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        橡膠樹中堿性轉(zhuǎn)化酶基因HbNIN8的克隆與表達分析

        2018-05-14 14:44:51陽江華龍翔宇鄒智秦云霞
        熱帶作物學報 2018年12期
        關(guān)鍵詞:橡膠樹葉綠體擬南芥

        陽江華 龍翔宇 鄒智 秦云霞

        摘? 要? 蔗糖是高等植物光合產(chǎn)物的重要存儲方式,而轉(zhuǎn)化酶和蔗糖合酶是水解蔗糖的主要酶。研究基于橡膠樹的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),采用RT-PCR技術(shù)克隆到一個中堿性轉(zhuǎn)化酶基因HbNIN8的全長cDNA。該基因預(yù)測編碼630個氨基酸。同源和亞細胞定位分析表明,HbNIN8屬于α類中堿性轉(zhuǎn)化酶,葉綠體定位。應(yīng)用畢赤酵母真核表達獲得其重組蛋白,分析了其酶活性特點,HbNIN8在畢赤酵母中重組蛋白的最適pH為7.5,最適溫度為45 ℃。實時熒光定量PCR分析表明,HbNIN8主要在葉片中表達,其表達量隨著葉片的成熟而逐漸增加,在穩(wěn)定期葉片中達到最大,在成熟葉片中,HbNIN8的表達呈現(xiàn)明顯的晝夜差異,晚上的表達水平相對高于白天。因此,HbNIN8很可能是負責將葉綠體中的蔗糖水解為單糖,從而調(diào)控橡膠樹葉綠體內(nèi)蔗糖和淀粉的分配。

        關(guān)鍵詞? 巴西橡膠樹;中堿性轉(zhuǎn)化酶;HbNIN8;葉綠體中圖分類號? S794.1 ?????文獻標識碼? A

        DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2018.12.014

        蔗糖是植物光合作用的主要產(chǎn)物,其在植物生長發(fā)育、信號傳導(dǎo)和脅迫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。蔗糖的水解依賴于轉(zhuǎn)化酶和蔗糖合成酶,其中,轉(zhuǎn)化酶根據(jù)最適pH可分為酸性轉(zhuǎn)化酶(acid invertase)和中堿性轉(zhuǎn)化酶(alkaline/neutral invertase,A/N-Inv)[1]。中堿性轉(zhuǎn)化酶的最適pH接近7.0,其廣泛存在于光合細菌和植物中[2]。中堿性轉(zhuǎn)化酶主要位于植物的細胞質(zhì)中,但在線粒體、葉綠體和質(zhì)膜等亞細胞器也有分布,分別起著不同的作用[3]。中堿性轉(zhuǎn)化酶屬于多基因家族,其在擬南芥和水稻中分別含有9個和8個成員[4],可分為兩個亞類,即定位于胞質(zhì)的β類和位于線粒體/葉綠體的α類。研究表明,水稻的OsNIN1和OsNIN3分別位于線粒體和葉綠體上[5],擬南芥的At-A/N-InvA、At-A/N-InvC、At-A/N-InvH定位于線粒體[6-8],而At-A/N-InvE則定位于葉綠體[9]。深入研究發(fā)現(xiàn),α類中堿性轉(zhuǎn)化酶對于植物器官的形成與發(fā)育都是不可或缺的。在擬南芥中,At-A/N-InvA和At-A/N-InvC的單基因缺失突變體生長受到抑制,植株矮小,開花期推遲[6]; AtCINV1AtCINV2的雙突變體cinv1,2表現(xiàn)為嚴重的生長缺陷,植株矮小,根短粗,其根的長度只有野生型的17%[1]。在水稻中,AtCINV1的同源基因OsCYT-INV1的突變體也呈現(xiàn)出類似的表型,其胚根相對于野生型明顯變短,同時還表現(xiàn)出晚花和種子發(fā)芽率低等表型[10-11]。另有報道表明,百脈根的LjINV1缺失后,其根和莖表現(xiàn)出明顯的生長抑制,并且不能形成花粉,表現(xiàn)出不育性狀[12]。追究α類中堿性轉(zhuǎn)化酶的作用機理,發(fā)現(xiàn)葉綠體At-A/N-InvE的缺失,擬南芥葉片的蔗糖濃度沒有明顯變化,但是葉片淀粉的積累顯著減少[9]。因此,α類中堿性轉(zhuǎn)化酶很可能是能將葉綠體中的蔗糖水解為單糖,從而調(diào)控葉綠體內(nèi)蔗糖和淀粉的動態(tài)轉(zhuǎn)化。

        課題組的前期研究表明,橡膠樹含有10個中堿性轉(zhuǎn)化酶基因[13],其中,胞質(zhì)定位的HbNIN2是膠乳中蔗糖降解的關(guān)鍵酶,其活性強弱與橡膠樹膠乳的產(chǎn)量呈明顯的正相關(guān)[14]。然而,目前對橡膠樹細胞器中的中堿性轉(zhuǎn)化酶知之甚少。本研究報道一個在橡膠樹葉片中高表達的中堿性轉(zhuǎn)化酶基因HbNIN8,推測其很可能負責將葉綠體中的蔗糖水解為單糖,從而調(diào)控橡膠樹葉綠體內(nèi)蔗糖和淀粉的動態(tài)變化,在葉片光合作用產(chǎn)物分配過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。

        1 ?材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 ?實驗材料? 實驗所用的橡膠樹位于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院試驗場1隊和3隊,品系為熱研7-33-97。根取自熱研7-33-97組培袋裝苗的根,其他6個組織采自10年生、開割3 a的橡膠樹,光周期的葉片取自定植4年的橡膠樹穩(wěn)定期葉片的葉肉部分,以5片葉片為1個實驗重復(fù),每個時間點取3個實驗重復(fù)。

        1.1.2 ?實驗試劑和菌種? pMD18-T和PrimerStar Max DNA polymerase,熒光定量試劑TB Green?Premix Ex Taq?為大連寶生物公司產(chǎn)品。限制性核酸內(nèi)切酶、cDNA第一鏈合成試劑盒為美國Thermo Scientific公司產(chǎn)品。通用植物總RNA提取試劑盒為北京百泰克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。真核表達載體pGAPZαB和畢赤酵母GS115,為本實驗室保存。引物和DNA測序在華大基因公司合成和測序。

        1.2 方法

        1.2.1 ?總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成? 參照說明書提取巴西橡膠樹不同組織和光周期葉片的總RNA,合成不同組織mRNA的cDNA第一鏈。

        1.2.2HbNIN8基因的克隆? 應(yīng)用擬南芥葉綠體型中堿性轉(zhuǎn)化酶At-A/N-InvE的mRNA序列,比對巴西橡膠樹的轉(zhuǎn)錄組,獲得了其在橡膠樹中的同源基因的mRNA序列,命名為HbNIN8。使用引物對HbNIN8-F和HbNIN8-R(序列信息詳見表1),以橡膠樹葉片的cDNA為模板,PCR擴增HbNIN8的全長cDNA序列,PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳回收后,連接到pMD-18T載體中,轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞,菌落PCR鑒定后,挑選3個陽性的克隆,送深圳華大基因進行測序驗證。

        1.2.3 ?多序列比對與進化分析? 選取擬南芥5個細胞質(zhì)定位的(AtCYT-INV1、AtCYT-INV2、At-A/N-InvB、At-A/N-InvD、At-A/N-InvF)和4個亞細胞器定位的中堿性轉(zhuǎn)化酶基因(At-A/N-InvE、At-A/N-InvA、At-A/N-InvC、At-A/N-InvH),水稻的中堿性轉(zhuǎn)化酶8個中堿性轉(zhuǎn)化酶(OsNIN1-4,亞細胞定位;OsNIN5-8,細胞質(zhì)定位)以及橡膠樹HbNIN8的氨基酸序列,使用Mega7.0進行進化樹分析[15],應(yīng)用Neibgbber- Joining法進行分子系統(tǒng)學分析,并進行1 000次bootstrap統(tǒng)計學檢驗。應(yīng)用在線預(yù)測軟件ChloroP and TargetP[16-17]和ProtComp 9.0通過分析氨基酸序列,預(yù)測其定位。

        1.2.4HbNIN8基因的表達分析HbNIN8基因的熒光定量PCR引物qNIN8-F和qNIN8-R,經(jīng)標準曲線和溶解曲線分析,確定引物特異性和擴增效率,PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆測序后,最后確認為有效的熒光定量引物。使用該引物對,應(yīng)用熒光定量PCR儀,對HbNIN8基因在不同組織、葉片不同時期和光周期的進行表達分析,內(nèi)參基因為UBC2a參照Li等[18]的論文,具體PCR程序和數(shù)據(jù)分析參照Long等[19]的方法。

        1.2.5HbNIN8真核表達載體的構(gòu)建與表達 ?以zNIN8-F和zNIN8-R為引物,使用大連寶生物公司PrimerStar Max DNA Polymerase擴增HbNIN8的全長編碼區(qū)序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)PCR回收試劑盒回收后,和真核表達載體pGAPZαB都使用KpnI和NotI雙酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)膠回收后、連接轉(zhuǎn)化。菌落PCR鑒定陽性克隆,測序確認正確的克隆,成功構(gòu)建了HbNIN8的pGAPZαB的真核表達載體,命名為pGAP-HbNIN8。pGAP-HbNIN8經(jīng)Bsp HI酶切線性化,使用電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115。挑選5個PCR鑒定為陽性的菌落克隆至含100 ?g/mL博來霉素的YPD液體培養(yǎng)基中,30 ℃,250 r/min培養(yǎng)3~5 d。

        1.2.6 ?HbNIN8重組蛋白的酶活性分析? pGAPZαB通過分泌表達目的蛋白,重組表達蛋白HbNIN8位于液體培養(yǎng)基中,4 000 r/min,離心10 min。取上清加至10 ku超濾管中,4 000 r/min,4 ℃,離心30 min。然后在超濾管中加入15 mL 50 mmol/L HEPES(pH 7.5),4 000 r/min,4 ℃,離心30 min,重復(fù)1次,以去除YPD培養(yǎng)基中殘留的葡萄糖。使用10%濃度的聚丙烯酰胺凝膠,SDS-PAGE電泳檢測真核表達產(chǎn)物。取約5 ?L未經(jīng)純化HbNIN8重組蛋白,用于最適pH和最適酶活性溫度的測定。最適pH反應(yīng)體系:50 mmol/L HEPES(pH 5.5~9.5),5 mmol/L MgCl2,100 mmol/L蔗糖,總體積100 ?L,45 ℃反應(yīng)30 min,反應(yīng)結(jié)束后馬上置于冰上,加入900 ?L的DNS溶液(1%的3,5-二硝基水楊酸,30%的酒石酸鉀鈉,0.4 mol/L的NaOH)終止反應(yīng),沸水浴中反應(yīng)5 min顯色,OD520測定吸光值。最適酶活性溫度的測定,50 mmol/L HEPES(pH 7.5),5 mmol/L MgCl2,100 mmol/L蔗糖,總體積100 ?L,置于不同溫度的水浴,其他同最適pH的測定。

        2? 結(jié)果與分析

        2.1 ?HbNIN8的序列分析

        HbNIN8的cDNA全長為2 169 bp,其中包括1 893 bp的開放讀碼框,預(yù)測編碼630個氨基酸。進化分析表明,HbNIN8與At-A/N-InvE的相似性最高(72.5%),歸屬于同一個亞類(圖1)。通過分析HbNIN8的氨基酸序列,預(yù)測其定位于葉綠體上。

        2.2 ?HbNIN8在不同組織和不同發(fā)育時期葉片中的表達分析

        qRT-PCR表達分析顯示,HbNIN8主要在橡膠樹的葉片中表達,而在其他組織中的表達量都比較低(圖2)。在葉片中,HbNIN8的表達水平隨著葉片的成熟而逐漸增加,其中在穩(wěn)定期葉片中的表達量最高(圖3)。在光周期分析表明,HbNIN8在白天的表達量較低,而在缺乏光照的凌晨、傍晚和晚上的表達量較高(圖4)。

        3? 討論

        本研究報道了一個橡膠樹葉綠體型中堿性轉(zhuǎn)化酶基因HbNIN8的序列特征、表達特性及其編碼蛋白的酶學特征。亞細胞定位分析表明,HbNIN8定位于葉綠體。根據(jù)進化分析,HbNIN8與擬南芥的At-A/N-InvE、水稻OsNIN3和OsNIN4聚為一類。該酶酶活性分析表明,HbNIN8的重組蛋白具有中堿性轉(zhuǎn)化酶的酶活性,其最適pH為7.5,最適酶活性溫度為45 ℃,從最適pH來看,HbNIN8為典型的中堿性轉(zhuǎn)化酶。已有實驗證明,At-A/N-InvE和OsNIN3均定位于葉綠體中[5,9],并且有報道表明擬南芥和菠菜葉綠體的轉(zhuǎn)化酶具有中堿性轉(zhuǎn)化酶酶活性[9]。因此,高等植物的葉綠體中應(yīng)該普遍存在中堿性轉(zhuǎn)化酶,HbNIN8和其他葉綠體型中堿性轉(zhuǎn)化酶一樣,可能在葉綠體內(nèi)的糖代謝過程中發(fā)揮重要作用。熒光定量結(jié)果顯示,HbNIN8主要在橡膠樹葉片中表達,且隨著葉片的發(fā)育成熟其表達量逐漸增加,并在成熟葉片中達到最大值,而擬南芥的At-A/N-InvE基因除了在葉片中外,在花中也高水平表達[9],HbNIN8可能主要在葉片中發(fā)揮其功能,而在其他器官中的作用相對較小。在擬南芥中,At-A/N-InvE基因的缺失突變體,相對于野生型,其葉片中的中堿性轉(zhuǎn)化酶活性下降了約30%,葉片的蔗糖含量沒有明顯變化,而葉片的淀粉下降了33%[9]。擬南芥的葉綠體型中堿性轉(zhuǎn)化酶At-A/N-InvE的294位半胱氨酸突變?yōu)槔野彼?,突變體的幼苗表現(xiàn)為對蔗糖超敏感,在100 mmol/L蔗糖條件下,突變體呈現(xiàn)出明顯的黃化表型,葉綠體含量和葉綠體相關(guān)基因的表達明顯減少[20-21]。而且Maruta等[22]的研究進一步表明,At-A/N- InvE的294位半胱氨酸突變體sicy-192,為功能獲得突變,高濃度蔗糖處理時,相對于野生型,sicy-192的葉綠體基因和光合作用相關(guān)核基因的表達呈明顯下調(diào)。橡膠樹成熟葉片中,在缺乏光照的晚上8:00到早上6:00,HbNIN8的表達量明顯高于白天的表達量,HbNIN8的表達和橡膠樹的光合作用呈負相關(guān),這是首次發(fā)現(xiàn)葉綠體型中堿性轉(zhuǎn)化酶基因的表達與光周期呈相關(guān)性。因此,HbNIN8可能和擬南芥At-A/N-InvE類似,在晚上和白天,以不同的效率水解蔗糖為葡萄糖和果糖,再通過己糖激酶信號途徑,調(diào)控橡膠樹葉綠體內(nèi)蔗糖和淀粉的分配,進而影響葉綠體的功能。

        綜上所述,本研究從橡膠樹中獲得了一個有功能的葉綠體型中堿性轉(zhuǎn)化酶基因HbNIN8,確定了HbNIN8重組蛋白的最適酶活性溫度和最適pH,并分析了HbNIN8在不同組織和在一天中不同時間葉片中的表達模式。該研究結(jié)果為揭示中堿性轉(zhuǎn)化酶基因在植物葉片中的生物學功能奠定了良好基礎(chǔ)。

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