張宇潔 王麗軍 關(guān)波

摘要[目的]通過可培養(yǎng)的方式從泡菜中分離和篩選產(chǎn)轉(zhuǎn)糖基活性β半乳糖苷酶（βgal）的菌株。[方法]以乳糖為唯一碳源，CaCO3溶鈣圈和添加XGal的MRS篩選平板進(jìn)行初篩，再通過oNPG法測(cè)定菌株βgal活性進(jìn)行復(fù)篩，最后以粗酶液催化乳糖進(jìn)行轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)，通過TLC分析確認(rèn)轉(zhuǎn)糖基活性。[結(jié)果]通過3級(jí)篩選，得到具有轉(zhuǎn)糖基活性βgal的菌株6株。結(jié)合其形態(tài)學(xué)、生理生化特征及16S rDNA序列同源性分析，確定篩選獲得產(chǎn)轉(zhuǎn)糖基活性βgal菌株中，5株為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum），1株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。[結(jié)論]該研究可為以乳糖為底物高效合成功能性的低聚半乳糖提供新的酶源。

關(guān)鍵詞泡菜;β-半乳糖苷酶;轉(zhuǎn)糖基活性;乳酸桿菌;系統(tǒng)發(fā)育

中圖分類號(hào)TS255.53文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2018）25-0159-03

Screening and Identification of Strains Producing βgalactosidase with Transgalactosylation Activity from the Pickles of Hui in Xinjiang

ZHANG Yujie，WANG Lijun，GUAN Bo et al

（School of Food Science， Shihezi University，Shihezi， Xinjiang 832002）

Abstract[Objective]To isolate and screen the strains producing transglycosylated active βgalactosidase（βgal） from pickles by culturable methods. [Method]With lactose as the only carbon source， CaCO3 calcium solution and XGal MRS screening plate were screened， and the activity of strain βgal was rescreened by oNPG method. Finally， the glycosyl reaction was catalyzed by crude enzyme solution， and the activity of glycosyl group was confirmed by TLC analysis. [Result]A total of 6 strains of transglycosyl activated βgal were obtained by three stage screening. According to its morphological， physiological and biochemical characteristics and the homology analysis of 16S rDNA sequence， 5 strains of Lactobacillus fermentum and 1 strain of Lactobacillus plantarum were selected and obtained. [Conclusion]This study provides a new enzyme source for the efficient synthesis of functional Galacto oligosaccharides based on lactose.

Key wordsPickles;βgalactosidase;Transglycosylation activity;Lactobacillus;Phylogeny

β-半乳糖苷酶（β-半乳糖苷半乳糖水解酶，EC 3.2.1.23;βgal）能水解多糖或寡糖中的β-半乳糖苷鍵，一些β-半乳糖苷酶也能催化轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)[1]。該酶可有效解決乳糖不耐癥問題。乳酸菌來(lái)源的β-半乳糖苷酶是胞內(nèi)酶，最適pH接近中性（pH 6.5 ～ 7.5），尤其適用于牛乳和乳清中乳糖的水解。乳酸菌作為β-半乳糖苷酶的來(lái)源，具有多種重要生理功能，作為食品級(jí)微生物，應(yīng)用于食品工業(yè)具有“先天優(yōu)勢(shì)”，更容易被消費(fèi)者接受。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，乳酸菌來(lái)源的β-半乳糖苷酶主要合成β（1→3）和β（1→6）等鍵型結(jié)構(gòu)的低聚糖，應(yīng)用于功能性低聚糖的生產(chǎn)比目前商業(yè)化的半乳寡聚糖[主要是β（1→4）鍵型]更易被腸道微生物所利用，具有更好的益生效果[2]。

目前為止，盡管具有轉(zhuǎn)半乳糖基活性β-半乳糖苷酶的微生物來(lái)源廣泛，但在食品工業(yè)獲得批準(zhǔn)使用并實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的只有米曲霉和克魯維酵母菌屬等少數(shù)微生物[3-4]。因此尋找安全性更好、酶學(xué)性質(zhì)更穩(wěn)定，并具有一定生物技術(shù)特性的β-半乳糖苷酶成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。筆者對(duì)新疆回民自制酸泡菜中產(chǎn)轉(zhuǎn)糖基活性乳糖酶的菌株進(jìn)行了分離和鑒定，并對(duì)其乳糖酶的轉(zhuǎn)糖基活性進(jìn)行了初步分析。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料。

該試驗(yàn)所用泡菜取自新疆焉耆地區(qū)回民傳統(tǒng)手工酸白菜。

1.1.2培養(yǎng)基。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉浸膏10 g/L，酵母浸膏5 g/L，葡萄糖20 g/L，吐溫-80 1 mL/L，K2HPO4 2 g/L，醋酸鈉5 g/L，檸檬酸二銨2 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，MnSO4·4H2O 0.05 g/L，瓊脂15 g/L（pH 6.2～6.4）。PY基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物10 g/L，鹽溶液40 mL/L。明膠基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蛋白胨5 g/L，牛肉膏 3 g/L，明膠120 g/L，pH 7.0～7.2。硫酸亞鐵半固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉浸粉3 g/L，酵母提取物3 g/L，硫酸亞鐵0.2 g/L，硫代硫酸鈉0.3 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂粉12 g/L，調(diào)pH 7.4 。

1.2方法

1.2.1產(chǎn)βgal菌株的分離、初篩及純化。

取泡菜樣品適量于滅菌生理鹽水中，37 ℃搖床2 h。用已滅菌的生理鹽水稀釋，選3個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度取0.1 mL菌種稀釋液，分別滴加到含2%碳酸鈣的MRS平板上涂布，37 ℃培養(yǎng)24 h。接種環(huán)挑取溶鈣圈單菌落于含XGal的篩選平板上劃線分離，37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取藍(lán)色單菌落于MRS平板上劃線純化，37 ℃培養(yǎng)24 h。

1.2.2βgal酶活的測(cè)定。

1.2.2.1oNP標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。取oNP標(biāo)準(zhǔn)品配制成1 mmol/L（1 μmol/mL）oNP母液，用pH 7.0的磷酸緩沖液稀釋，每毫升分別含oNP 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、014 μmol，以pH 7.0的磷酸緩沖液為空白，測(cè)波長(zhǎng)420 nm處吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2βgal酶活力的計(jì)算。50 μL oNPG溶液（50 mmol/L pH 6.5）加入酶標(biāo)板小孔中，再加入50 μL的粗酶液，于37 ℃下反應(yīng)10 min，加入200 μL 0.5 mol/L的碳酸鈉溶液終止反應(yīng)，于420 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。

1.2.3βgal轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)的TLC。

1.2.3.1轉(zhuǎn)糖基試驗(yàn)。取500 μL用磷酸緩沖液（50 mmol/L pH 6.5）配制的20%乳糖溶液置于離心管中，水浴預(yù)熱至37 ℃后加入1 mL粗酶液，37 ℃反應(yīng)24 h后，沸水浴滅酶10 min，將樣品用無(wú)水乙醇稀釋至濃度為1 mg/mL。通過TLC分析低聚糖產(chǎn)量。

1.2.3.2TLC檢測(cè)。取活化過的硅膠G玻璃板一塊，用微量進(jìn)樣器點(diǎn)樣，注意設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)糖對(duì)照，用量約為毛細(xì)管1/3，上展層劑使用氯仿、冰乙酸和水的混合物（氯仿∶冰乙酸∶水=30∶35∶5），層析1 h，取出晾干后噴霧顯色劑，置于烘箱中，85 ℃烘烤10 min，觀察層析板上顯現(xiàn)的不同顏色并比較，初步確認(rèn)轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物，從而獲得產(chǎn)轉(zhuǎn)糖基活性乳糖酶的菌株。

1.2.4產(chǎn)βgal菌株的鑒定[5]。

1.2.4.1菌株的形態(tài)特征。接菌于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形狀、色澤、透明度等培養(yǎng)特征。挑取少許菌體進(jìn)行革蘭氏染色觀察。

1.2.4.2

產(chǎn)βgal菌株的生理生化特性。過氧化氫酶試驗(yàn);糖發(fā)酵試驗(yàn);明膠液化試驗(yàn);淀粉水解試驗(yàn);硫化氫試驗(yàn)。

1.2.4.3產(chǎn)βgal菌株的分子鑒定。采用尿素法提取產(chǎn)酶菌株的基因組DNA[1]。采用16S rRNA基因通用引物27f和1492r擴(kuò)增菌株的16S rDNA。將擴(kuò)增PCR產(chǎn)物回收后與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。序列比較分析建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

2結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)βgal菌株的形態(tài)特征

從傳統(tǒng)回民自制泡菜中分離純化的菌株均為桿狀，形成乳白色、圓形菌落，形態(tài)如圖1b所示，在添加CaCO3的MRS平板上菌落周圍具有明顯的溶鈣圈（圖1a），革蘭氏染色呈陽(yáng)性（圖1d），初步表明分離純化的菌株應(yīng)為乳酸菌菌株。將純化獲得的乳酸菌菌株接種到添加XGal的MRS平板上進(jìn)行初篩，菌落變藍(lán)則表明篩選獲得的乳酸菌菌株能夠產(chǎn)乳糖酶（圖1c）。該研究共篩選獲得產(chǎn)βgal菌株25株。

2.2產(chǎn)βgal菌株酶活的測(cè)定

2.2.1

oNP標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

以每毫升oNP的濃度為橫坐標(biāo)，以波長(zhǎng)420 nm處測(cè)得的吸光度為縱坐標(biāo)，得到oNP標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示。

2.2.2產(chǎn)βgal菌株的酶活。

采用oNPG法測(cè)定25株產(chǎn)酶菌株的酶活，25株初篩菌株的乳糖酶酶活見表1。從表1中可知，在相同培養(yǎng)基、接種量、培養(yǎng)溫度37 ℃及培養(yǎng)36 h后不同菌株所得粗酶液的酶活最低為2.799 U/mL（PC-25），最高為26.289 U/mL（PC-17）。

2.3產(chǎn)βgal菌株粗酶液以乳糖為底物的TLC分析

對(duì)相同條件下處理的樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)，通過TLC分析其產(chǎn)物如圖3所示。得到6株具有轉(zhuǎn)糖基活性的菌株，分別為PC-2、PC-4、PC-5、PC-8、PC-9、PC-10。

2.4產(chǎn)轉(zhuǎn)糖基活性βgal菌株的生理生化特性

菌株的生理生化鑒定結(jié)果顯示，6株菌均能發(fā)酵葡萄糖、乳糖，4號(hào)菌還可以發(fā)酵蔗糖、麥芽糖、甘露糖，6株菌均不能發(fā)酵阿拉伯糖、鼠李糖，且淀粉水解試驗(yàn)、明膠水解試驗(yàn)、硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)均為陰性，表明6株菌株在代謝過程中均不能分泌產(chǎn)生淀粉酶和尿素酶來(lái)降解大分子物質(zhì)，也不能產(chǎn)過氧化氫和硫化氫。這些特征與乳酸桿菌的特征極為相似，綜上初步斷定6株菌為乳桿菌。

2.5序列分析

以篩選獲得的具有轉(zhuǎn)糖基活性乳糖酶菌株的16S rDNA序列與BLAST比對(duì)獲得的具有相似性的16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），表明篩選獲得的產(chǎn)轉(zhuǎn)糖基活性乳糖酶的菌株均為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）菌株，其中5株為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum），1株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

3討論

該試驗(yàn)以新疆回民自制酸泡菜為研究材料，利用CaCO3溶鈣圈和添加XGal的MRS篩選平板進(jìn)行初篩獲得產(chǎn)乳糖酶的疑似乳酸菌菌株25株;以濃度20%的乳糖為轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)底物與適量粗酶液反應(yīng)，產(chǎn)物采用TLC技術(shù)鑒定，獲得產(chǎn)轉(zhuǎn)糖基活性乳糖酶的菌株6株。采用革蘭氏染色、糖發(fā)酵試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、16S rDNA序列技術(shù)等7種方法對(duì)菌株進(jìn)行了鑒定，得出了產(chǎn)轉(zhuǎn)糖基活性乳糖酶菌株的種屬關(guān)系，確定其中5株為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum），1株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

目前，產(chǎn)低聚半乳糖微生物酶的使用是國(guó)際半乳寡聚糖生產(chǎn)的趨勢(shì)，現(xiàn)已有多種不同的產(chǎn)轉(zhuǎn)糖基化β-半乳糖苷酶微生物的研究，并且還在發(fā)展和尋找新的微生物酶源[6]。乳桿菌屬于益生菌，其廣泛存在于動(dòng)物腸道、含碳水化合物的動(dòng)植物發(fā)酵制品中，過去人們更加注意乳酸桿菌和雙歧桿菌對(duì)乳糖水解活性的研究，而對(duì)轉(zhuǎn)糖基活性提高發(fā)酵乳制品質(zhì)量的研究很少。近年來(lái)，雙歧桿菌及乳桿菌來(lái)源的轉(zhuǎn)糖基活性β-半乳糖苷酶由于具有獨(dú)特的轉(zhuǎn)糖基特性，逐漸受到關(guān)注[7-10]。該研究篩選的產(chǎn)轉(zhuǎn)糖基活性β-半乳糖苷酶的植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌，為以乳糖為底物高效合成功能性的低聚半乳糖提供了新的酶源。

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