李鴻鵬 鐘昌開(kāi) 吳秋玉 張艷杰 張賀

摘? 要? 果膠裂解酶是炭疽菌在侵染寄主過(guò)程中降解寄主細(xì)胞壁的一類重要水解酶。本研究在杧果炭疽病菌中克隆獲得了3個(gè)果膠裂解酶基因Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3，DNA全長(zhǎng)分別為1 037、1 498、1 089 bp，cDNA全長(zhǎng)分別為975、1 380、978 bp，分別編碼324、459、325個(gè)氨基酸，均含1個(gè)果膠裂解酶保守結(jié)構(gòu)域，均有典型的信號(hào)肽，不存在跨膜結(jié)構(gòu)。其二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋分別占16.05%、20.26%、16.92%，延伸鏈分別占28.09%、21.79%、29.54%，β-轉(zhuǎn)角分別占5.86%、8.93%、7.38%，無(wú)規(guī)則卷曲分別占50.00%、49.02%、46.15%。Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3的氨基酸序列分別與C.tofieldiae（KZL77240.1）、草莓炭疽菌（C. gloeosporioides）（XP-007274932.1）、C.incanum（KZL84476.1）果膠裂解酶序列相似度在93%以上。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，3個(gè)果膠裂解酶基因在整個(gè)侵染過(guò)程中均持續(xù)高效表達(dá)，但在漆酶基因Lac1敲除突變體中，表達(dá)均下降約90%。可見(jiàn)Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3是果膠裂解酶基因家族成員，序列差異較大，在侵染過(guò)程中起著重要的作用，且其表達(dá)受漆酶基因Lac1影響。

關(guān)鍵詞? 杧果;膠孢炭疽菌;果膠裂解酶基因;漆酶基因Lac1中圖分類號(hào)? S432.1 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2018.12.019

杧果（Mangifera indicaL.）是重要的熱帶、亞熱帶果樹(shù)，享有“熱帶果王”的盛譽(yù)，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值^[1]。杧果炭疽病是杧果生產(chǎn)上發(fā)生最普遍、為害最嚴(yán)重的一種病害，在世界杧果種植區(qū)內(nèi)廣泛發(fā)生，也是貯藏期的重要病害之一，發(fā)病重的果園減產(chǎn)達(dá)60%～70%，膠孢炭疽菌[Colle?totrichum gloeosporioides（Penz.）Sacc.]是其主要致病菌^[2-3]。該病原菌寄主范圍十分廣泛，大多數(shù)熱帶亞熱帶果樹(shù)是其重要寄主，還可侵染蔬菜、花卉、中草藥及各種經(jīng)濟(jì)作物^[4]。

炭疽菌主要靠黑色素化附著胞直接侵入寄主，再分泌大量細(xì)胞壁降解酶擴(kuò)展^[5]。DHN黑色素在植物病原真菌中普遍存在，它在附著胞膨壓產(chǎn)生上起著關(guān)鍵的作用，其合成途徑中有多個(gè)關(guān)鍵的酶基因，其中漆酶是催化最后一步黑色素合成的酶^[6]。在杧果炭疽病菌中，漆酶Lac1在菌絲的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、黑色素的沉著、產(chǎn)孢和漆酶的分泌以及對(duì)寄主的致病力等方面起著重要的調(diào)控作用^[7]。

果膠酶是細(xì)胞壁降解酶中的一類，也是分解果膠質(zhì)的酶總稱，按其作用方式和底物類型可分為原果膠酶、果膠酯酶、裂解酶、多聚半乳糖醛酸酶^[8]。許多病原真菌、細(xì)菌在侵染植物的過(guò)程中都可以產(chǎn)生果膠裂解酶（pel），裂解高度酯化的果膠，破壞植物組織的完整性，使薄壁細(xì)胞組織軟化^[9-10]，從而達(dá)到降解植物細(xì)胞壁的效果。Erwinia chrysanthemi strain 3937有5個(gè)Pel基因PLa～PLe，其中只有PLa、PLd和PLe對(duì)病原菌的致病力有影響，且PLe比PLa和PLd的作用更強(qiáng)，PLe突變后失去了侵染能力^[11]。辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）的12個(gè)候選果膠裂解酶基因中只有Pcpel1、Pcpel16、Pcpel20能夠明顯影響致病力^[9]?？梢?jiàn)果膠裂解酶基因多以基因家族形式存在，同一病菌中不同的果膠裂解酶基因作用存在明顯差異。將杧果炭疽病菌接種至PD培養(yǎng)液，28 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)12 d的過(guò)程中，均能檢測(cè)到果膠酶活性^[12]。有關(guān)果膠裂解酶基因的分子特征及其在杧果炭疽病菌侵染寄主過(guò)程中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。因此本研究擬利用同源克隆技術(shù)，從杧果炭疽病菌（C. gloeosporioides）中克隆pel，分析其在不同侵染時(shí)段的表達(dá)情況，及與另一個(gè)侵染關(guān)鍵基因漆酶基因Lac1的關(guān)系，為探究果膠裂解酶基因在杧果炭疽病菌致病過(guò)程中的作用、揭示杧果炭疽病菌的致病分子機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 材料和引物杧果炭疽病菌膠孢炭疽菌[C. gloeosporioides（Penz.）Sacc.] A2菌株由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所熱帶果樹(shù)課題組提供。臺(tái)農(nóng)芒嫩葉采自海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院基地。漆酶基因Lac1敲除突變體由本實(shí)驗(yàn)室提供。本研究所用引物如表1所示。

1.1.2? 主要試劑 ?真菌gDNA提取試劑盒和凝膠回收試劑盒購(gòu)于Omaga公司;RNA提取試劑盒和TIANScript cDNA First-Stand Kit購(gòu)于TIANG?ENE公司;E. coli DH5α、10× PCR Buffer、dNTPs、TaqDNA酶、2Taq-Mixture、DNA marker DL2000等均購(gòu)于TaKaRa公司;熒光定量PCR試劑盒2xTransStart^? Tip Green qPCR SuperMix購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)科技有限公司，其他試劑均為常規(guī)試劑。

1.2? 方法

1.2.1Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3基因DNA序列的擴(kuò)增 ?根據(jù)橡膠樹(shù)膠孢炭疽菌HBCg01全基因組信息查找果膠裂解酶基因序列，設(shè)計(jì)引物A2pel1-F1/R1、5A2pel2-F1/R1、3A2pel2-F1/R1、5A2pel3-F1/R1和3A2pel3-F1/R1（表1），用于擴(kuò)增杧果炭疽病菌3個(gè)果膠裂解酶基因DNA序列。PCR體系為50 μL：10× PCR Buffer 5.0 μL，dNTPs 4.0 μL，引物（10 μmol/L）各1.0 μL，模板1.0 μL，TaqDNA酶1.0 μL，ddH₂O 37 μL。PCR程序：94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，Tm 45 s，72 ℃ 2 min，35個(gè)

1.2.2Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3基因cDNA的擴(kuò)增? 以杧果炭疽病菌gRNA反轉(zhuǎn)錄后的總cDNA為模板，用引物對(duì)Rpel1F1/R1、Rpel2F1/R1、Rpel3F1/R1（表1）擴(kuò)增3個(gè)果膠裂解酶基因cDNA序列，其余同1.2.1節(jié)。

1.2.3Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3序列特征分析? 利用DNAssist 1.0軟件比對(duì)分析所獲得的Cgpel1、Cgpel2、Cgpel3基因DNA和cDNA序列，拼接獲得全長(zhǎng)，并找出起始密碼子、終止密碼子、內(nèi)含子、外顯子。用Primer 5.0軟件推測(cè)其編碼的氨基酸序列。用ProtParam軟件分析其理化性質(zhì)，包括分子量、等電點(diǎn)等。用MEGA 4.1軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。用Singal 3.0軟件分析信號(hào)肽位置。用TMHMM軟件分析跨膜區(qū)。用SOPMA軟件分析二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.4Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3在杧果炭疽病菌侵染臺(tái)農(nóng)芒嫩葉過(guò)程中的表達(dá)分析 ?以SR作為內(nèi)參基因，用擴(kuò)增Rpel1、Rpel2和Rpel3的引物（表1）檢測(cè)Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3在杧果炭疽病菌侵染臺(tái)農(nóng)芒嫩葉過(guò)程中的相對(duì)表達(dá)量。參考張賀等^[13]的方法制備濃度為4×10⁶個(gè)/mL的分生孢子懸浮液，用于接種嫩葉。用清水洗凈嫩葉，浸泡于1% NaClO溶液中15 min后，用超純水沖洗3次，置于保鮮盒中，保持RH 100%，用束針刺傷嫩葉后滴加20 ?L孢子懸浮液，28 ℃下恒溫黑暗培養(yǎng)。接種后的取樣時(shí)間點(diǎn)為0、6、12、24、36、48、72 h，以0 h的為對(duì)照。取樣方法：用直徑為1 cm的打孔器取12個(gè)接種點(diǎn)，按照不同的時(shí)間點(diǎn)取樣后至于液氮速凍，-80 ℃保存、備用。每組處理重復(fù)3次。

參照Tiangen RNA Kit中的方法提取不同時(shí)間點(diǎn)的病原菌總RNA，參照TIANScript cDNA First-Stand Kit試劑盒完成第一鏈cDNA的合成，反轉(zhuǎn)錄后的cDNA稀釋10倍，備用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為10 μL：ddH₂O 2 μL，cDNA 1 μL，引物各1 μL，2xTransStart^? Tip Green qPCR SuperMix 5 μL，Rotor-Gene Q型實(shí)時(shí)熒光PCR儀檢測(cè)。數(shù)據(jù)分析運(yùn)用2^–ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀系統(tǒng)導(dǎo)出各樣品的C_t值，以接菌0 h的為對(duì)照。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 30 s;94 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40個(gè)循環(huán);在72 ℃時(shí)收集熒光信號(hào)。

1.2.5Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3基因在漆酶基因Lac1敲除突變體的表達(dá)分析? 提取漆酶基因Lac1敲除突變體和野生型A2總RNA，以在野生型A2中的表達(dá)量為對(duì)照，以SR作為內(nèi)參基因，分析Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3在漆酶基因Lac1敲除突變體中的相對(duì)表達(dá)量。其余參照1.2.4節(jié)。每組處理重復(fù)3次。

2? 結(jié)果與分析

2.1? Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3基因DNA片段的擴(kuò)增