劉遠(yuǎn)征 漆艷香 曾凡云 丁兆建 何壯 彭軍 張欣 謝培蘭 謝藝賢

摘 要 本研究克隆并鑒定香蕉枯萎病菌4號(hào)生理小種（Foc4）β1-微管蛋白（β1-tub）基因，采用Split-marker同源重組技術(shù)獲得Foc4的β1-tub基因敲除突變體，通過(guò)測(cè)定突變體菌株的生長(zhǎng)速度、產(chǎn)孢量、致病力及對(duì)多菌靈敏感性，研究β1-tub基因在香蕉枯萎病菌的生長(zhǎng)發(fā)育及對(duì)多菌靈抗藥性中的作用。結(jié)果表明：與Foc4野生型菌株相比，敲除突變體生長(zhǎng)緩慢、菌絲畸形及產(chǎn)孢量增加，對(duì)巴西蕉苗的致病力明顯減弱，但對(duì)多菌靈的抗性水平無(wú)明顯變化。由此推測(cè)β1-tub基因可能在Foc4的生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)孢及致病力等方面具有重要的作用。

關(guān)鍵詞 香蕉枯萎病菌；β1-微管蛋白；基因敲除；致病力

中圖分類(lèi)號(hào) S436.681 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Functional Analysis of the β1-tubulin Gene in Fusarium oxysporum f. sp. cubense Race 4

LIU Yuanzheng1，2， QI Yanxiang2， ZENG Fanyun2， DING Zhaojian2， HE Zhuang1，2，

PENG Jun2， ZHANG Xin2， XIE Peilan2， XIE Yixian2*

1 Institute of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

2 Environment and Plant Protection Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract In this study， the β1- tubulin （β1-tub） gene in F.oxysporum f. sp. cubense race 4 （Foc4） was cloned and identified. The gene-knockout mutants of β1-tub gene in Foc4 were obtained by split-marker homologous recombination technique. The growth rate， sporulation， pathogenicity and sensitivity to carbendazim of the mutant strain were studied to investigate the effects of β1-tub on the growth， development and carbendazim resistance in Foc4. The results demonstrated that the knockout mutants of β1-tub showed slow growth， the hyphal deformity and increased conidium production， and significantly decreased pathogenicity to banana （Cavendish， AAA）， but no significant change in the resistance level to carbendazim when compared with the wild type isolate of Foc4. Therefore， we hypothesized that the β1-tub gene might play an important role in the growth， sporulation and pathogenicity of Foc4.

Key words Fusarium oxysporum f. sp. cubense； β1- tubulin； gene knockout； pathogenicity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.06.017

由尖孢鐮刀菌古巴專(zhuān)化型（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）引起的香蕉枯萎病是破壞香蕉維管束導(dǎo)致植株死亡的毀滅性土傳維管束病害，已給香蕉產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在實(shí)際生產(chǎn)中，使用化學(xué)殺菌劑、生物藥劑對(duì)香蕉枯萎病防治的效果并不理想。種植抗（耐）病品種是當(dāng)前該病綜合治理中最為有效的方法之一。然而，目前生產(chǎn)上栽培的較抗（耐）枯萎病香蕉品種均是通過(guò)體細(xì)胞無(wú)性系變異獲得的，通過(guò)無(wú)性變異獲得的抗耐病品種易因病原菌的進(jìn)化而逐漸喪失抗病性[1]。

苯并咪唑類(lèi)殺菌劑（如多菌靈及以多菌靈為主的混/復(fù)配藥劑）具有廣譜、 高效、作用靶標(biāo)位點(diǎn)單一和內(nèi)吸性等特點(diǎn)，被廣泛用于防治鐮刀菌引起的植物病害[2-3]。該類(lèi)殺菌劑主要作用于病原菌的β-微管蛋白，阻止菌體形成紡錘體，進(jìn)而抑制有絲分裂，但由于藥劑作用位點(diǎn)單一，病原菌在藥劑選擇壓力下較易產(chǎn)生抗藥性[4-5]。已有研究結(jié)果表明，多菌靈對(duì)香蕉枯萎病有一定防預(yù)作用[6]，但效果不太理想。

目前，由于缺乏理想的化學(xué)藥劑、抗病品種等防治措施，香蕉產(chǎn)業(yè)面臨著極大的威脅。近年來(lái)，對(duì)于香蕉枯萎病的致病機(jī)理與致病相關(guān)基因的研究已經(jīng)在G蛋白、過(guò)氧化氫酶、MAPK通路等方面取得了一定進(jìn)展[7-11]。對(duì)于β-微管蛋白的研究主要集中在其突變所產(chǎn)生的抗藥性等方面[12]。

為了闡明香蕉枯萎病菌中β1-微管蛋白基因是否在抗藥性及在病原菌致病過(guò)程中發(fā)揮作用，利用同源重組的原理獲得了該基因的敲除突變體，并對(duì)敲除突變體的生長(zhǎng)速度、產(chǎn)孢量、致病力及對(duì)多菌靈敏感性等生物學(xué)特性進(jìn)行分析，完善該基因的具體功能，為香蕉枯萎病菌對(duì)多菌靈等苯并咪唑類(lèi)殺菌劑產(chǎn)生的抗藥性及其致病機(jī)理的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株和香蕉品種 香蕉枯萎病菌4號(hào)生理小種（F. oxysporum f. sp. cubense race 4，F(xiàn)oc4），由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所熱帶果樹(shù)病害課題組鑒定保存。試驗(yàn)接種用香蕉品種為巴西蕉（Cavendish，AAA）（5～7片葉）。

1.1.2 供試藥劑 使用前將98%多菌靈原藥（湖北康寶泰精細(xì)化工有限公司）溶解于0.1 mol/mL鹽酸中，配成10 mg/mL的母液，然后用無(wú)菌水將母液稀釋配成1 mg/mL工作液。

Congo Red（剛果紅，CR）購(gòu)于北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；Calcofluor White Stain（熒光增白劑，CFW）購(gòu)于北京的sigma-aldrich。

1.2 方法

1.2.1 Foc4野生型菌株對(duì)多菌靈的敏感性測(cè)定 參照曾凡松等[13]的方法對(duì)供試菌株進(jìn)行多菌靈敏感性測(cè)定。將Foc4野生型菌株的菌餅接種到0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 μg/mL 7個(gè)處理終濃度的多菌靈PDA平板中。28 ℃下培養(yǎng) 7 d，每個(gè)處理重復(fù)3皿，試驗(yàn)重復(fù) 3次。最終計(jì)算抑制中濃度EC50。

1.2.2 香蕉枯萎病菌基因組DNA的制備 將野生菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d，收集新鮮菌絲，液氮速凍?；蚪MDNA提取按照Biomiga Fungal gDNA Kits（Biomiga）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.3 β1-微管蛋白基因克隆與分析 根據(jù)已完成測(cè)序的香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)生理小種菌株54006的β1-微管蛋白基因（β1-tub）核酸序列（GenBank登錄號(hào)：JH658279.1），在ORF兩端設(shè)計(jì)基因特異性引物對(duì)：TUBU1-2F（5′-AATAGCCTGGAAGGAACCGC-3′）/ TUBU1-2R（5′-ATGTCAAGTCCCTGCTCGCA -3′）。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在PTC200 PCR儀（MJ RESEARCH）上進(jìn)行。PCR反應(yīng)總體積25 μL，其中10× PCR 緩沖液 （Mg2+ Plus） 2.5 μL，dNTPs混合物（2.5 mmol/L）2 μL，引物對(duì)各0.5 μL（20 μmol/L），0.2 μL Taq酶（5 U/μL），DNA 模板100 ng，無(wú)菌超純水補(bǔ)足至25 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，10 ℃保存。

PCR產(chǎn)物經(jīng)回收后連接到T-Vector pMD19（Simple）載體上，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α，將獲得的陽(yáng)性克隆送至英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測(cè)序。將測(cè)得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性分析，通過(guò)BLAST搜索分析β1-微管蛋白基因的同源性，用Clustal X （2.0）軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，采用MEGA 6.0軟件以鄰近相接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.4 β1-tub基因敲除重組片段擴(kuò)增 根據(jù)Foc4基因組DNA測(cè)序序列，采用Split-marker重組技術(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得β1-tub基因敲除重組片段。設(shè)計(jì)引物FOC4TUB-LBCK和FOC4TUB-HPH-LB-R、FOC4TUB-HPH-RB-F和FOC4TUB-RBCK擴(kuò)增β1-tub基因上下游片段；設(shè)計(jì)引物HYG-F和HYG-R擴(kuò)增潮霉素（HYG）基因片段；重組PCR用引物FOC4TUB-LB-F和HYG-R1、HYG-F1和FOC4TUB-HPH-RB-F來(lái)擴(kuò)增上下游片段，所有引物序列見(jiàn)表1。

1.2.5 原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化 Foc4野生型菌株原生質(zhì)體制備參照王飛燕等[14]的方法。PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化參照徐齊君等[15]的方法，略作修改。分別取50 μL的上下游重組片段，緩慢加入到300 μL原生質(zhì)體中，輕輕混勻，室溫放置20 min；緩慢滴加1.5～2 mL PTC溶液，室溫放置20 min；將上述反應(yīng)液加入到再生培養(yǎng)基（含有100 μg/mL氨芐青霉素和50 μg/mL潮霉素B）中，混勻后，倒于培養(yǎng)皿上；于 28 ℃培養(yǎng) 3～7 d后獲得轉(zhuǎn)化子，并連續(xù)培養(yǎng)3代獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子。

1.2.6 β1-tub敲除突變體鑒定 采用CTAB法[16]提取Foc4與抗性轉(zhuǎn)化子的基因組DNA，根據(jù)β1-tub基因上游片段和潮霉素基因序列設(shè)計(jì)引物FOC4TUB-LBCK和HPT-RBCK（表1），根據(jù)潮霉素基因序列和β1-tub基因下游片段設(shè)計(jì)引物HPT-LBCK和FOC4TUB-RBCK（表1），根據(jù)β1-tub基因全長(zhǎng)設(shè)計(jì)內(nèi)源特異引物TUB1-CKFP和TUB1-CKRP，根據(jù)潮霉素全長(zhǎng)片段設(shè)計(jì)特異引物HYG-F和HYG-R（表1），利用這4對(duì)引物對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR鑒定，引物TUB1-CKFP/TUB1-CKRP無(wú)擴(kuò)增條帶，而引物FOC4TUB-LBCK/HPT-LBCK、HPT-RBCK/FOC4TUB-RBCK和HYG-F/HYG-R可擴(kuò)出目的片段的轉(zhuǎn)化子為陽(yáng)性β1-tub基因敲除突變體。

提取Foc4野生型菌株和β1-tub基因敲除突變體菌株的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以Foc4野生型菌株的cDNA模版為對(duì)照，引物actin-F/actin-R為內(nèi)參，引物QRT-TUB1-F/QRT-TUB1-R為β1-tub特異引物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證敲除突變體。

1.2.7 β1-tub敲除突變體對(duì)多菌靈的敏感性測(cè)定 將β1-tub敲除突變體接種到含有不同濃度多菌靈的PDA平板中，方法同1.2.1，其中Foc4作為對(duì)照，并計(jì)算β1-tub敲除突變體的抑制中濃度EC50值。

1.2.8 β1-tub敲除突變體生長(zhǎng)特性分析 生長(zhǎng)形態(tài)和生長(zhǎng)速率測(cè)定：將Foc4和β1-tub敲除突變體的5 mm 新鮮菌餅接種到PDA平板上，于28 ℃培養(yǎng)，分別在接種后2、4、6、7 d 觀(guān)察拍照，并于每天測(cè)量菌落直徑，每次設(shè)3個(gè)重復(fù)。

產(chǎn)孢量分析：分別從長(zhǎng)有β1-tub敲除突變體和Foc4（均培養(yǎng)了7 d）的 PDA平板上打7 mm的菌餅3個(gè)，加入無(wú)菌水后震蕩打碎，然后采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，每次設(shè)3個(gè)重復(fù)。

菌絲顯微觀(guān)察：分別從長(zhǎng)有β1-tub敲除突變體和Foc4（均培養(yǎng)了7 d）的PDA平板上取少量菌絲到載玻片上，制片后進(jìn)行顯微觀(guān)察。

1.2.9 β1-tub敲除突變體對(duì)脅迫因子的敏感性分析 Foc4和敲除突變體菌株在PDA平板活化7 d，打取7 mm的菌餅分別接種于含有Congo Red（終濃度100 μg/mL）、Calcofluor White Stain（終濃度100 μg/mL）、NaCl（終濃度0.7 mol/L）、H2O2（終濃度4 mmd.L-1）的minimal medium（MM）平板上，以未處理的MM平板作為對(duì)照，28 ℃培養(yǎng)7 d后觀(guān)察并拍照記錄，計(jì)算抑菌率，每次設(shè)3個(gè)重復(fù)。抑制率=（對(duì)照組菌落直徑-試驗(yàn)組菌落直徑）/對(duì)照組菌落直徑×100%。

1.2.10 β1-tub敲除突變體致病性測(cè)定分析 分別將Foc4野生型菌株和敲除突變體接種于100 mL的PDB培養(yǎng)液中，置于28 ℃、160 r/min的搖床中恒溫震蕩培養(yǎng)3 d，過(guò)濾收集分生孢子，用無(wú)菌水重懸分生孢子，懸浮液至106個(gè)孢子/mL。采用盆栽傷根淋灌法測(cè)定菌株的致病性。Foc4與敲除突變體均處理15株巴西蕉苗，每株苗澆20 mL孢子懸浮液，以無(wú)菌水作為對(duì)照，設(shè)3次重復(fù)。按照常規(guī)方法栽培管理，30 d后縱向切開(kāi)巴西蕉球莖，觀(guān)察球莖褐變程度及外部葉片黃化情況，參考Mohamed等[17]的病情調(diào)查分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，記錄每株蕉苗的發(fā)病級(jí)別并進(jìn)行病情指數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生菌株對(duì)多菌靈敏感性測(cè)定

由圖1可知，生長(zhǎng)7 d后，F(xiàn)oc4野生型菌株對(duì)多菌靈表現(xiàn)為敏感，其中EC50=0.51 μg/mL。

2.2 β1-tub基因的序列分析和同源性比較

Foc4的β-微管蛋白基因全長(zhǎng)1 670 bp，GenBank登陸號(hào)為MF668108。該基因序列包含4個(gè)內(nèi)含子和5個(gè)外顯子，編碼1個(gè)由446個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白。

經(jīng)BLAST分析和Clustal X比對(duì)，F(xiàn)oc4中β1-tub基因的氨基酸序列，與輪枝樣鐮刀菌（F. verticillioides，XP_018748359.1）、尖孢鐮刀菌番茄專(zhuān)化型（F. oxysporum f. sp. lycopersici，XP_018241948.1）、禾谷鐮刀菌（F. graminearum，AAP68979.1）等幾種常見(jiàn)植物病原真菌的β1-tub氨基酸序列高度同源（圖2）。

2.3 β1-tub基因敲除重組片段擴(kuò)增與突變體獲得

采用Split-marker重組技術(shù)原理進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖3-A），擴(kuò)增目的條帶如圖3-B所示，第一輪PCR擴(kuò)增的上下游片段，大小約為1 938、1 858 bp，同時(shí)擴(kuò)增出潮霉素（HYG）基因片段，大小約為1 376 bp；第二輪PCR擴(kuò)增出用于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的上下游重組片段，大小約為2 419、2 136 bp。

2.4 β1-tub敲除突變體的鑒定

2.4.1 β1-tub敲除突變體PCR驗(yàn)證 經(jīng)過(guò)再生培養(yǎng)和潮霉素抗性篩選，共獲得20個(gè)轉(zhuǎn)化子。分別提取Foc4和轉(zhuǎn)化子的基因組DNA，以其為模版，用引物FOC4TUB-LBCK/HPT-LBCK、HPT-RBCK/FOC4TUB-RBCK、HYG-F/HYG-R和TUB1-CKFP/TUB1-CKRP進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將20個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行初步檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有9個(gè)為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，以其中3個(gè)轉(zhuǎn)化子的基因組DNA為模版，用引物FOC4TUB-LBCK/HPT-LBCK和HPT-RBCK/FOC4TUB-RBCK進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別擴(kuò)增出約2.3、2 kb的2個(gè)條帶，與預(yù)計(jì)大小一致，以Foc4基因組DNA為模版擴(kuò)增作為對(duì)照（圖4-A）。用引物HYG-F/HYG-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得約1.4 kb的條帶，與預(yù)計(jì)大小一致，以Foc4為對(duì)照（圖4-B）。用引物TUB1-CKFP/TUB1-CKRP進(jìn)行PCR擴(kuò)增，無(wú)擴(kuò)增條帶，以Foc4基因組DNA為模版擴(kuò)增得到約0.7 kb的條帶（圖3-C），與預(yù)計(jì)大小一致。這些結(jié)果表明這3個(gè)轉(zhuǎn)化子的β1-tub基因已被敲除，故將其分別命名為Δβ1-tub-1、Δβ1-tub-2和Δβ1-tub-3。選取Δβ1-tub-1敲除突變體作為研究對(duì)象進(jìn)行以下研究。

2.4.2 β1-tub敲除突變體QPCR驗(yàn)證 將Foc4野生型菌株、Δβ1-tub-1、Δβ1-tub-2和Δβ1-tub-3敲除轉(zhuǎn)化子進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證。由圖5可知，β1-tub敲除突變體不再表達(dá)β1-tub基因，說(shuō)明這3個(gè)轉(zhuǎn)化子的β1-tub基因已被敲除。

誤差線(xiàn)代表3次生物學(xué)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差，不同小寫(xiě)字母代表在p<0.05水平下差異顯著。下同。

The error line represents the standard error of three biological repetitions， and different small letters represents a significant difference when p<0.05. The same as below.

2.5 β1-tub敲除突變體對(duì)多菌靈敏感性測(cè)定

將Foc4野生型菌株和Δβ1-tub菌株分別接種到含有不同濃度多菌靈的PDA平板中，生長(zhǎng)7 d后，測(cè)定Δβ1-tub菌株對(duì)多菌靈的敏感性。結(jié)果表明，Δβ1-tub對(duì)多菌靈的敏感性（EC50=0.53 μg/mL）與Foc4野生型菌株對(duì)多菌靈的敏感性（EC50=0.51 μg/mL）無(wú)明顯差異（圖6），說(shuō)明β1-微管蛋白敲除突變體對(duì)多菌靈的抗性無(wú)明顯變化。

2.6 β1-tub基因敲除突變體的生長(zhǎng)特性分析

2.6.1 β1-tub基因敲除突變體的生長(zhǎng)速度和產(chǎn)孢量分析 將Δβ1-tub和Foc4野生型菌株分別接種于PDA平板上并培養(yǎng)7 d，每天測(cè)量菌落直徑。結(jié)果表明，生長(zhǎng)7 d后，F(xiàn)oc4野生型菌株菌落已長(zhǎng)滿(mǎn)整個(gè)平板，而Δβ1-tub菌落生長(zhǎng)緩慢，菌落直徑約為Foc4菌落的1/5（圖 7-A、B）。計(jì)算平板菌落生長(zhǎng)的孢子產(chǎn)量，F(xiàn)oc4的孢子產(chǎn)量約為0.937×106/mm2，Δβ1-tub的孢子產(chǎn)量約為2.704×106/mm2（圖7-C），表明Δβ1-tub的產(chǎn)孢量增加。通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀(guān)察Foc4和Δβ1-tub的菌絲，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Δβ1-tub的菌絲生長(zhǎng)出現(xiàn)畸形（圖7-D、E）。

2.6.2 β1-tub基因敲除突變體對(duì)脅迫因子的敏感性分析 在含有100 μg/mL CR（Congo Red）和100 μg/mL CFW（Calcofluor White）條件下，F(xiàn)oc4野生型菌株和Δβ1-tub突變體菌株的生長(zhǎng)均受到不同程度的抑制，其中，F(xiàn)oc4較Δβ1-tub抑制程度更明顯；在含0.7 mol/L NaCl的培養(yǎng)基上，F(xiàn)oc4和Δβ1-tub均表現(xiàn)出一致的長(zhǎng)勢(shì)，生長(zhǎng)沒(méi)有受到抑制；在含4 mmol/L H2O2 的培養(yǎng)基中，F(xiàn)oc4和Δβ1-tub的生長(zhǎng)均受到不同程度的抑制，F(xiàn)oc4較Δβ1-tub抑制程度更明顯（圖8）。上述結(jié)果表明，β1-tub敲除突變體對(duì)細(xì)胞壁選擇性壓力、氧化壓力和滲透壓均不敏感。

2.7 β1-tub基因敲除突變體的致病性

將Foc4和β1-tub基因敲除突變體菌株Δβ1-tub分別接種巴西蕉（Cavendish，AAA）幼苗。30 d后觀(guān)察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種野生菌株的巴西蕉苗葉片出現(xiàn)黃化枯萎現(xiàn)象，植株下部葉片大部分褪綠、變黃，且切開(kāi)球莖觀(guān)察到球莖部位褐化嚴(yán)重，病害嚴(yán)重度達(dá)到3～4級(jí)；而接種Δβ1-tub菌株的巴西蕉苗與接種H2O的對(duì)照巴西蕉苗均未出現(xiàn)葉片黃化現(xiàn)象，且球莖無(wú)褐化現(xiàn)象（圖9-A）。根據(jù)病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，接種Δβ1-tub菌株的巴西蕉苗平均病情指數(shù)（12.50）顯著低于Foc4接種的平均病情指數(shù)（52.92）（圖9-B）。這表明β1-tub基因在Foc4的致病性方面起著重要作用。

3 討論

在真核生物中，微管由微管蛋白（tubulin）和微觀(guān)輔助蛋白（MAPs）兩大類(lèi)蛋白組成，作為細(xì)胞骨架的重要組分而普遍存在。微管是由α和β-微管蛋白以異二聚體形式組裝而成，α-微管蛋白和β-微管蛋白在真核蛋白中具有高度保守性，參與細(xì)胞形態(tài)、維持有絲分裂和其它各種形態(tài)事件的發(fā)生[18]。而β-微管蛋白是微管結(jié)構(gòu)最主要的成分之一，同時(shí)也是多菌靈等苯并咪唑類(lèi)殺菌劑的作用靶標(biāo)[19]。

真菌基因組僅有一個(gè)或2個(gè)β-微管蛋白基

因[20]。在禾谷鐮刀菌中，2個(gè)β-微管蛋白基因得到鑒定[21]。β-微管蛋白作為多菌靈等苯并咪唑類(lèi)殺菌劑的作用靶標(biāo)，大多數(shù)病原真菌對(duì)苯并咪唑類(lèi)藥劑的抗性與β-微管蛋白的變化有關(guān)。其中，灰葡萄孢菌對(duì)苯并咪唑類(lèi)藥劑的抗性是由于β1-微管蛋白的變化引起，而禾谷鐮刀菌不是由于β1-微管蛋白的變化引起抗藥性[22]。在香蕉枯萎病菌中，本研究克隆并鑒定了其β1-微管蛋白基因，其氨基酸序列高度保守，并與其它常見(jiàn)植物病原真菌的β1-微管蛋白基因的氨基酸高度同源。本研究利用同源重組原理獲得了β1-微管蛋白基因的敲除突變體，與野生菌株相比，敲除突變體對(duì)多菌靈敏感性稍有下降，其EC50值與野生型菌株無(wú)顯著差異，說(shuō)明β1-微管蛋白基因敲除突變體不具有對(duì)多菌靈的抗性，這與于俊杰[23]研究小麥赤霉病中β1-微管蛋白基因敲除突變體對(duì)多菌靈的敏感性結(jié)果一致，推測(cè)在香蕉枯萎病菌中還可能存在其它微管蛋白的作用，并不是由于β1-微管蛋白的變化而引起的抗藥性。

本研究中，β1-微管蛋白基因缺失突變體的生物學(xué)表型與野生菌差別顯著，突變體表現(xiàn)為生長(zhǎng)緩慢、菌絲畸形及產(chǎn)孢量增加，這與畢朝位[24]在研究禾谷鐮刀菌β1-微管蛋白基因敲除突變體的生物學(xué)表型與野生菌差異不顯著的研究結(jié)果存在差異。同時(shí)，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)β1-微管蛋白基因的缺失造成香蕉枯萎病菌的致病力減弱，與仇劍波[25]研究禾谷鐮刀菌β1-微管蛋白基因敲除突變體在花期小麥穗子上的致病力降低是一致的。綜上所述，雖然β1-微管蛋白基因在進(jìn)化過(guò)程中存在高度保守性，但不同植物病原菌的β1-微管蛋白具有不同的功能。β1-微管蛋白基因的敲除導(dǎo)致香蕉枯萎病菌生長(zhǎng)緩慢，產(chǎn)孢增加，不能正常侵染寄主，推測(cè)β1-微管蛋白基因在香蕉枯萎病菌的生長(zhǎng)發(fā)育及致病力等方面發(fā)揮著重要功能，但對(duì)香蕉枯萎病菌致病性的具體調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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