董晨 魏永贊 王弋 鄭雪文 李偉才

摘 要 生長素反應(yīng)因子（ARF）是一類可以結(jié)合在生長素應(yīng)答基因啟動子部位的轉(zhuǎn)錄因子，在植物的生長發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用。為了研究荔枝ARF基因在不同花穗處理方式的表達(dá)情況，進(jìn)而挖掘花穗發(fā)育過程中起主要作用的ARF關(guān)鍵基因，本研究利用課題前期基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫鑒定出的LcARF基因家族，通過對妃子笑荔枝花穗分別進(jìn)行疏花和噴施烯效唑處理，利用熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)進(jìn)一步研究LcARF基因家族在不同處理下的表達(dá)情況。結(jié)果表明：21 個荔枝ARF基因在疏花和烯效唑處理花穗發(fā)育過程中有明顯不同的表達(dá)規(guī)律，且不同基因表達(dá)量有較大差異。因此推測，ARF家族成員在花穗發(fā)育過程中特定階段起一定的作用，同時本研究也為深入探究ARF基因家族的功能奠定理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 荔枝；ARF；qRT-PCR；基因表達(dá)

中圖分類號 S667.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Expression Analysis of Auxin Response Factor （ARF） Gene Family in Litchi chinesis Sonn.

DONG Chen， WEI Yongzan， WANG Yi， ZHENG Xuewen， LI Weicai*

Institute of South Subtropical Corp Research， Chinese Academy of Tropical Agricultural Science/ Key Laboratory of Tropical Fruit Biology， Ministry of Agriculture， Zhanjiang， Guangdong 524091， China

Abstract Auxin response factors （ARFs） are important transcription factors bound to the promoter site of the auxin response gene and play a crucial role in plant growth and development. The article was aimed to study the expression of litchi ARF in different treatment spikes， and to excavate important ARF genes. The study was based on the LcARF data identified by the transcriptome database. After the spakes of Feizixiao thinned and sprayed of uniconazole， the expression of ARF gene family under different treatments was studied by fluorescence quantitative PCR （qRT-PCR） technique. The results showed that the expression including expression level of ARF gene of 21 Litchi were significantly different in the process of spikes thinning and uniconazole treatment. Therefore， it is speculated that ARF gene family members play a certain role in the specific stage of flower spike development， and this study also laid a solid foundation for further exploration of the function of ARF gene family.

Key words litchi； ARF； qRT-PCR； gene expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.06.013

“妃子笑”荔枝植株營養(yǎng)生長旺盛，易成花，具有花穗長、花量大、花期長的特點(diǎn)，因大量營養(yǎng)消耗而導(dǎo)致坐果少，甚至出現(xiàn)有花無果的問題[1]。在生產(chǎn)上，常用機(jī)械短截疏花和化學(xué)調(diào)控技術(shù)來調(diào)控荔枝的坐果率。在花穗生長期對長的荔枝花穗進(jìn)行短截，可明顯地減少花量，增加雌花比例，提高花質(zhì)和坐果率。烯效唑（Uniconazole）是一種新型植物生長延緩劑，具有高效低毒的特點(diǎn)，其作用機(jī)制是通過阻礙赤霉素（GA3）生物合成過程中貝殼杉烯到貝殼杉烯酸的氧化脫甲基化反應(yīng)，使貝殼杉烯酸難以合成，導(dǎo)致赤霉素合成受阻，因而具有強(qiáng)烈的植物生長抑制活性。合適濃度的烯效唑和乙烯利處理‘妃子笑荔枝可明顯抑制枝梢的生長，提高枝梢成花的比例、坐果率及雌雄花比率[2]。此外，在冬季荔枝成花誘導(dǎo)期噴施烯效唑可明顯提高荔枝葉片的光合能力[3]。

植物激素在植物生長發(fā)育的各方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，如側(cè)根發(fā)育、頂端優(yōu)勢、胚胎形成和微管分化、開花坐果、果實成熟等[4]。生長素反應(yīng)因子（ARFs）作為生長素信號通路中的重要轉(zhuǎn)錄因子，通過特異地與生長素響應(yīng)基因啟動子區(qū)域的生長素響應(yīng)元件（AuxREs）TGTCNC結(jié)合，激活或抑制基因的表達(dá)[5]。ARF在植物體中以基因家族的形式存在，目前隨著測序技術(shù)的飛速發(fā)展，越來越多的植物物種中的ARF基因家族在基因組學(xué)水平上得以鑒定，如擬南芥、水稻、玉米、谷子、大豆、番茄、黃瓜、菜心、香蕉、葡萄、甜橙、蘋果、荔枝、甘藍(lán)、大麥、毛竹等[6-21]。辣椒ARF基因家族各成員在不同發(fā)育時期不同組織中的表達(dá)量不同，具有一定的特異性，同時高鹽脅迫可明顯激活或抑制ARF基因家族的表達(dá)[22]。ARF在毛竹花器官中的差異表達(dá)模式分析表明，PheARF13、PheARF14和PheARF35在花芽、雌蕊和幼胚中高量表達(dá)，同時PheARF2、PheARF30、PheARF14、PheARF13、PheARF35、PheARF7、PheARF37、PheARF38在雌蕊和幼胚中高量表達(dá)，推測上述基因可能在花發(fā)育和種子發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用[23]。楊樹不同組織中ARF基因的表達(dá)與生長素相關(guān)性研究表明，生長素含量、ARF上調(diào)基因數(shù)目與基因表達(dá)信號量兩兩之間在夏秋季節(jié)中表現(xiàn)為高度相關(guān)，冬季對生長素響應(yīng)因子信號量的影響最大[24]。本課題組前期基于轉(zhuǎn)錄組對荔枝ARF基因家族21個成員進(jìn)行了鑒定及生物信息學(xué)分析[18]，鑒于此，本研究對‘妃子笑荔枝的花穗進(jìn)行不同處理，通過qRT-PCR技術(shù)初步探索不同處理花穗發(fā)育過程中LcARF基因家族的表達(dá)變化規(guī)律，為深入了解ARF基因的功能及花穗發(fā)育過程中調(diào)控生長素的作用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗在廣東省湛江市湖秀新村南亞熱帶作物研究所荔枝栽培示范園進(jìn)行，供試品種為‘妃子笑荔枝。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 選擇樹齡相同、長勢相近的植株作為試驗樹。隨機(jī)選擇樹冠大小和長勢相似的‘妃子笑荔枝樹9株，當(dāng)花穗長度抽生至約18 cm時，進(jìn)行如下3個處理和操作：（1）對照（CK），不做任何處理；（2）疏花（SH）處理，把花穗一次性短截至15 cm處；（3）烯效唑（Un）處理，用烯效唑（品牌：四川國光，有效成分含量5%）50 mg/L噴施，噴至葉面滴水；完全隨機(jī)區(qū)組排列，單株小區(qū)，3次重復(fù)。定期觀察，分別取對照及不同處理后0、7、14、28、42 d的花穗，液氮速凍后存放于-80 ℃冰箱中備用，用于RNA提取。

1.2.2 荔枝ARF基因家族熒光定量表達(dá)分析 荔枝總RNA提取采用植物RNA提取試劑盒（華越洋生物科技有限公司）。提取后的RNA樣品取1 ?L檢測RNA質(zhì)量和濃度，然后利用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（TaKaRa ）合成cDNA第一鏈。選用本課題組篩選的LcActin為內(nèi)參，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組中注釋的LcARF的核苷酸序列，利用在線軟件Primer3plus設(shè)計熒光定量引物，通過blast分析引物的特異性，引物序列見表1，引物序列委托廣州艾基生物技術(shù)有限公司合成。定量PCR分析采用SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa）試劑盒，Roche 480 II定量PCR系統(tǒng)（瑞士），采用384孔板，qRT-PCR反應(yīng)體系為10 ?L，其中cDNA 1 ?L（相當(dāng)于25 ng總RNA），2 ?L基因特異性引物（10 ?mol/L），5 ?L 2×SYBR Premix ExTaq，用ddH2O補(bǔ)足10 ?L。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性15 s，58 ℃火退30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。每個樣品進(jìn)行3次重復(fù)。采用2-ΔΔCT法計算目標(biāo)基因相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 對照處理ARF基因的表達(dá)情況分析

對照LcARF基因家族在花穗發(fā)育不同時期的表達(dá)情況見圖1，結(jié)果顯示，LcARF基因在花穗不同發(fā)育階段均有表達(dá)，但存在表達(dá)豐度的差異；另外不同的LcARF基因成員間表達(dá)量及趨勢也存在差異。將21個LcARF表達(dá)量通過熱圖聚類分析發(fā)現(xiàn)，LcARF變化趨勢大致可分為3類，LcARF1/2/8/3/5/10/4聚在一起，LcARF6/7/13/11/12/21/19聚在一起，LcARFLcARFLcARF9/18/14/15/16/20/17聚在一起（圖2）。與0 d相比，7 d時，有15個LcARF基因家族成員表達(dá)上調(diào)，除LcARF15表達(dá)量是0 d的2倍以上，其他差異不顯著。14 d時，表達(dá)上調(diào)的基因有LcARF6、LcARF7、LcARF10，其表達(dá)量為0 d的2倍以上。LcARF6、LcARF7、LcARF11、LcARF13的表達(dá)量在28 d時達(dá)到峰值，推測這些基因在該時期發(fā)揮著重要的作用。42 d時，有18個LcARF基因表達(dá)下調(diào)，占總數(shù)的86%。

2.2 疏花處理ARF基因的表達(dá)情況分析

疏花處理花穗不同發(fā)育時期LcARF基因表達(dá)情況見圖3，結(jié)果顯示，疏花處理花穗不同發(fā)育階段LcARF均有表達(dá)，但表達(dá)變化差異不大。通過對表達(dá)量進(jìn)行熱圖聚類分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)表達(dá)大致聚為3類（圖4）。與疏花處理0 d相比，疏花處理7 d時，有16個LcARF基因家族成員表達(dá)上調(diào)，其中LcARF15的表達(dá)量差異在2倍以上，有7個LcARF表達(dá)下調(diào)，但下調(diào)幅度不大。疏花處理14 d時，有15個LcARF表達(dá)上調(diào)，其中表達(dá)量差異在2倍的分別為LcARF6和LcARF7。疏花處理28 d時，約62%的LcARF基因表達(dá)下調(diào)，下調(diào)幅度在2倍以上的有6個，分別為LcARF1/2/4/14/16/18；38%的LcARF基因表達(dá)上調(diào)，上調(diào)幅度在2倍以上的有1個，為LcARF7。疏花處理42 d時，有19個LcARF表達(dá)下調(diào)，占總數(shù)的91%，只有2個LcARF表達(dá)上調(diào)，且上調(diào)幅度不大。

2.3 烯效唑處理ARF基因的表達(dá)情況分析

烯效唑處理花穗不同發(fā)育階段LcARF基因的表達(dá)分析見圖5，表達(dá)聚類關(guān)系見圖6。結(jié)果顯示，與處理0 d相比，烯效唑處理7 d時，有77%的LcARF表達(dá)上調(diào)，其中上調(diào)幅度2倍以上的有2個，分別為LcARF12和LcARF15；下調(diào)的有5個，分別為LcARF4/5/6/7/19，占總數(shù)的23%。烯效唑處理14 d時，表達(dá)量的變化差異不大，17個LcARF顯示表達(dá)上調(diào)，4個LcARF顯示表達(dá)下調(diào)，但幅度均沒有超過2倍。烯效唑處理28 d時，有12個LcARF表達(dá)下調(diào)，下調(diào)幅度2倍以上的有3個，分別為LcARF4/14/18；有9個LcARF表達(dá)上調(diào)，其中上調(diào)2倍以上的有1個，為LcARF17。烯效唑處理42 d時，有7個LcARF表達(dá)上調(diào)，分別為LcARF3/6/7/13/17/19/21，其中LcARF6/7/19上調(diào)幅度超過2倍；LcARF表達(dá)下調(diào)的有14個，其中LcARF14下調(diào)幅度最大。

3 討論

荔枝花穗生長發(fā)育與植物內(nèi)源激素關(guān)系密切，生長素作為最早發(fā)現(xiàn)的植物激素，其生理作用廣泛，不僅影響細(xì)胞的分裂、伸長和分化，同時也影響營養(yǎng)器官和生殖器官的生長、成熟和衰老[25]。生

長素響應(yīng)因子（ARF）是植物調(diào)控生長素響應(yīng)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，在生長素的信號傳導(dǎo)過程中處于中心位置，它可與生長素響應(yīng)元件特異結(jié)合，促進(jìn)或抑制基因的表達(dá)[4]。植物生長發(fā)育過程的各個方面（包括根、莖、花、果的發(fā)育）都受ARF的影響。

本研究通過對“妃子笑”荔枝不同處理花穗發(fā)育過程中LcARF基因家族的表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果表明，LcARF基因家族各成員間表達(dá)模式存在多樣性，且相對表達(dá)量也存在差異，與前人對黃瓜和辣椒中ARF基因家族研究的結(jié)果一致[12-22]。大部分LcARF基因在荔枝花穗發(fā)育中表達(dá)量較低，只有部分LcARF基因表達(dá)量相對較高，如對照中的LcARF6/7/11/13，推測這些基因在荔枝花穗發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用，這與大麥幼穗中ARF基因家族表達(dá)相似，均為低表達(dá)模式[20]。不同處理方式的花穗發(fā)育不同時期LcARF基因家族表達(dá)存在差異，推測LcARF基因家族不同成員間分別在不同的花穗發(fā)育時期發(fā)揮功能。另外不同處理后的花穗同一時期表達(dá)也存在差異，如LcARF1/2/4/5/6/7/8/10/11/13/15/16/17在疏花處理和烯效唑處理后花穗14 d的表達(dá)低于對照。LcARF1/2/4/5/8/9/10/15/16/17/18/20在不同處理后28 d表達(dá)較對照明顯升高，烯效唑處理較疏花處理LcARF表達(dá)上調(diào)幅度要高；LcARF6/7/11/13/21在不同處理后28 d的表達(dá)明顯下降，其中烯效唑處理較疏花處理LcARF表達(dá)量要低；LcARF1/2/6/7/8/9/12/13/14/15/16/18/19/20/21在烯效唑處理后42 d的表達(dá)量要高于對照，這與魏永贊等[26]研究荔枝花期發(fā)育過程內(nèi)源生長素含量在烯效唑處理后42 d的結(jié)果相符。根據(jù)以上結(jié)果推測，處理后LcARF基因表達(dá)上調(diào)或下調(diào)對生長素的合成造成促進(jìn)或抑制的作用，進(jìn)而影響花穗的發(fā)育。

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