陳曉慧 曾麗蘭 徐小萍 王亞婷 張梓浩 陳裕坤 林玉玲 賴鐘雄

摘 要 以龍眼胚性愈傷組織為材料，研究龍眼Mn-SOD基因在應(yīng)答非生物因子和外源激素處理下的轉(zhuǎn)錄情況，并利用煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法分析其啟動(dòng)子的表達(dá)活性。結(jié)果表明：龍眼胚性愈傷組織中Mn-SOD基因的表達(dá)受到紅光和藍(lán)光的抑制；而在白光處理下，Mn-SOD呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢，在綠光中，則是先下調(diào)再上升。在鹽脅迫處理下，Mn-SOD基因的表達(dá)受到抑制，在蔗糖和不同天數(shù)處理中則不受影響。在一定濃度范圍內(nèi)，外源激素IAA、GA3、MeJA、SA和ETH均能誘導(dǎo)或抑制龍眼胚性愈傷組織中Mn-SOD基因的表達(dá)，提示其參與外源激素的應(yīng)答。構(gòu)建4個(gè)不同啟動(dòng)子缺失片段驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因GUS的植物表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化煙草。結(jié)果表明，龍眼Mn-SOD基因4個(gè)不同啟動(dòng)子缺失片段啟動(dòng)GUS基因的能力均低于CaMV35S啟動(dòng)子，但均可啟動(dòng)GUS基因的表達(dá)。瞬時(shí)表達(dá)和定量表達(dá)結(jié)果顯示，3缺失的MSD-pro4（-669～-267 bp）啟動(dòng)GUS基因的能力最強(qiáng)，其次為5缺失的MSD-pro1（-669～-1 bp），最弱的為MSD-pro2（-432 ～-1bp）和MSD-pro3（-267～-1 bp），提示Mn-SOD啟動(dòng)子-669～-432 bp區(qū)段內(nèi)含有重要的正向順式調(diào)控元件；而-432～-1 bp區(qū)段含有負(fù)調(diào)控元件。

關(guān)鍵詞 龍眼；Mn-SOD；啟動(dòng)子；瞬時(shí)表達(dá)

中圖分類號 Q785； Q789 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract Expression of Mn-SOD was analyzed in embryogenic callus （EC） under abiotic stress and exogenous hormone treatment in Dimocarpus longan， and its promoter activities were studied in a tobacco transient expression system. Results showed that the expression of Mn-SOD was inhibited in longan EC treated by red and blue lights； Mn-SOD firstly increased and then decreased in white light treated-EC， and it has contrary expression pattern under green light treatment. The expression of Mn-SOD was inhibited under salt stress， and was not affected by sucrose and days treatment. In a certain range of concentration， exogenous hormones IAA， GA3， MeJA， SA and ETH could induce or inhibit the expression of Mn-SOD in longan EC， suggesting that longan Mn-SOD was involved in the response of exogenous hormones. Four deletions of longan Mn-SOD promoter fused to the GUS reporter gene were constructed and transient transformed into tobacco. The results showed that the activities of the four deletions of longan Mn-SOD promoter were lower than that of CaMV35S promoter， but all of them had the ability to activate the GUS gene. GUS activity and quantitative expression analysis both showed that 3' terminal deletion of MSD-pro4 （-420 bp） promoter is the strongest， followed by the terminal 5' deletions of MSD-pro1（-669～-1 bp）， and the weakest were MSD-pro2 （-432 ～-1 bp） and MSD-pro3 （-267～-1 bp）， suggesting that longan Mn-SOD promoter within the -669～-432bp region contains important positive regulatory elements， while the -1～432 region contains a negative regulatory element.

Key words Dimocarpus longan； Mn-SOD； promoter； transient expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.05.013

龍眼（Dimocarpus longan Lour.）是無患子科（Sapindaceae）常綠木本果樹，是中國南方重要的亞熱帶特色水果之一，歷史上有南方“桂圓”北“人參”之稱。但在生長發(fā)育過程中，易受低溫、干旱、鹽害及環(huán)境污染等因子的影響，導(dǎo)致其代謝活動(dòng)改變，生長發(fā)育受阻，甚至全株死亡。超氧化物歧化酶（Superoxde dismutase，SOD）是一種重要的抗氧化酶，廣泛存在于生物體中，能有效的清除活性氧并減輕氧化脅迫。同時(shí)，SOD作為植物抗氧化系統(tǒng)的第一道防線，在提高植物抗逆境脅迫等方面起著重要的作用[1-3]。根據(jù)活性中心所含金屬離子的不同可將SOD分為3種類型：即銅鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）、錳超氧化物歧化酶（Mn-SOD）和鐵超氧化物歧化酶（Fe-SOD）；并且SOD的調(diào)控形式因其存在不同類型而有所不同，其中Cu/Zn-SOD和Fe-SOD大多數(shù)是組成型表達(dá)，而Mn-SOD主要是誘導(dǎo)型表達(dá)[4]。課題組前期分離獲得編碼龍眼Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD的20個(gè)不同mRNA轉(zhuǎn)錄本，對它們的進(jìn)化、基因結(jié)構(gòu)及其在體胚發(fā)生過程中的表達(dá)進(jìn)行了系統(tǒng)的比較分析[3]；此外，還進(jìn)行了龍眼活體胚胎、體胚發(fā)生早期、不同溫度處理及滲透脅迫（聚乙二醇（PEG）、甘露醇和蔗糖等）對龍眼胚性愈傷組織SOD酶活性的影響[5-6]。上述研究結(jié)果表明，SOD在龍眼生長發(fā)育和抗逆中均具有重要作用。

為進(jìn)一步了解不同SOD類型在龍眼中的作用，本研究在前期研究基礎(chǔ)上，以Mn-SOD基因?yàn)檠芯繉ο?，研究其在非生物因子條件下和不同外源激素處理下的應(yīng)答情況；在生物信息學(xué)分析基礎(chǔ)上，通過5'/3'系列缺失法獲得Mn-SOD基因5'上游片段4種不同的缺失片段，以pCAMBIA1301為載體，利用GUS基因作為報(bào)告基因，采用轉(zhuǎn)化本氏煙的方法，對龍眼Mn-SOD啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了初步的研究，以期為將來進(jìn)一步解析龍眼Mn-SOD抗逆功能提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

‘紅核子龍眼LC2胚性愈傷組織（EC）、本氏煙（Nicotiana benthamiana）移栽苗、植物表達(dá)載體pCAMBIA1301和農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)均由福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 龍眼胚性愈傷組織的非生物因子和激素處理 以旺盛生長的龍眼EC為試驗(yàn)基本材料，將其置于黑暗（對照）、紅光、藍(lán)光、白光、綠光下進(jìn)行不同光質(zhì)處理，分別收集培養(yǎng)24、72 h后的材料。以MS培養(yǎng)基為對照，取生長狀況良好的龍眼EC分別接種于鹽NaCl（10、15、20 g/L）、蔗糖sucrose（20、30、50、70、90 g/L）、生長素類似物IAA（0.5、1.0、1.5、3.0 mg/L）、赤霉素GA3（3、6、10、12、25 mg/L）、茉莉酸甲酯MeJA（50、75、100、150 μmol/L）、水楊酸SA（50、75、100 μmol/L）和乙烯ETH（10、30、50、100 mg/L）處理的MS培養(yǎng)基中，并將它們放置于25 ℃、110 r/min的搖床中，黑暗震蕩24 h后取材。上述處理均重復(fù)3次，材料收齊后，經(jīng)液氮中速凍，保存于-80 ℃超低溫冰箱，并用于龍眼Mn-SOD基因表達(dá)水平的檢測。

1.2.2 龍眼Mn-SOD啟動(dòng)子5'和3'端缺失突變片段引物設(shè)計(jì) 采用PlantCARE和DNAMAN6分別對Mn-SOD啟動(dòng)子序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析和酶切位點(diǎn)的分析，并根據(jù)分析結(jié)果分別設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的BamH I和NcoI的引物（表1）。

1.2.3 龍眼Mn-SOD啟動(dòng)子5'和3'端缺失突變瞬時(shí)表達(dá)載體的構(gòu)建 通過PCR獲得不同缺失片段的目標(biāo)序列，并利用Gel/PCR Extraction kit試劑盒回收、純化目的片段，TA克隆后測序。序列比對正確的克隆子，經(jīng)雙酶切，連接到切除35S啟動(dòng)子的pCAMBIA1301載體上，最后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在含有100 mg/L Kan和100 mg/L Rif的LB培養(yǎng)基中篩選出陽性克隆子，通過菌液PCR檢測和質(zhì)粒酶切驗(yàn)證重組質(zhì)粒的正確性。經(jīng)驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒，命名為p1301-Mn-SOD pro-GUS，并將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，表達(dá)載體構(gòu)建示意圖如圖1所示。

1.2.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草的GUS活性檢測 從制備好的帶重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液中，取1 mL接種于10 mL液體YEB培養(yǎng)基中（含100 mg/L Kan和100 mg/L Str ），28 ℃搖床180 r/min震蕩培養(yǎng)12 h直至菌液濃度OD600值為0.5～0.6之間；5 000 r/min離心10 min收集菌體；將重懸液的菌液濃度用MS（含添加200 mol/L As和20 mmol/L MgCl2）調(diào)整至OD600值為0.8～1.0之間，28 ℃靜置活化3 h后，利用無菌注射器將重懸液注射入煙草葉片，并做好注射部位標(biāo)記。將侵染后和未經(jīng)侵染的煙草植株置于25 曟和14/10 h光周期條件下培養(yǎng)72 h后，參考實(shí)驗(yàn)室前期的方法[4]進(jìn)行GUS活性檢測。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 首先，依照TriPure的說明書提取非生物因子處理的龍眼EC總RNA及Mn-SOD啟動(dòng)子不同缺失片段轉(zhuǎn)化煙草葉片的總RNA。cDNA合成參照TAKARA公司的SYBR ExScriptTM RT-PCR試劑盒。qPCR擴(kuò)增采用Takara SYBR ExScript試劑和羅氏LightCycler 480儀器。qPCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序參照實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)表的方法[3]。以eIF-4a為內(nèi)參基因[7]，分析不同非生物因子下的龍眼EC的Mn-SOD基因的定量表達(dá)情況；以18S rRNA為內(nèi)參基因，分析Mn-SOD啟動(dòng)子5'/3'不同缺失片段轉(zhuǎn)化煙草葉片后GUS基因的表達(dá)情況。Mn-SOD、eIF-4a和18S rRNA引物序列引自實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)表的文章[6-7]。引物均由華大基因公司合成。引物序列、擴(kuò)增效率及退火溫度見表2。并采用Excel和GraphPad軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同非生物因子處理下龍眼胚性愈傷組織中Mn-SOD基因的表達(dá)分析

利用qPCR技術(shù)檢測Mn-SOD基因在不同光質(zhì)、不同NaCl濃度及不同蔗糖濃度處理下龍眼胚性愈傷組織中的表達(dá)情況，結(jié)果見圖2。不同光質(zhì)處理24 h下的龍眼EC中，以黑暗培養(yǎng)為對照，Mn-SOD在白光中的表達(dá)水平上調(diào)，而在紅光、藍(lán)光和綠光中的表達(dá)水平下調(diào)；隨著光照時(shí)間延長至72 h，在紅光、藍(lán)光和白光中，Mn-SOD的表達(dá)水平顯著下調(diào)，而在綠光處理中，其表達(dá)量則顯著高于對照（圖2-a）。綜上所述，隨著紅光和藍(lán)光處理時(shí)間的延長，Mn-SOD基因的表達(dá)逐步受到抑制；而在白光處理下，Mn-SOD呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢，在綠光中，則是先下調(diào)再上升。提示Mn-SOD在不同光質(zhì)處理中的應(yīng)答機(jī)制可能不盡相同。不同NaCl濃度脅迫下，龍眼EC中Mn-SOD的表達(dá)水平呈下調(diào)趨勢，在20 g/L時(shí)達(dá)到最低值，提示鹽脅迫下Mn-SOD基因的表達(dá)受到抑制（圖2-b）。在不同蔗糖濃度處理的龍眼EC中，Mn-SOD基因的表達(dá)量在50 g/L時(shí)下調(diào)，而在其他濃度下基本沒變化，提示在一定濃度范圍內(nèi)Mn-SOD的表達(dá)不受高濃度蔗糖處理的影響（圖1-c）。

2.2 不同激素處理下龍眼EC中Mn-SOD基因的表達(dá)分析

不同濃度IAA、GA3、MeJA、SA和ETH處理下龍眼EC中Mn-SOD基因的表達(dá)分析結(jié)果見圖3。以對照（0）相比，低濃度IAA處理下（0.5、1.0 mg/L）龍眼EC中的Mn-SOD基因的表達(dá)受到明顯抑制，而當(dāng)濃度升高到1.5 mg/L時(shí)，其表達(dá)又顯著提高，隨著濃度進(jìn)一步升高（3.0 mg/L），其表達(dá)量又明顯下降（圖3-a），提示Mn-SOD能夠響應(yīng)IAA的應(yīng)答。在0～6 mg/L的GA3濃度處理下，Mn-SOD表達(dá)水平呈下降趨勢，隨著濃度進(jìn)一步升高至10 mg/L時(shí)，其表達(dá)量又顯著上升，而當(dāng)濃度達(dá)到25 mg/L時(shí)，其表達(dá)量則顯著下降（圖3-b）。在0～150 μmol/L MeJA脅迫下的龍眼EC中，Mn-SOD基因的表達(dá)水平呈逐步遞減趨勢，提示MeJA在龍眼EC中可能負(fù)調(diào)控Mn-SOD的表達(dá)（圖3-c）。在SA處理下，以0 μmol/L為對照，Mn-SOD在50、75 μmol/L處理下，其表達(dá)量顯著上升，而當(dāng)濃度升高到100 μmol/L時(shí)，其表達(dá)水平又急速下降，低于對照水平，說明其能夠響應(yīng)SA的誘導(dǎo)（圖3-d）。在10 mg/L乙烯利處理下，Mn-SOD基因的表達(dá)水平顯著下降，隨著ETH濃度的逐步升高，其表達(dá)水平又明顯升高，在濃度100 mg/L處理下達(dá)到最高（圖3-e）。綜上所述，在一定濃度范圍內(nèi)，IAA、GA3、MeJA、SA和ETH均能調(diào)控Mn-SOD基因的表達(dá)。

2.3 DlMn-SOD啟動(dòng)子不同5'/3'端缺失片段調(diào)控下的GUS瞬時(shí)表達(dá)活性

從GenBank中獲取龍眼Mn-SOD 5'端調(diào)控序列，其長度約為700 bp（Accession No：FJ590954）。根據(jù)PlantCARE生物信息學(xué)分析結(jié)果，在其不同位置設(shè)計(jì)3條正向引物（MSD-up1～ up3），從Mn-SOD基因起始密碼子ATG上游到ATG前一個(gè)堿基分別設(shè)計(jì)1條反向錨定引物MSD-down1，通過PCR擴(kuò)增獲得3個(gè)5'端調(diào)控序列的缺失突變片段，并分別命名為MSD-pro1～pro3（圖4-a）。MSD-pro1片段長為669 bp，含有現(xiàn)有長度的所有順式作用元件；MSD-pro2片段長約為432 bp，與MSD-pro1相比，缺少了2個(gè)as-2-box和1個(gè)ARE元件；MSD-pro3片段長約為267 bp，與MSD-pro2相比，缺少了MBS、Box-W1、AT-rich element和circadian等4個(gè)元件；以MSD-up1為上游引物，在離ATG上游較遠(yuǎn)處設(shè)計(jì)1條反向錨定引物MSD-down2（-267 bp），通過PCR擴(kuò)增獲得3'端調(diào)控序列的缺失突變體，將其命名為MSD-pro4，其含有as-2-box、ARE、MBS、Box-W1、AT-rich element和circadian等7個(gè)元件（圖4-a）。將上述缺失片段正向插入雙酶切后的含GUS基因，但無CaMV35S啟動(dòng)子的雙元植物表達(dá)載體pCAMBIA1301上。

在瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)中，采用GUS熒光活性檢測法，分析Mn-SOD啟動(dòng)子不同3'/5'端缺失片段調(diào)控下的煙草葉片GUS瞬時(shí)表達(dá)，同時(shí)平行進(jìn)行陽性和陰性對照。陽性對照（PC）為含有CaMV35S啟動(dòng)子融合GUS基因的pCAMBIA1301表達(dá)載體，陰性對照（NC）為空菌株LBA4404，MSD-pro1～pro3（5'缺失）和MSD-pro4（3'缺失）4個(gè)不同啟動(dòng)子缺失片段啟動(dòng)GUS基因的能力均低于CaMV35S啟動(dòng)子，但與陰性對照（NC）相比它們均可啟動(dòng)GUS基因的表達(dá)（圖4-b）。其中活性最強(qiáng)的為MSD-pro4（-669～-268 bp，3'缺失），MSD-pro3（-267～-1 bp，5'缺失）和MSD-pro1（-669～-1 bp，5'缺失）次之，MSD-pro2（-432 ～-1bp，5'缺失）最弱（圖4-b），提示MSD-pro4（-669～-268 bp，3'缺失）含有as-2-box、ARE、MBS、Box-W1、AT-rich element和circadian元件中具有正向調(diào)控Mn-SOD基因表達(dá)的順式作用元件。

2.4 龍眼Mn-SOD啟動(dòng)子不同3'/5'端缺失片段調(diào)控下的GUS基因表達(dá)分析

采用qPCR分析龍眼Mn-SOD啟動(dòng)子不同3'/5'端缺失片段調(diào)控下的煙草葉片GUS基因的表達(dá)情況（圖4-c），與CaMV35S啟動(dòng)子（PC）相比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MSD-pro1～pro3（5'缺失）和MSD-pro4（3'缺失）4個(gè)缺失片段啟動(dòng)子啟動(dòng)GUS基因的表達(dá)能力均較低，但與陰性對照（NC）相比均具有一定啟動(dòng)GUS基因的活性。此外，GUS基因的相對表達(dá)量的結(jié)果顯示，MSD-pro4（-669～-268 bp）啟動(dòng)GUS基因表達(dá)的能力最強(qiáng)，而MSD-pro3（-267～-1 bp）啟動(dòng)GUS基因的能力最弱，MSD-pro2（-432 ～-1bp）和MSD-pro1（-669～-1 bp）啟動(dòng)下的GUS基因表達(dá)水平較為接近，GUS基因的表達(dá)結(jié)果與GUS瞬時(shí)活性檢測結(jié)果總體上較為一致，均為MSD-pro4啟動(dòng)GUS基因的能力最強(qiáng)，但不一致的是，GUS瞬時(shí)活性最弱的為MSD-pro2（-432 ～-1bp），而GUS基因轉(zhuǎn)錄水平最低的為MSD-pro3（-267～-1 bp）。

3 討論

3.1 龍眼Mn-SOD參與非生物因子和外源激素的應(yīng)答

近年來，Mn-SODs在保護(hù)植物抵抗各種非生物因子中已有較多報(bào)道。如Mn-SOD能夠響應(yīng)熱激、冷脅迫和干旱等脅迫的誘導(dǎo)，其中熱激和冷脅迫處理均能誘導(dǎo)其表達(dá)[1]；而在干旱脅迫下，其表達(dá)量總體呈下調(diào)趨勢[1-2]。在鹽脅迫下，來自香蕉[1]、西紅柿[2]、小麥[8]和黃瓜[9]的Mn-SOD基因的表達(dá)量均提高。Mn-SOD在蔗糖、果糖和麥芽糖處理的子葉中其活性最高[10]。而在本研究中，Mn-SOD基因的表達(dá)在鹽脅迫處理下的龍眼愈傷組織中受到抑制，在蔗糖中在50 g/L時(shí)下調(diào)，而在其他濃度下則不受影響，與上述報(bào)道結(jié)果不甚一致，提示不同植物間Mn-SOD基因在非生物因子中的調(diào)控作用可能存在差異。龍眼Mn-SOD啟動(dòng)子中含有3個(gè)類型光反應(yīng)元件，如GAG-motif 、MRE和as-2-box元件[3]。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)其能受光或光質(zhì)的誘導(dǎo)。因此，龍眼愈傷組織中的Mn-SOD能夠響應(yīng)多種非生物因子的應(yīng)答。

本研究顯示，在一定濃度范圍內(nèi)，IAA、GA3、MeJA、SA和ETH均能誘導(dǎo)或抑制龍眼胚性愈傷組織中Mn-SOD基因的表達(dá)，提示其參與外源激素的應(yīng)答。然而前期研究顯示龍眼Mn-SOD啟動(dòng)子中并未含有激素響應(yīng)元件[3]，這可能是由于獲得的啟動(dòng)子序列過短（約700 bp），導(dǎo)致一些真實(shí)存在的順式作用元件未能得到預(yù)測。玉米體胚發(fā)育后期，干旱和外源ABA處理均能上調(diào)Sod3.2（Mn-SOD）和Sod4（Cu/Zn-SOD）的表達(dá)[11-12]。在香蕉中，Mn-SOD基因中的4個(gè)轉(zhuǎn)錄本（MSD1A-1D）的表達(dá)均受到外源激素ABA、GA3、IAA和SA的誘導(dǎo)，但其4個(gè)Mn-SOD成員中僅MSD1D含有1個(gè)激素應(yīng)答元件[1]。綜上所述，植物Mn-SOD并不富含激素響應(yīng)元件，但其能參與應(yīng)答多個(gè)外源激素的處理，提示其可能受到一些轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，進(jìn)而參與外源激素的應(yīng)答。因此，Mn-SOD如何參與外源激素的應(yīng)答機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入研究。

3.2 龍眼Mn-SOD啟動(dòng)子特性分析

SOD在轉(zhuǎn)基因植株中的過量表達(dá)能不同程度地增強(qiáng)植物對逆境脅迫的抵抗能力。如Mn-SOD基因的過表達(dá)增強(qiáng)了煙草SOD活性，從而提高了其冷害的耐受性和下一年的產(chǎn)量[13]。將Mn-SOD轉(zhuǎn)到煙草進(jìn)行過量表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草增強(qiáng)了對質(zhì)膜和光系統(tǒng)Ⅱ的保護(hù)作用和對除草劑引起的氧脅迫的耐受性[14]。將怪柳的Mn-SOD基因轉(zhuǎn)入棉花中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在干旱條件下轉(zhuǎn)基因棉花SOD活性、脯氨酸和可溶性糖含量均明顯提高，而且凈光合和生物量也提高了[15]。但也有研究表明SOD過量表達(dá)并未提高植株的抗氧化能力，如Mn-SOD在苜蓿葉綠體和線粒體中同時(shí)過量表達(dá)時(shí)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與非轉(zhuǎn)基因苜蓿相比，轉(zhuǎn)基因苜蓿并沒有提高芽和貯藏器官的生物量[16]?？梢?，單獨(dú)過量表達(dá)Mn-SOD基因，使植物增強(qiáng)在抗氧化系統(tǒng)以及植物抗逆性方面的效果往往是有限的。植物的生長發(fā)育和生命周期是基因差異表達(dá)的結(jié)果，通過啟動(dòng)子順式作用元件和轉(zhuǎn)錄因子相互協(xié)調(diào)作用，進(jìn)而調(diào)控基因在特定的時(shí)空或環(huán)境條件下的表達(dá)[17]。因此，鑒定SOD基因自身啟動(dòng)子的功能并應(yīng)用于遺傳轉(zhuǎn)化，將為植物的抗逆性研究提供良好的基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果表明，龍眼Mn-SOD基因4個(gè)不同啟動(dòng)子缺失片段啟動(dòng)GUS基因的能力均低于CaMV35S啟動(dòng)子，但均可啟動(dòng)GUS基因的表達(dá)。瞬時(shí)表達(dá)和定量表達(dá)結(jié)果均顯示3'缺失MSD- pro4（-669～-268 bp）比5'缺失的MSD-pro1（-669～-1 bp）、MSD-pro2（-432～-1bp）和MSD-pro3（-267～-1 bp）啟動(dòng)GUS基因的能力強(qiáng)，而此區(qū)段（-669～-268 bp）內(nèi)含有ARE、as-2-box、-MBS、Box-W1、AT-rich element、circadian等元件，說明這些元件中有可能存在具有提高基因轉(zhuǎn)錄水平的重要的順式調(diào)控元件；也可能是由于缺失的區(qū)段（-267～-1bp）中含有一些負(fù)調(diào)控元件，因此，3'端缺失的MSD-pro4啟動(dòng)GUS活性的能力最強(qiáng)。

MSD-pro3（-267～-1 bp）的啟動(dòng)子片段長度最短且活性最弱，可能是由于該區(qū)段中缺失了一些重要的表達(dá)因子；并且該區(qū)段內(nèi)含有干旱響應(yīng)元件MBS、光響應(yīng)元件MRE、GAG-motif[3]，也可能是因?yàn)樵搮^(qū)段內(nèi)存在負(fù)調(diào)控作用元件。定量結(jié)果顯示，Mn-SOD基因在多種光質(zhì)處理下的表達(dá)受到抑制，提示Mn-SOD基因中的光響應(yīng)元件（MRE、GAG- motif）可能是負(fù)調(diào)控元件，進(jìn)而導(dǎo)致MSD-pro3（-267～-1 bp）的啟動(dòng)活性最弱。

此外，本研究中龍眼Mn-SOD啟動(dòng)子片段僅700 bp，其長度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于啟動(dòng)子的有效功能區(qū)域（>2 000 bp），而龍眼基因組數(shù)據(jù)的公布[18]，將為進(jìn)一步對Mn-SOD啟動(dòng)子功能的鑒定提供基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步探究龍眼Mn-SOD基因的抗逆功能奠定基礎(chǔ)。

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