陽江華 龍翔宇 鄒智 秦云霞

摘? 要? 蔗糖是高等植物光合產(chǎn)物的重要存儲方式，而轉(zhuǎn)化酶和蔗糖合酶是水解蔗糖的主要酶。研究基于橡膠樹的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，采用RT-PCR技術(shù)克隆到一個中堿性轉(zhuǎn)化酶基因HbNIN8的全長cDNA。該基因預(yù)測編碼630個氨基酸。同源和亞細胞定位分析表明，HbNIN8屬于α類中堿性轉(zhuǎn)化酶，葉綠體定位。應(yīng)用畢赤酵母真核表達獲得其重組蛋白，分析了其酶活性特點，HbNIN8在畢赤酵母中重組蛋白的最適pH為7.5，最適溫度為45 ℃。實時熒光定量PCR分析表明，HbNIN8主要在葉片中表達，其表達量隨著葉片的成熟而逐漸增加，在穩(wěn)定期葉片中達到最大，在成熟葉片中，HbNIN8的表達呈現(xiàn)明顯的晝夜差異，晚上的表達水平相對高于白天。因此，HbNIN8很可能是負責將葉綠體中的蔗糖水解為單糖，從而調(diào)控橡膠樹葉綠體內(nèi)蔗糖和淀粉的分配。

關(guān)鍵詞? 巴西橡膠樹;中堿性轉(zhuǎn)化酶;HbNIN8;葉綠體中圖分類號? S794.1 ?????文獻標識碼? A

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2018.12.014

蔗糖是植物光合作用的主要產(chǎn)物，其在植物生長發(fā)育、信號傳導(dǎo)和脅迫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。蔗糖的水解依賴于轉(zhuǎn)化酶和蔗糖合成酶，其中，轉(zhuǎn)化酶根據(jù)最適pH可分為酸性轉(zhuǎn)化酶（acid invertase）和中堿性轉(zhuǎn)化酶（alkaline/neutral invertase，A/N-Inv）^[1]。中堿性轉(zhuǎn)化酶的最適pH接近7.0，其廣泛存在于光合細菌和植物中^[2]。中堿性轉(zhuǎn)化酶主要位于植物的細胞質(zhì)中，但在線粒體、葉綠體和質(zhì)膜等亞細胞器也有分布，分別起著不同的作用^[3]。中堿性轉(zhuǎn)化酶屬于多基因家族，其在擬南芥和水稻中分別含有9個和8個成員^[4]，可分為兩個亞類，即定位于胞質(zhì)的β類和位于線粒體/葉綠體的α類。研究表明，水稻的OsNIN1和OsNIN3分別位于線粒體和葉綠體上^[5]，擬南芥的At-A/N-InvA、At-A/N-InvC、At-A/N-InvH定位于線粒體^[6-8]，而At-A/N-InvE則定位于葉綠體^[9]。深入研究發(fā)現(xiàn)，α類中堿性轉(zhuǎn)化酶對于植物器官的形成與發(fā)育都是不可或缺的。在擬南芥中，At-A/N-InvA和At-A/N-InvC的單基因缺失突變體生長受到抑制，植株矮小，開花期推遲^[6]; AtCINV1和AtCINV2的雙突變體cinv1，2表現(xiàn)為嚴重的生長缺陷，植株矮小，根短粗，其根的長度只有野生型的17%^[1]。在水稻中，AtCINV1的同源基因OsCYT-INV1的突變體也呈現(xiàn)出類似的表型，其胚根相對于野生型明顯變短，同時還表現(xiàn)出晚花和種子發(fā)芽率低等表型^[10-11]。另有報道表明，百脈根的LjINV1缺失后，其根和莖表現(xiàn)出明顯的生長抑制，并且不能形成花粉，表現(xiàn)出不育性狀^[12]。追究α類中堿性轉(zhuǎn)化酶的作用機理，發(fā)現(xiàn)葉綠體At-A/N-InvE的缺失，擬南芥葉片的蔗糖濃度沒有明顯變化，但是葉片淀粉的積累顯著減少^[9]。因此，α類中堿性轉(zhuǎn)化酶很可能是能將葉綠體中的蔗糖水解為單糖，從而調(diào)控葉綠體內(nèi)蔗糖和淀粉的動態(tài)轉(zhuǎn)化。

課題組的前期研究表明，橡膠樹含有10個中堿性轉(zhuǎn)化酶基因^[13]，其中，胞質(zhì)定位的HbNIN2是膠乳中蔗糖降解的關(guān)鍵酶，其活性強弱與橡膠樹膠乳的產(chǎn)量呈明顯的正相關(guān)^[14]。然而，目前對橡膠樹細胞器中的中堿性轉(zhuǎn)化酶知之甚少。本研究報道一個在橡膠樹葉片中高表達的中堿性轉(zhuǎn)化酶基因HbNIN8，推測其很可能負責將葉綠體中的蔗糖水解為單糖，從而調(diào)控橡膠樹葉綠體內(nèi)蔗糖和淀粉的動態(tài)變化，在葉片光合作用產(chǎn)物分配過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。

1 ?材料與方法

1.1 材料

1.1.1 ?實驗材料? 實驗所用的橡膠樹位于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院試驗場1隊和3隊，品系為熱研7-33-97。根取自熱研7-33-97組培袋裝苗的根，其他6個組織采自10年生、開割3 a的橡膠樹，光周期的葉片取自定植4年的橡膠樹穩(wěn)定期葉片的葉肉部分，以5片葉片為1個實驗重復(fù)，每個時間點取3個實驗重復(fù)。

1.1.2 ?實驗試劑和菌種? pMD18-T和PrimerStar Max DNA polymerase，熒光定量試劑TB Green?Premix Ex Taq?為大連寶生物公司產(chǎn)品。限制性核酸內(nèi)切酶、cDNA第一鏈合成試劑盒為美國Thermo Scientific公司產(chǎn)品。通用植物總RNA提取試劑盒為北京百泰克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。真核表達載體pGAPZαB和畢赤酵母GS115，為本實驗室保存。引物和DNA測序在華大基因公司合成和測序。

1.2 方法

1.2.1 ?總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成? 參照說明書提取巴西橡膠樹不同組織和光周期葉片的總RNA，合成不同組織mRNA的cDNA第一鏈。

1.2.2HbNIN8基因的克隆? 應(yīng)用擬南芥葉綠體型中堿性轉(zhuǎn)化酶At-A/N-InvE的mRNA序列，比對巴西橡膠樹的轉(zhuǎn)錄組，獲得了其在橡膠樹中的同源基因的mRNA序列，命名為HbNIN8。使用引物對HbNIN8-F和HbNIN8-R（序列信息詳見表1），以橡膠樹葉片的cDNA為模板，PCR擴增HbNIN8的全長cDNA序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳回收后，連接到pMD-18T載體中，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞，菌落PCR鑒定后，挑選3個陽性的克隆，送深圳華大基因進行測序驗證。

1.2.3 ?多序列比對與進化分析? 選取擬南芥5個細胞質(zhì)定位的（AtCYT-INV1、AtCYT-INV2、At-A/N-InvB、At-A/N-InvD、At-A/N-InvF）和4個亞細胞器定位的中堿性轉(zhuǎn)化酶基因（At-A/N-InvE、At-A/N-InvA、At-A/N-InvC、At-A/N-InvH），水稻的中堿性轉(zhuǎn)化酶8個中堿性轉(zhuǎn)化酶（OsNIN1-4，亞細胞定位;OsNIN5-8，細胞質(zhì)定位）以及橡膠樹HbNIN8的氨基酸序列，使用Mega7.0進行進化樹分析^[15]，應(yīng)用Neibgbber- Joining法進行分子系統(tǒng)學分析，并進行1 000次bootstrap統(tǒng)計學檢驗。應(yīng)用在線預(yù)測軟件ChloroP and TargetP^[16-17]和ProtComp 9.0通過分析氨基酸序列，預(yù)測其定位。

1.2.4HbNIN8基因的表達分析HbNIN8基因的熒光定量PCR引物qNIN8-F和qNIN8-R，經(jīng)標準曲線和溶解曲線分析，確定引物特異性和擴增效率，PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆測序后，最后確認為有效的熒光定量引物。使用該引物對，應(yīng)用熒光定量PCR儀，對HbNIN8基因在不同組織、葉片不同時期和光周期的進行表達分析，內(nèi)參基因為UBC2a參照Li等^[18]的論文，具體PCR程序和數(shù)據(jù)分析參照Long等^[19]的方法。

1.2.5HbNIN8真核表達載體的構(gòu)建與表達 ?以zNIN8-F和zNIN8-R為引物，使用大連寶生物公司PrimerStar Max DNA Polymerase擴增HbNIN8的全長編碼區(qū)序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)PCR回收試劑盒回收后，和真核表達載體pGAPZαB都使用KpnI和NotI雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)膠回收后、連接轉(zhuǎn)化。菌落PCR鑒定陽性克隆，測序確認正確的克隆，成功構(gòu)建了HbNIN8的pGAPZαB的真核表達載體，命名為pGAP-HbNIN8。pGAP-HbNIN8經(jīng)Bsp HI酶切線性化，使用電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115。挑選5個PCR鑒定為陽性的菌落克隆至含100 ?g/mL博來霉素的YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃，250 r/min培養(yǎng)3～5 d。

1.2.6 ?HbNIN8重組蛋白的酶活性分析? pGAPZαB通過分泌表達目的蛋白，重組表達蛋白HbNIN8位于液體培養(yǎng)基中，4 000 r/min，離心10 min。取上清加至10 ku超濾管中，4 000 r/min，4 ℃，離心30 min。然后在超濾管中加入15 mL 50 mmol/L HEPES（pH 7.5），4 000 r/min，4 ℃，離心30 min，重復(fù)1次，以去除YPD培養(yǎng)基中殘留的葡萄糖。使用10%濃度的聚丙烯酰胺凝膠，SDS-PAGE電泳檢測真核表達產(chǎn)物。取約5 ?L未經(jīng)純化HbNIN8重組蛋白，用于最適pH和最適酶活性溫度的測定。最適pH反應(yīng)體系：50 mmol/L HEPES（pH 5.5～9.5），5 mmol/L MgCl₂，100 mmol/L蔗糖，總體積100 ?L，45 ℃反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后馬上置于冰上，加入900 ?L的DNS溶液（1%的3，5-二硝基水楊酸，30%的酒石酸鉀鈉，0.4 mol/L的NaOH）終止反應(yīng)，沸水浴中反應(yīng)5 min顯色，OD₅₂₀測定吸光值。最適酶活性溫度的測定，50 mmol/L HEPES（pH 7.5），5 mmol/L MgCl₂，100 mmol/L蔗糖，總體積100 ?L，置于不同溫度的水浴，其他同最適pH的測定。

2? 結(jié)果與分析

2.1 ?HbNIN8的序列分析

HbNIN8的cDNA全長為2 169 bp，其中包括1 893 bp的開放讀碼框，預(yù)測編碼630個氨基酸。進化分析表明，HbNIN8與At-A/N-InvE的相似性最高（72.5%），歸屬于同一個亞類（圖1）。通過分析HbNIN8的氨基酸序列，預(yù)測其定位于葉綠體上。

2.2 ?HbNIN8在不同組織和不同發(fā)育時期葉片中的表達分析

qRT-PCR表達分析顯示，HbNIN8主要在橡膠樹的葉片中表達，而在其他組織中的表達量都比較低（圖2）。在葉片中，HbNIN8的表達水平隨著葉片的成熟而逐漸增加，其中在穩(wěn)定期葉片中的表達量最高（圖3）。在光周期分析表明，HbNIN8在白天的表達量較低，而在缺乏光照的凌晨、傍晚和晚上的表達量較高（圖4）。

3? 討論

本研究報道了一個橡膠樹葉綠體型中堿性轉(zhuǎn)化酶基因HbNIN8的序列特征、表達特性及其編碼蛋白的酶學特征。亞細胞定位分析表明，HbNIN8定位于葉綠體。根據(jù)進化分析，HbNIN8與擬南芥的At-A/N-InvE、水稻OsNIN3和OsNIN4聚為一類。該酶酶活性分析表明，HbNIN8的重組蛋白具有中堿性轉(zhuǎn)化酶的酶活性，其最適pH為7.5，最適酶活性溫度為45 ℃，從最適pH來看，HbNIN8為典型的中堿性轉(zhuǎn)化酶。已有實驗證明，At-A/N-InvE和OsNIN3均定位于葉綠體中^[5，9]，并且有報道表明擬南芥和菠菜葉綠體的轉(zhuǎn)化酶具有中堿性轉(zhuǎn)化酶酶活性^[9]。因此，高等植物的葉綠體中應(yīng)該普遍存在中堿性轉(zhuǎn)化酶，HbNIN8和其他葉綠體型中堿性轉(zhuǎn)化酶一樣，可能在葉綠體內(nèi)的糖代謝過程中發(fā)揮重要作用。熒光定量結(jié)果顯示，HbNIN8主要在橡膠樹葉片中表達，且隨著葉片的發(fā)育成熟其表達量逐漸增加，并在成熟葉片中達到最大值，而擬南芥的At-A/N-InvE基因除了在葉片中外，在花中也高水平表達^[9]，HbNIN8可能主要在葉片中發(fā)揮其功能，而在其他器官中的作用相對較小。在擬南芥中，At-A/N-InvE基因的缺失突變體，相對于野生型，其葉片中的中堿性轉(zhuǎn)化酶活性下降了約30%，葉片的蔗糖含量沒有明顯變化，而葉片的淀粉下降了33%^[9]。擬南芥的葉綠體型中堿性轉(zhuǎn)化酶At-A/N-InvE的294位半胱氨酸突變?yōu)槔野彼?，突變體的幼苗表現(xiàn)為對蔗糖超敏感，在100 mmol/L蔗糖條件下，突變體呈現(xiàn)出明顯的黃化表型，葉綠體含量和葉綠體相關(guān)基因的表達明顯減少^[20-21]。而且Maruta等^[22]的研究進一步表明，At-A/N- InvE的294位半胱氨酸突變體sicy-192，為功能獲得突變，高濃度蔗糖處理時，相對于野生型，sicy-192的葉綠體基因和光合作用相關(guān)核基因的表達呈明顯下調(diào)。橡膠樹成熟葉片中，在缺乏光照的晚上8：00到早上6：00，HbNIN8的表達量明顯高于白天的表達量，HbNIN8的表達和橡膠樹的光合作用呈負相關(guān)，這是首次發(fā)現(xiàn)葉綠體型中堿性轉(zhuǎn)化酶基因的表達與光周期呈相關(guān)性。因此，HbNIN8可能和擬南芥At-A/N-InvE類似，在晚上和白天，以不同的效率水解蔗糖為葡萄糖和果糖，再通過己糖激酶信號途徑，調(diào)控橡膠樹葉綠體內(nèi)蔗糖和淀粉的分配，進而影響葉綠體的功能。

綜上所述，本研究從橡膠樹中獲得了一個有功能的葉綠體型中堿性轉(zhuǎn)化酶基因HbNIN8，確定了HbNIN8重組蛋白的最適酶活性溫度和最適pH，并分析了HbNIN8在不同組織和在一天中不同時間葉片中的表達模式。該研究結(jié)果為揭示中堿性轉(zhuǎn)化酶基因在植物葉片中的生物學功能奠定了良好基礎(chǔ)。

參考文獻

1. Barratt D H P， Derbyshire P， Findlay K， et al. Normal growth of Arabidopsis requires cytosolic invertase but not sucrose synthase[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2009， 106（31）： 13 124-13 129.
2. Vargas W， Cumino A， Salerno G L. Cyanobacterial alkaline/neutral invertases： origin of sucrose hydrolysis in the plant cytosol？[J]. Planta， 2003， 216（6）： 951-960.
3. Vargas W， Salerno G L. The Cinderella story of sucrose hydrolysis： Alkaline/neutral invertases， from cyanobacteria to unforeseen roles in plant cytosol and organelles[J]. Plant Science， 2010， 178（1）： 1-8.
4. Ji X， van den Ende W， van Laere A， et al. Structure， evolution， and expression of the two invertase gene families of rice[J]. Journal of Molecular Evolution， 2005， 60（5）： 615- 634.
5. Murayama S， Handa H. Genes for alkaline/neutral invertase in rice： alkaline/neutral invertases are located in plant mitochondria and also in plastids[J]. Planta， 2007， 225（5）： 1 193- 1 203.
6. Xiang L， Le Roy K， Bolouri-Moghaddam M R， et al. Exploring the neutral invertase-oxidative stress defence connection in Arabidopsis thaliana[J]. Journal of Experimental Botany， 2011， 62（11）： 3 849-3 862.
7. Martin M L， Lechner L， Zabaleta E J， et al. A mitochondrial alkaline/neutral invertase isoform （A/N-InvC） functions in developmental energy-demanding processes in Arabidopsis[J]. Planta， 2013， 237（3）： 813-822.
8. Battaglia M E， Martin M V， Lechner L， et al. The riddle of mitochondrial alkaline/neutral invertases： A novel Arabidopsis isoform mainly present in reproductive tissues and involved in root ROS production[J]. PLoS One， 2017， 12（9）： e0185286.
9. Vargas W A， Pontis H G， Salerno G L. New insights on sucrose metabolism： evidence for an active A/N-Inv in chloroplasts uncovers a novel component of the intracellular carbon trafficking[J]. Planta， 2008， 227（4）： 795-807.
10. Jia L Q， Zhang B T， Mao C Z， et al. OsCYT-INV₁ for alkaline/neutral invertase is involved in root cell development and reproductivity in rice （Oryza sativa L.）[J]. Planta， 2008， 228（1）： 51-59.
11. Yao S G， Kodama R， Wang H， et al. Analysis of the rice SHORT-ROOT5 gene revealed functional diversification of plant neutral/alkaline invertase family[J]. Plant Science， 2009， 176（5）： 627-634.
12. Welham T， Pike J， Horst I， et al. A cytosolic invertase is required for normal growth and cell development in the model legume， Lotus japonicus[J]. Journal of Experimental Botany， 2009， 60（12）： 3 353-3 365.
13. 肖小虎. 巴西橡膠樹蔗糖代謝相關(guān)基因家族的克隆、結(jié)構(gòu)進化和表達分析[D]. ?？冢?海南大學， 2013.
14. Liu S J， Lan J X， Zhou B H， et al. HbNIN₂， a cytosolic alkaline/neutral-invertase， is responsible for sucrose catabolism in rubber-producing laticifers of Hevea brasiliensis （para rubber tree）[J]. New Phytologist， 2015， 206（2）： 709-725.
15. Kumar S， Stecher G， Tamura K. MEGA7. MEGA7： molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets[J]. Molecular Biology and Evolution， 2016， 33（7）： 1 870-1 874.
16. Emanuelsson O， Nielsen H， Heijne G V. ChloroP， a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites[J]. Protein Science， 1999， 8（5）： 978-984.
17. Emanuelsson O， Brunak S， von Heijne G， et al. Locating proteins in the cell using TargetP， SignalP and related tools[J]. Nature Protocols， 2007， 2（4）： 953-971.
18. Li H P， Qin Y X， Xiao X H， et al. Screening of valid reference genes for real-time RT-PCR data normalization in Hevea brasiliensis and expression validation of a sucrose transporter gene HbSUT3[J]. Plant Science， 2011， 181（2）： 132-139.
19. Long X Y， He B， Gao X S， et al. Validation of reference genes for quantitative real-time PCR during latex regeneration in rubber tree[J]. Gene， 2015， 563（2）： 190-195.
20. Tamoi M， Tabuchi T， Demuratani M， et al. Point mutation of a plastidic invertase inhibits development of the photosynthetic apparatus and enhances nitrate assimilation in sugar-treated Arabidopsis seedlings[J]. Journal of Biological Chemistry， 2010， 285（20）： 15 399-15 407.
21. Maruta T， Otori K， Tabuchi T， et al. New insights into the regulation of greening and carbon-nitrogen balance by sugar metabolism through a plastidic invertase[J]. Plant Signaling & Behavior， 2010， 5（9）： 1 131-1 133.
22. Maruta T， Miyazaki N， Nosaka R， et al. A gain-of-function mutation of plastidic invertase alters nuclear gene expression with sucrose treatment partially via GENOMES UNCOUPLED1-mediated signaling[J]. New Phytologist， 2015， 206（3）： 1 013-1 023.