huang H Y， Pan T M. Detection of genetically modified maize MON810 and NK603 by multiplex and real-time polymerase chain reaction methods[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry， 2004， 52（11）： 3 264-3 268.

[13] Pan A， Yang L， Xu S， et al. Event-specific qualitative and quantitative PCR detection of MON863 maize based upon the 3?-transgene integration sequence[J]. Journal of Cereal Science， 2006， 43（2）： 250-257.

[14] Taverniers I， Windels P， Va?tilingom M， et al. Event-specific plasmid standards and real-time PCR methods for transgenic Bt11， Bt176， and GA21 maize and transgenic GT73 canola[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry， 2005， 53（8）： 3 041-3 052.

[15] Yang L， Xu S， Pan A， et al. Event specific qualitative and quantitative polymerase chain reaction detection of genetically modified MON863 maize based on the 5'-transgene integration sequence[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry， 2005， 53（24）： 9 312-9 318.

[16] 韓建勛， 陳紅運(yùn)， 鄧婷婷， 等. 抗病毒轉(zhuǎn)基因番木瓜的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)[J]. 檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊， 2010， 20（1）： 15-20.

[17] Wall E M， Lawrence T S， Green M J， et al. Detection and identification of transgenic virus resistant papaya and squash by multiplex PCR[J]. European Food Research & Technology， 2004， 219（1）： 90-96.

[18] 張 麗， 武玉花， 吳 剛， 等. 轉(zhuǎn)基因油菜篩查檢測(cè)策略研究[J]. 中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)， 2012， 34（1）： 74-81.

[19] 陳如敬， 黃秋宇， 修金生， 等. 豬細(xì)環(huán)病毒k2型SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立[J]. 中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)， 2016（5）： 10-15.