黃夢利　王小英　馮劍　鄭希龍　林天東　劉洋洋

摘 要 為建立黎藥海巴戟藥材質量標準，為其質量控制及資源開發(fā)利用提供科學依據。依據《中國藥典》2015年版中藥質量標準研制的要求，對藥材性狀、鑒別、檢查、浸出物、含量測定等進行研究。明確了海巴戟藥材性狀和顯微結構特征，并建立了其專屬性薄層色譜鑒別方法；規(guī)定海巴戟藥材多糖含量不得少于6.0%、東莨菪內酯含量不得低于0.017%、水分不得超過10.0%、總灰分不得超過6.0%以及醇溶性浸出物不得少于20.0%。本研究制定的黎藥海巴戟藥材質量標準，可為該藥材的質量控制提供依據。

關鍵詞 海巴戟；黎藥；質量標準；東莨菪內酯

中圖分類號 Q949.781.1 文獻標識碼 A

Abstract The article aimed to establish the quality standard of Hainan Li folk medicine of Morinda citrifoliae Fructus， and provide a scientific basis for its quality control and resource development and utilization.According to the requirements for the development of the quality standard of Chinese Pharmacopoeia （2015）， the character， identification， inspect， extract and content determination were developed. The characteristics and microstructure of medicinal materials of M. citrifoliae were identified for the first time， and a TLC identification method was established with specificity. The content of polysaccharide， scopolamine and alcohol-soluble extractive was not less than 6.0%， 0.017% amd 20.0%， respectively， while that of moisture and total ash was not more than 10.0% and 6.0% correspondingly.

Keywords Morinda citrifoliae Fructus； Li folk medicine； quality standards； scopolamine

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.08.009

黎藥海巴戟（Morinda citrifoliae Fructus）為茜草科巴戟天屬植物海巴戟Morinda citrifolia L.的干燥果實，又稱“NONI”，分布于太平洋諸島嶼、菲律賓、澳大利亞、柬埔寨，及我國海南島、西沙群島和臺灣島[1]。海巴戟味甘、澀，性平；富含多糖、蒽酮類、環(huán)烯醚萜苷類等活性成分[2]，具有抗菌、抗病毒、降血壓等功效，可用于治療口腔潰瘍、腫瘤、高血壓等疾病[2-5]，海南黎族民間常用于緩解病痛。國外學者對海巴戟進行大量研究，相關論文檢索數量高達數萬篇，現今已成為風靡日本乃至歐美地區(qū)的保健品及藥用飲料；國內學者研究主要集中在化學成分鑒定與定量分

析[6-10]、作用機制[11-13]、栽培技術[14-17]、品種改良與種質評價[18-20]等方面。李戈等[21]通過測定灰分、水分，利用紫外可見分光光度計測定黃酮與多糖含量以及高效液相測定車草葉酸含量的方法，對采自云南、海南、東南亞的海巴戟果進行分析比較。

海巴戟藥材至今尚未被《中國藥典》或地方藥材標準收載。為了完善藥材有效性控制，填補海南黎藥海巴戟藥材標準的空白，本研究對來自海南不同主產區(qū)的13批藥材從性狀、顯微特征、薄層色譜鑒別、多糖、東莨菪內酯（7-羥基-6-甲氧基香豆素）、浸出物、總灰分及水分進行了研究，制定了黎藥海巴戟藥材質量標準。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 海巴戟藥材分別采自海南?？?、文昌、瓊海、萬寧、三亞、陵水的沿海地區(qū)，經中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所海南分所鄭希龍副研究員鑒定為茜草科巴戟天屬植物海巴戟（Morinda citrifolia L.）的干燥果實，原植物臘葉標本和藥材憑證標本保存于海南省中藥材標本館（海南省?？谑行阌^(qū)藥谷四路4號中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所海南分所內），樣品信息見表1。藥材曬干后，粉碎備用。

1.1.2 儀器與試劑 Waters 1525高效液相色譜儀（沃特世科技有限公司），ECLIPSE80i型生物顯微鏡（尼康映像儀器銷售有限公司），FURNACE 1000c纖維馬弗爐（天津市中環(huán)實驗電爐有限公司），UV_2450紫外-可見光光度計（日本島津制作所），DHG-9053A電熱鼓風恒溫干燥箱（浙江托普儀器有限公司），數顯6孔恒溫水浴鍋（金壇市城西崢嶸實驗儀器廠），CP114型1/1萬電子天平（上海奧豪斯儀器有限公司），PL203型1/1000電子天平（梅特勒-托利多上海儀器有限公司），JY025型紫外分析儀（北京君意東方電泳設備有限公司）。所用玻璃器皿均為Bomex牌A級。

東莨菪內酯對照品（批號110768-200504）購自中國食品藥品檢定研究院，D-葡萄糖（純度≥99.8%）購自北京索萊寶科技有限公司。超純水，乙腈、磷酸為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 海巴戟藥材性狀檢定 采用《中國藥典》2015版（四部）通則0212項[22]下的檢定方法，對海巴戟藥材的形狀、大小、表面色澤與特征、質地、斷面及氣味等特征進行觀察并描述。

1.2.2 海巴戟顯微與薄層色譜鑒別 顯微鑒別：采用顯微鑒別法[22]進行鑒定。將海巴戟粉末過四號篩，挑取少許置載玻片上，滴加水合氯醛試液進行透化，加蓋蓋玻片，于生物顯微鏡下觀察海巴戟藥材顯微結構。

薄層色譜鑒別：分別取海巴戟藥材粉末0.5 g，加乙醇8 mL，超聲處理30 min，濾過，濃縮至3 mL，作為供試品溶液。另取東莨菪內酯對照品

適量，用乙醇配制成76 μg/mL的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法實驗[22]，吸取上述溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～ 90 ℃）-氯仿-乙酸乙酯（3：2：3）為展開劑，展開，取出晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。再噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點清晰后于日光燈下檢視。

1.2.3 浸出物、總灰分、水分、多糖含量的測定

浸出物、總灰分、水分含量分別測定參照《中國藥典》2015年版（四部）通則下的醇溶性浸出物測定法、總灰分測定法、烘干法進行測定[22]。

海巴戟多糖含量參照《中國藥典》2015年版（四部）通則0401項下的紫外-可見光光度法進行測定[22]。取無水葡萄糖對照品10 mg，精密稱定，加水溶解定容至置100 mL，作為對照品溶液；分別精密量取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL至具塞試管中，加水補至2.0 mL，加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速加入硫酸5 mL，搖勻，靜置10 min，置40 ℃水浴中保溫15 min，取出，冷卻至室溫，以相應試劑為空白，在490 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制出標準曲線。取海巴戟藥材粗粉0.5 g，精密稱定，加乙醚100 mL，加熱回流1 h，靜置，放冷，棄去乙醚液，殘渣置水浴鍋上揮盡乙醚。加入80%乙醇100 mL加熱回流1 h，趁熱濾過，濾渣與濾器用熱80%乙醇30 mL分次洗滌，濾渣與濾紙置燒瓶中，加水100 mL，加熱回流2 h。趁熱濾過，用少量熱水洗滌濾器，合并濾液與洗液，放冷，定容至100 mL，取1 mL再定容至10 mL，最后精密量取1 mL，置具塞試管中，加水1.0 mL，照標準曲線的制備項下的方法，自“各精密加入5%苯酚溶液1 mL”起依法測定吸光度，從標準曲線上讀出供試品溶液中含葡萄糖的重量（mg），計算，即得。

1.2.4 東莨菪內酯含量的測定 液相色譜條件：Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫30 ℃；以乙腈（A）0.5%冰醋酸（B）為流動相，梯度洗脫：0～5 min，5%～30% A；5～10 min，30%～65% A；10～20 min，65% A；20～ 21 min，65%～90% A；21～25 min，90% A；25～ 26 min，90%～5% A。流速1.0 mL/min，檢測波長為345 nm，進樣量10 μL。理論塔板數以東莨菪內脂峰計算應不低于6 000。

供試品溶液的制備：海巴戟藥材粉碎后，取粉末0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過。取續(xù)濾液，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

對照品溶液的制備：稱取東莨菪內脂對照品2.55 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋成每1 mL含51 μg的溶液，即得。

方法學考察：①線性范圍考察：精密量取對照品溶液0.5、1、2、3、6、12 mL分別置于25 mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，即得1.02、2.04、4.08、6.12、12.247、24.48 μg/mL的東莨菪內脂對照品溶液，精密吸取不同濃度對照品溶液各 10 μL，按上述液相色譜條件依次進樣測定并進行線性回歸。②精密度實驗：取同一濃度對照品溶液各1 mL，重復進樣6次，測定峰面積及其RSD，考察儀器精密度是否良好。③穩(wěn)定性實驗：取同一海巴戟供試品溶液，分別于0、4、8、16、24 h進樣分析，測定東莨菪內酯的峰面積及其RSD，考察供試品溶液在24 h內的穩(wěn)定性。④重現性實驗：取海巴戟藥材平行制備供試品溶液5份，分別計算東莨菪內酯的峰面積、相對保留時間的RSD，考察該方法的重現性是否良好。⑤加樣回收率測定：精密稱取已知濃度的同一批藥材樣品各5份，每份0.12 g，分別精密加入適量東莨菪內酯，按實驗材料制備方法平行制備供試品溶液，按上述液相色譜條件進樣分析，測定并計算東莨菪內酯的加樣回收率。

樣品含量測定：取13批供試品溶液，按上述液相色譜條件進樣分析進樣，測定東莨菪內酯峰面積，以外標法計算含量。

1.3 數據處理

采用SPSS23.0、Empower工作站等軟件進行數據處理及統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 藥材性狀

海巴戟藥材呈類圓形或長橢圓形片塊狀，稍皺縮，質堅脆，橫切直徑2.5～5 cm，縱切長3～ 6.5 cm、寬2.5～4.5 cm，均厚0.2～0.6 cm。表面黑色、棕褐色或棕色，切口邊緣皮部以棕褐色為主，偶帶青綠色，附有疙瘩眼；內嵌生扁平卵形種子數粒，多為空殼，緊密排列。具有濃烈的特異氣味（圖1）。

2.2 鑒別

2.2.1 顯微鑒別 海巴戟藥材粉末呈土黃色。多見薄壁細胞、纖維與導管。薄壁細胞呈無色，或黃棕色，壁薄，類橢圓形、類長方形或多角形，部分薄壁細胞含淀粉粒（圖2-A）；纖維棕黃色，呈長梭形，末端鈍圓或斜尖，木化，壁薄，孔溝線形，單個或成束存在，多為成束且上下縱橫交錯、斜向交錯或平行排列；導管為環(huán)紋或螺紋，少數為網紋，與纖維成束或單個鑲嵌于薄壁細胞間，無色或黃色；石細胞少見，淡黃色呈類方形、紡錘形或多角形，單個散離或數個整齊連接，紋孔與孔溝細密。非腺毛偶見，由2～3個細胞組成，壁光滑，稍有彎曲（圖2）。

2.2.2 薄層色譜鑒別 硅膠G薄層板置紫外燈（365 nm）下檢視，各實驗材料（1～13號）色譜與對照品S色譜在Rf值為0.45左右均顯色藍色的熒光斑點（圖3-A）；再噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點清晰后于日光燈下檢視，各供試品色譜相應的位置上均顯示相同顏色的斑點（圖3-B）。

2.3 浸出物、總灰分、水分和多糖的測定

13批海巴戟藥材樣品的浸出物、總灰分和水分以及海巴戟多糖測定結果如表2所示。結果表明，不同批次海巴戟中浸出物含量差異較大，可能是受海巴戟樣品采收時間及成熟度的影響，其中采自萬寧北坡的海巴戟醇溶性浸出物含量最高，萬寧龍滾的最低；采自?？诘亩嗵呛孔罡?，萬寧興隆的最低。

2.4 東莨菪內酯的含量測定

2.4.1 系統(tǒng)適用性實驗 按第1.2.4節(jié)所述的液相色譜條件進樣分析，所得色譜峰的分離度、靈敏度良好（圖4）。

2.4.2 方法學考察 （1）線性范圍 考察以峰面積為縱坐標（Y軸），東莨菪內脂對照品的濃度作為橫坐標（X軸）作圖，繪制標準曲線，得到東莨菪內脂的回歸方程為Y=49 955X+6 647.7，R2= 0.999 7，結果表明，東莨菪內脂對照品在1.02～ 24.48 μg/mL濃度范圍內線性關系良好。

（2）精密度實驗 重復進樣6次的東莨菪內脂對照品峰面積的RSD為1.21%，表明儀器精密度良好。

（3）穩(wěn)定性實驗 測得峰面積的RSD為1.34%，表明供試品溶液在24 h內的穩(wěn)定性良好。

（4）重現性實驗 平行制備的供試品溶液中，測得東莨菪內酯峰的相對保留時間的RSD為0.03%，峰面積RSD為3.76%，表明該方法重現性良好。

（5）加樣回收率實驗 測得平均加樣回收率為98.80%，RSD為0.84%（表3）。

2.4.5 樣品含量測定 按干燥品計，13批海巴戟藥材東莨菪內酯含量為（208.00±26.45） μg/g，其中采自萬寧神州半島的海巴戟東莨菪內酯含量最高（表4）。

3 討論

3.1 海巴戟藥材藥用部位的確定

《中華本草》[23]記載海巴戟根具有清熱解毒功效，用于治療痢疾、肺結核等癥。而海南黎族醫(yī)藥中使用海巴戟干果用于增強人體免疫力、抗病毒、抗癌、降糖、降壓等。此外，現代藥理學研究表明[24-25]，海巴戟果還具有抗菌、驅蟲、止痛、抗氧化等功效。因此，本研究所制定的黎藥海巴戟藥材質量標準應規(guī)定藥用部位為海巴戟干果。

3.2 海巴戟藥材質量標準指標的確定

本研究通過顯微切片觀察發(fā)現海巴戟藥材切面的主要結構為儲藏營養(yǎng)物質的不規(guī)則薄壁細胞群，不具有鑒別代表性，且果肉中密集鑲嵌較堅硬的種子，不利于進行顯微切片，而海巴戟藥材粉末顯微結構多見薄壁細胞、纖維與導管。因此，本文將海巴戟藥材粉末顯微特征作為鑒別指標之一。

海巴戟藥材含水量、總灰分和醇溶性浸出物含量限值擬定主要在藥材在采收、加工、運輸及存儲等多個環(huán)節(jié)來進行評定，經測定，室內外自然放置及干燥保存條件下的海巴戟藥材水分含量為4.9%～7.7%，借鑒王佰靈等[26]采取的限值方法，得到海巴戟水分含量限定標準為6.3%×1.2= 7.6%，考慮到海南全年氣候潮濕，且海巴戟抗氧化性強不易變質，擬規(guī)定海巴戟水分含量不得過10.0%。海巴戟藥材為干果，在采收加工過程中泥土、石粒等無機物的雜質較少，因此，本文規(guī)定總灰分含量不得超過6.0%；海巴戟藥材有效成分在乙醇中的溶出率較高，且加熱后更易于溶出，故本文采用醇溶性熱浸法測定海巴戟藥材的浸出物，并規(guī)定海巴戟藥材醇溶性浸出物含量不少于20.0%。

多糖是海巴戟果的主要功效成分之一，具有增強免疫、抗病毒、抗癌、抗炎鎮(zhèn)痛、降血糖等多種活性[27]。李戈等[21]采用紫外-可見光光度法測定海巴戟多糖的研究中，以先加水浸泡水浴加熱后用80%乙醇離心提取的方法來制備供試品溶液，測得海巴戟干果多糖為30.101～64.021 mg/g。本研究在用80%乙醇提取多糖之前先加入適量乙醚，測得13批海巴戟多糖含量為6.0%～9.2%，即59.62～92.03 mg/g，本品按干燥品計算，含海巴戟多糖以葡萄糖（C6H12O6）計，擬定不得少于6.0%。該方法不僅能排除部分水溶性蛋白質與脂類的對結果的干擾，且操作簡單，多糖提取效率高。

東莨菪內酯（7-羥基-6-甲氧基香豆素）為海巴戟果中的主要活性成分之一[28-29]，因此，本研究將東莨菪內酯作為海巴戟薄層色譜鑒別和高效液相色譜法含量測定的指標性成分。陳晨等[30]測定新鮮海巴戟果漿及中藥復方保健品中所含東莨菪內酯的含量為17.0 μg/g；沈宋利等[29]測定其果粉產品和果珍中東莨菪內酯含量為2.08 mg/g。本研究采用甲醇超聲萃取30 min的樣品測定東莨菪內酯，東莨菪內酯含量為171.26～259.37 μg/g，該方法準確、靈敏度高，操作簡單方便，成本較低，可用于海巴戟藥材中東莨菪內酯的含量測定，且擬規(guī)定：按干燥品計算，海巴戟所含東莨菪內酯（C10H8O4）不得少于0.017%。

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