袁宗勝

摘要[目的]研究促生內(nèi)生細(xì)菌對毛竹葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響。[方法]通過竹腔注射的方法，將促生內(nèi)生細(xì)菌菌株CT-B09-2、JL-B06、WYS-A01-1接種至 Ⅱ 度毛竹，測定毛竹葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化。[結(jié)果]促生內(nèi)生細(xì)菌能夠提高毛竹葉片最小初始熒光（F0），增加毛竹葉片葉綠素含量，提高毛竹的光合作用速率、暗適應(yīng)葉片最大熒光（Fm）、傳遞給PS Ⅱ的電子數(shù)量、可變熒光（FV）、PS Ⅱ潛在活性（FV/F0）、PS Ⅱ反應(yīng)活性、原初光能轉(zhuǎn)化效率（FV/Fm）、葉片的光能轉(zhuǎn)換效率。[結(jié)論]該研究可為促生微生物菌劑的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞毛竹；促生；內(nèi)生細(xì)菌；葉綠素?zé)晒?/p>

中圖分類號S795文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2018）25-0103-03

Abstract[Objective]To study the effects of growthpromoting endophytic bacteria on chlorophyll fluorescence parameters of moso bamboo leaves. [Method] By using the method of bamboo cavity injection， the endophytic bacteria CTB092， JLB06 and WYSA011 were inoculated to Ⅱdegree bamboo to measure the changes of chlorophyll fluorescence parameters.[Result]The endophytic bacteria could improve minimum initial fluorescence（F0）of bamboo leaves， increase the chlorophyll content of bamboo leaves and improve the photosynthetic rate of bamboo， they could improve the dark adaptation blade maximum fluorescence （Fm）， increase the number of electrons passed to PSⅡ， they could improve variable fluorescence （FV）， improve PSⅡ potential activity （FV/F0）， and improve PSⅡ reaction activity of bamboo leaves. They also improve the initial light energy conversion efficiency （FV/Fm）， improve the efficiency of light energy conversion of bamboo leaves. [Conclusion]The study provides a theoretical basis for the development of growthpromoting microbial inoculants.

Key wordsMoso bamboo；Growthpromoting；Entophytic bacteria；Chlorophyll fluorescence

毛竹是我國南方重要的森林資源，根據(jù)第6次森林資源清查統(tǒng)計，我國毛竹林面積約為337.20萬hm2，約占世界竹林面積的47%。對毛竹的研究多集中在豐產(chǎn)理論、土壤理化性質(zhì)、物種多樣性等方面[1-3]。內(nèi)生細(xì)菌能在植物體內(nèi)長期定殖、傳導(dǎo)，且不易受環(huán)境條件的影響，對植物生長發(fā)育、抵抗疾病及不良環(huán)境具有廣泛的生物學(xué)作用[4]。人們從番茄、黃瓜、玉米、水稻、棉花等多種植物中分離出的內(nèi)生細(xì)菌已超過54屬129種，其分布在植物所有組織中[5-8]，是非常難得的天然生物資源。加強(qiáng)植物內(nèi)生細(xì)菌資源研究，建立各種功能內(nèi)生細(xì)菌的資源庫具有重要的意義[9-11]。

筆者選用從毛竹體內(nèi)分離并篩選出的具有高效解磷解鉀固氮功能的促生內(nèi)生細(xì)菌菌株CT-B09-2、JL-B06、WYS-A01-1[12]，通過竹腔注射的方式接種 Ⅱ 度毛竹，初步探討促生內(nèi)生細(xì)菌對毛竹葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響，為微生物菌劑的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1供試菌株

促生內(nèi)生細(xì)菌菌株CT-B09-2、JL-B06、WYS-A01-1，是由福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心實驗室從毛竹體內(nèi)分離并篩選出的，具有高效解磷解鉀固氮功能[12]。

1.2培養(yǎng)基

內(nèi)生菌培養(yǎng)采用NA培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、瓊脂18 g、水1 000 mL，pH 7.0～7.2（液體培養(yǎng)基則不加瓊脂）。

1.3促生內(nèi)生細(xì)菌懸浮液制備

將篩選出的促生內(nèi)生細(xì)菌菌株CT-B09-2、JL-B06、WYS-A01-1分別接種于NA液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min 條件下振蕩培養(yǎng) 72 h，用無菌水稀釋制成濃度為1×108 CFU/mL 的懸浮液。

1.4竹腔注射法接種Ⅱ度毛竹

在福建省毛竹林中心產(chǎn)區(qū)[13]將樂縣龍棲山自然保護(hù)區(qū)毛竹林基地，選擇立地條件、毛竹林分等相對一致的成片毛竹林地，選?、蚨让?，先用電鉆在距土表30 cm左右的竹稈部位鉆孔，然后取上述內(nèi)生細(xì)菌懸浮液50 mL用無菌注射器注射至毛竹竹腔內(nèi)部，第2天重復(fù)接種50 mL，用泥土封住竹腔孔洞并做好標(biāo)記。每處理 100 株，以清水為對照。并于15、30、60、90 d對 Ⅱ 度毛竹葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)進(jìn)行測定。

1.5毛竹葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定

葉綠素?zé)晒鈪?shù)用于描述光合作用和光合生理狀況或常量的機(jī)制，反映植物“內(nèi)在”的特征變量，葉綠素?zé)晒鈪?shù)的分析在測定葉片光合作用中光系統(tǒng)對光能的吸收、傳遞、耗散、分配等方面具有獨(dú)特的作用。

采用捷克PSI公司生產(chǎn)的Handy FluorCam熒光成像儀進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定，先調(diào)整好成像儀攝像頭的位置，再調(diào)整聚焦使其能夠拍攝到清晰的圖像，所選模式為Quenching，測定前需預(yù)熱20 min。將完整毛竹葉片暗適應(yīng)30 min后測定葉綠素?zé)晒鈪?shù)。

1.5.1F0。F0表示最小初始熒光，是指經(jīng)過充分暗適應(yīng)的光合機(jī)構(gòu)光系統(tǒng)Ⅱ（PS Ⅱ）反應(yīng)中心全部開放時葉綠素?zé)晒獍l(fā)射強(qiáng)度。多數(shù)研究人員認(rèn)為，該值與葉片葉綠素含量有關(guān)，F(xiàn)0越高表明葉片中葉綠素含量越高，光合作用越強(qiáng)[14]。

1.5.2Fm。

Fm表示暗適應(yīng)葉片最大熒光，是指經(jīng)過充分暗適應(yīng)的光合機(jī)構(gòu)光系統(tǒng)Ⅱ（PS Ⅱ）反應(yīng)中心全部關(guān)閉時葉綠素?zé)晒獍l(fā)射強(qiáng)度[14]，可以反映出通過PS Ⅱ的電子傳遞情況，F(xiàn)m越大表明傳遞給PS Ⅱ的電子越多，最終導(dǎo)致光合產(chǎn)物越多。

1.5.3FV。

FV為可變熒光，指的是黑暗中最大可變熒光強(qiáng)度，反映了Qa，即 PS Ⅱ原初電子受體的還原情況[14]。

1.5.4FV/F0。

FV/F0代表PS Ⅱ的潛在活性[14]，其值越大表明PS Ⅱ反應(yīng)活性越高，光合作用越強(qiáng)。

1.5.5FV/Fm。

FV/Fm表示PS Ⅱ原初光能轉(zhuǎn)換效率[14]，該值越高表明其發(fā)生光抑制的程度越低，具有較高的光能轉(zhuǎn)換效率。

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計用Excel，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用 DPS（V7.05）的相應(yīng)分析功能進(jìn)行。

2結(jié)果與分析

2.1促生內(nèi)生細(xì)菌對毛竹葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)（F0）的影響

促生內(nèi)生細(xì)菌菌株CT-B09-2、JL-B06、WYS-A01-1竹腔注射接種處理 Ⅱ 度毛竹15、30、60、90 d后其葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)F0均呈上升的趨勢，其中促生內(nèi)生細(xì)菌菌株JL-B06接種處理15 d時葉綠素?zé)晒鈪?shù)F0值顯著高于對照，促生內(nèi)生細(xì)菌菌株CT-B09-2接種處理60 d時葉綠素?zé)晒鈪?shù)F0值顯著高于對照（表1）。促生內(nèi)生細(xì)菌接種處理后毛竹葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)F0值的提高初步表明毛竹葉片中葉綠素含量增加。

2.2促生內(nèi)生細(xì)菌對毛竹葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)（Fm）的影響

促生內(nèi)生細(xì)菌菌株CT-B09-2、JL-B06、WYS-A01-1竹腔注射接種處理 Ⅱ 度毛竹后其葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fm均呈上升的趨勢，其中促生內(nèi)生細(xì)菌菌株JL-B06接種處理15 d時葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fm值顯著高于對照，促生內(nèi)生細(xì)菌菌株接種處理30、60、90 d時毛竹葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fm均有所提高（表2），但差異不顯著。促生內(nèi)生細(xì)菌菌株接種處理后毛竹葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fm值的提高表明傳遞給PS Ⅱ的電子增多。

2.3促生內(nèi)生細(xì)菌對毛竹葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)（FV）的影響

經(jīng)促生內(nèi)生細(xì)菌菌株CT-B09-2、JL-B06、WYS-A01-1竹腔注射接種處理Ⅱ度毛竹后其葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)FV值有所提高，其中促生內(nèi)生細(xì)菌菌株JL-B06接種處理15 d時葉綠素?zé)晒鈪?shù)FV值顯著高于對照（表3）。促生內(nèi)生細(xì)菌菌株接種處理30、60、90 d時毛竹葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)FV均有所提高。

2.4促生內(nèi)生細(xì)菌對毛竹葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)（FV/F0）的影響

經(jīng)促生內(nèi)生細(xì)菌CT-B09-2、JL-B06及WYS-A01-1處理 Ⅱ度毛竹后其葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)FV/F0的變化與對照處理變化相似，呈現(xiàn)平穩(wěn)上升的趨勢，內(nèi)生細(xì)菌CT-B09-2、JL-B06及WYS-A01-1處理15、30、60和90 d后的毛竹葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)FV/F0均高于對照（表4），其中促生內(nèi)生細(xì)菌CT-B09-2、JL-B06及WYS-A01-1接種處理60 d時FV/F0均高于對照。研究結(jié)果表明促生內(nèi)生細(xì)菌菌株接種后可以提高毛竹葉片PS Ⅱ反應(yīng)活性，從而提高光合作用強(qiáng)度。

2.5促生內(nèi)生細(xì)菌對毛竹葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)（FV/Fm）的影響

經(jīng)促生內(nèi)生細(xì)菌CT-B09-2、JL-B06及WYS-A01-1處理Ⅱ度毛竹后其葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)FV/Fm的變化與對照變化相似，呈現(xiàn)平穩(wěn)上升的趨勢，內(nèi)生細(xì)菌CT-B09-2、JL-B06及WYS-A01-1處理15、30、60和90 d后毛竹葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)FV/Fm均略高于對照（表5），但差異不顯著。研究結(jié)果表明，促生內(nèi)生細(xì)菌菌株接種后可以進(jìn)一步提高毛竹葉片的光能轉(zhuǎn)換效率。

3結(jié)論與討論

促生內(nèi)生細(xì)菌菌株能夠提高毛竹葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)F0、Fm、FV、FV/F0、FV/Fm，初步表明促生內(nèi)生細(xì)菌可以增加毛竹葉片葉綠素含量，提高暗適應(yīng)葉片最大熒光、傳遞給PS Ⅱ的電子數(shù)量、可變熒光、PS Ⅱ潛在活性、毛竹葉片PS Ⅱ反應(yīng)活性、原初光能轉(zhuǎn)化效率、葉片的光能轉(zhuǎn)換效率。

筆者通過竹腔注射的方式分別接種3種促生內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵菌液，研究了單個內(nèi)生細(xì)菌菌株對毛竹葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響，下一步應(yīng)對微生物菌液的其他接種方式、復(fù)合微生物菌液的協(xié)同作用機(jī)理等進(jìn)行研究，從而使內(nèi)生細(xì)菌在農(nóng)業(yè)豐產(chǎn)增收中發(fā)揮重要的作用。

目前越來越受到人們重視的生物有機(jī)肥或生物菌肥等的目標(biāo)菌種多從土壤中篩選而來，而內(nèi)生菌可以主動從植物體表進(jìn)入植物體內(nèi)，并能夠長期在植物體內(nèi)定殖[15]，因此內(nèi)生細(xì)菌作為重要的微生物資源在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有良好的研究和開發(fā)潛力。加強(qiáng)植物內(nèi)生細(xì)菌資源的研究，建立各種功能內(nèi)生細(xì)菌的資源庫具有重要的意義。

參考文獻(xiàn)

[1] 黃啟堂，陳愛玲，賀軍.不同毛竹林林地土壤理化性質(zhì)特征比較[J].福建林學(xué)院學(xué)報，2006，26（4）：299-302.

[2] 高志勤，傅懋毅.不同毛竹林土壤碳氮養(yǎng)分的季節(jié)變化特征[J].浙江林學(xué)院學(xué)報，2006，23（3）：248-254.

[3] 張剛?cè)A，蕭江華，聶潔珠，等.不同類型毛竹林植物物種多樣性研究[J].林業(yè)科學(xué)研究，2007，20（5）：615-621.

[4] RYAN R P，GERMAINE K，F(xiàn)RANKS A，et al.Bacterial endophytes：Recent developments and application[J].FEMS Microbiol Lett，2008，278（1）：1-9.

[5] BERG G，KRECHEL A，DITZ M，et al.Endophytic and ectophytic potatoassociated bacterial communities differ in structure and antagonistic function against plant pathogenic fungi[J].FEMS Microbiology Ecology，2005，51（2）：215-229.

[6] MANO H，TANAKA F，WATANABE A，et al.Culturable surface and endophytic bacterial flora of the maturing seeds of rice plants（Oryza sativa）cultivated in a paddy field[J].Microb Environ，2006，21（2）：86-100.

[7] GARDNER J M，F(xiàn)ELDMAN A W，ZABLOTOWICZ R M.Identity and behavior of xylemresiding bacterian in rough lemon roots of florida citrus trees[J].Applied and environmental microbiology，1982，43（6）：1335-1342.

[8] 徐亞軍.植物內(nèi)生菌資源多樣性研究進(jìn)展[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，38（24）：149-152.

[9] 王紀(jì)杰，徐秋芳，姜培坤.毛竹凋落物對闊葉林土壤微生物群落功能多樣性的影響[J].林業(yè)科學(xué)，2008，44（9）：146-151.

[10] MITTLER R，HERR E H，ORVAR B L，et al.Transgenic tobacco plants with reduced capability to detoxify reactive oxygen intermediates are hyperresponsive to pathogen infection[J].Prce Natl Acad Sei，1999，96（24）：14165-14170.

[11] MELNICK R L，ZIDACK N K，BAILEY B A，et al.Bacterial endophytes：Bacillus spp.from annual crops as potential biological control agents of black pod rot of cacao[J].Biol Cont，2008，46（1）：46-56.

[12] YUAN Z S，LIU F，ZHANG G F.Characteristics and biodiversity of endophytic phosphorusand potassiumsolubilizing bacteria in Moso Bamboo（Phyllostachys edulis）[J].Acta biologica of hungaria，2015，66（4）：465-475.

[13] 福建省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局.毛竹林豐產(chǎn)培育技術(shù)規(guī)程：DB 35/T 1194—2011[S].福建省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局，2011.

[14] 張守仁.葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)參數(shù)的意義及討論[J].植物學(xué)通報，1999，16（4）：444-448.

[15] 盧鎮(zhèn)岳，楊新芳，馮永君.植物內(nèi)生細(xì)菌的分離、分類、定殖與應(yīng)用[J].生命科學(xué)，2006，18（1）：90-94.