羅其勇

摘要綜述了水體中重金屬對(duì)魚類氧化脅迫的影響，介紹魚類在受到重金屬暴露后機(jī)體組織總抗氧化酶（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）、谷胱甘肽還原酶（GR）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）活性變化以及谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）含量變化來反映其受到重金屬毒性作用情況，以期通過監(jiān)測(cè)魚體內(nèi)抗氧化物質(zhì)的變化來反應(yīng)水體中重金屬的污染情況，也為魚類養(yǎng)殖的水體條件監(jiān)測(cè)提供參考資料。

關(guān)鍵詞重金屬；活性氧；氧化脅迫；魚

中圖分類號(hào)S912文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2018）25-0032-04

Research Progress on Oxidative Stress Reaction of Fish Body Caused by Heavy Metals

LUO Qiyong1，2

（1.Guangxi University of Science and Technology， Liuzhou ， Guangxi 545006； 2. Key Laboratory of Freshwater Fish Reproduction and Development， Ministry of Education；School of Life Science， Southwest University， Chongqing 400715）

AbstractEffect of heavy metals in water on oxidative stress of fish was reviewed . The antioxidants would change， such as total antioxidant enzymes （TAOC）， and superoxide dismutase （SOD）， catalase （CAT）， glutathione transferase （GST）， glutathione reductase （GR）， glutathione peroxidase （GPx） activity and content of glutathione （GSH）， malondialdehyde （MDA）， it would reflect the toxic when fish were exposed by heavy metals. It can reflect the pollution of heavy metals in the water by monitoring the change of antioxidant in the fish，and provide reference for monitoring water condition of fish culturing.

Key wordsHeavy metals；Reactive oxygen species （ROS）；Oxidative stress；Fish

重金屬及其類似物引起的水生環(huán)境污染，造成水生生物中毒效應(yīng)及其毒性作用機(jī)制一直都是國(guó)內(nèi)外水生生態(tài)環(huán)境研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[1-3]。重金屬在流入水中會(huì)經(jīng)過吸附、沉淀以及絡(luò)合等作用在水環(huán)境中不斷轉(zhuǎn)移，或被水生生物積累后隨著食物鏈逐級(jí)傳遞后放大[3]。魚類是水生生態(tài)系統(tǒng)中重要的生物，是水生食物鏈的關(guān)鍵載體，從較低營(yíng)養(yǎng)級(jí)到最高營(yíng)養(yǎng)級(jí)水平都有分布，在水生生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮至關(guān)重要作用，常被用來作為水生生態(tài)系統(tǒng)健康狀況的指示生物[4-5]。

魚體內(nèi)活性氧（Reactive oxygen species，ROS）是代謝過程中不可或缺的產(chǎn)物，通常情況活性氧的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡，而外來因素溫度、重金屬、有機(jī)污染物等影響，會(huì)打破其平衡狀態(tài)。如圖1所示，正常生理?xiàng)l件下，魚體內(nèi)ROS處于產(chǎn)生和清除動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，而外來因素影響，平衡發(fā)生改變。在魚抗氧化脅迫能力范圍，極端氧化條件會(huì)提升其體內(nèi)ROS水平，魚通過自身清除能力，回到最初氧化平衡狀態(tài)稱為“急性氧化脅迫”；一旦ROS含量超過魚體的清除能力，引起產(chǎn)生與清除狀態(tài)失衡。魚體抗氧化效率降低，使其遭受一段時(shí)間氧化脅迫才逐漸恢復(fù)到最初平衡狀態(tài)，這稱為“慢性氧化脅迫”；此外，有些條件下魚體ROS水平未能達(dá)到最初的平衡點(diǎn)，經(jīng)過調(diào)節(jié)而產(chǎn)生新的平衡點(diǎn)且處于平衡狀態(tài)，這樣的情況成為“ROS趨勢(shì)穩(wěn)定水平”[5]。當(dāng)體內(nèi)ROS水平超過魚體應(yīng)對(duì)抗氧化協(xié)調(diào)能力范圍，會(huì)引起魚體發(fā)生氧化損傷，嚴(yán)重時(shí)甚至引起死亡。

魚類對(duì)重金屬污染物敏感的特異性可作為評(píng)估污染物毒性強(qiáng)弱的關(guān)鍵因素。已有研究表明魚類對(duì)許多污染物的敏感存在物種差異性[1-3]。銅（Cu）和鋅（Zn）是魚類生長(zhǎng)代謝過程中所必需元素，在細(xì)胞生物化學(xué)反應(yīng)需要一定量Cu和Zn參與[6]，然而一旦體內(nèi)Cu、Zn含量超過魚體耐受水平會(huì)對(duì)其產(chǎn)生毒害影響[5，7]。魚鰓長(zhǎng)期與外界環(huán)境直接接觸，是水體途徑重金屬暴露最初目標(biāo)器官，Cu在鰓大量累積引起組織器官產(chǎn)生大量活性氧物質(zhì)（ROS）進(jìn)而造成機(jī)體的氧化損傷[8]。在Cu水體暴露實(shí)驗(yàn)中，黃鱸對(duì)Cu的耐受性遠(yuǎn)高于虹鱒（Oncorhynchus mykiss）和銀鯽（Carassius auratus gibelio），而銀鯽對(duì)Cu耐受性又強(qiáng)于虹鱒和鯉魚（Cyprinus carpio）[9-10]。魚類的耐受性與其組織器官應(yīng)抗氧化脅迫的能力存在極大關(guān)聯(lián)，組織器官會(huì)根據(jù)需要產(chǎn)生抗氧化物質(zhì)來清除ROS來應(yīng)對(duì)對(duì)抗氧化脅迫。

該研究主要介紹魚類應(yīng)對(duì)重金屬誘導(dǎo)的氧化脅迫產(chǎn)生和清除機(jī)制。此外，對(duì)重金屬誘導(dǎo)魚類體內(nèi)氧化脅迫的原因進(jìn)行分析，以期通過監(jiān)測(cè)生物體內(nèi)抗氧化物質(zhì)的變化情況，反應(yīng)水體中一段時(shí)間內(nèi)重金屬的污染情況，為魚類養(yǎng)殖的水體條件監(jiān)測(cè)提供參考，也為魚類受外來污染物的影響體內(nèi)抗氧化物質(zhì)的研究提供基礎(chǔ)資料。

1活性氧的種類

活性氧主要包括以下幾種物質(zhì)：超氧陰離子自由基（O2-·）、羥基自由基（hydroxyl radical，·OH）、過氧化氫[hydrogen peroxide（H2O2）]、單線態(tài)氧（singlet oxygen，1O2）等[11-12]。重金屬誘發(fā)ROS的能力常被認(rèn)為是其毒性的一種表現(xiàn)[13]，ROS是結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定活性分子，容易發(fā)生氧化反應(yīng)[14]，引起脂肪、蛋白質(zhì)以及DNA的損傷[15]，并會(huì)引起造成一系列生理功能改變以及代謝機(jī)制紊亂，對(duì)魚體傷害，甚至死亡。H2O2易與還原性金屬（Fe和Cu）發(fā)生芬頓反應(yīng)（Fenton reactions）生成羥基自由基（hydroxyl radical，·OH）[16]。Pb、Cd和Hg等金屬元素與抗氧化細(xì)胞合成抗氧化物，如谷胱甘肽、含巰基的蛋白質(zhì)等[16]。此外，重金屬會(huì)誘導(dǎo)活性氧產(chǎn)生[4，16]。需要保持ROS產(chǎn)生與清除處于平衡狀態(tài)，以防止代謝紊亂或氧化脅迫的爆發(fā)。為應(yīng)對(duì)氧化脅迫，機(jī)體需要合成各類抗氧化物質(zhì)來清除ROS，以降低其對(duì)機(jī)體的損傷作用[17]。在這些抗氧化物質(zhì)中，可以分為非酶促系統(tǒng)物質(zhì)，如：抗壞血酸、維生素E和谷胱甘肽等[18]；抗氧化酶系統(tǒng)物質(zhì)有超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽還原酶（GR）、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）和過氧化氫酶（CAT）等，其中抗氧化物質(zhì)用來應(yīng)對(duì)ROS氧化脅迫，保護(hù)組織免受ROS傷害[2，8，17]。

2活性氧的重要標(biāo)志物

2.1總抗氧化能力（T-AOC）

T-AOC常作為評(píng)估抗氧化酶系統(tǒng)功能的綜合指標(biāo)，其活性情況用來反映機(jī)體在應(yīng)對(duì)外來刺激，非酶系統(tǒng)和酶系統(tǒng)的代償能力和自由基團(tuán)的代謝狀態(tài)，也可反映非酶系統(tǒng)和酶系統(tǒng)的整體抗氧化能力的強(qiáng)弱，是反應(yīng)機(jī)體抗氧化能力的綜合性指標(biāo)。重金屬Hg暴露會(huì)造成劍尾魚（Xiphophorus helleri Heckel）鰓和肝組織中T-AOC活性分別下降39%和30%，表明重金屬暴露會(huì)降低魚體的總抗氧化能力[19]。羅非魚在投喂含有Pb的食物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腎臟，肝臟中的T-AOC活性隨著食物中鉛濃度升高呈逐漸降低[20]。以上結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論是從水體還是食物途徑重金屬暴露都會(huì)對(duì)魚體T-AOC產(chǎn)生影響，因此，T-AOC活性情況常被用來作為魚類受到重金屬脅迫應(yīng)答反應(yīng)的重要指標(biāo)。

2.2谷胱甘肽（GSH）含量變化情況

在魚體內(nèi)眾多非酶抗氧化物中，GSH是由（γ-glutamate-cysteine-glycine（γ-Glu-Cys-Gly））三種氨基通過肽鍵縮合而成的化合物，在魚體內(nèi)有廣泛的分布，尤其肝臟組織中含量最高，具有解毒和抗氧化功能是細(xì)胞應(yīng)對(duì)ROS脅迫的最重要物質(zhì)，能夠降低ROS引起的氧化損傷[21]。GSH有活躍的巰基（-SH）與重金屬有強(qiáng)烈的親和能力，形成水溶性共價(jià)化合物，通過硫醇尿酸的形式排出體外，保護(hù)細(xì)胞免受毒性傷害。牙鲆（Paralichthys olivaceus）仔魚和幼魚在Cd暴露會(huì)引起GSH含量的升高[22]，作者認(rèn)為是機(jī)體代償性機(jī)制應(yīng)對(duì)重金屬引起的氧化脅迫；羅非魚（Oreochromis niloticus）在受到5種重金屬（Cd、Cu、Cr、Pb、Zn）暴露，肝臟組織中GSH含量顯著降低，表明重金屬暴露會(huì)消耗體內(nèi)GSH來緩解重金屬引起的氧化脅迫[23]。因此，重金屬暴露引起GSH發(fā)生改變，表明GSH能對(duì)重金屬暴露做出很好的應(yīng)答反應(yīng)，因此，常常被用來作為水生生物受重金屬暴露脅迫的標(biāo)志物。

2.3谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）、谷胱甘肽還原酶（GR）和谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）活性變化情況

在谷胱甘肽（GSH）參與的氧化還原反應(yīng)過程中，涉及到許多相關(guān)酶如谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）、谷胱甘肽還原酶（GR）和谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）等。谷胱甘肽還原酶（GR）是在氧化型谷胱甘肽（GSSH）還原成還原型谷胱甘肽（GSH）過程中，以NADPH為氫供體、氧化型谷胱甘肽為氫受體的還原酶，反應(yīng)生成NADP+和還原型谷胱甘肽。GR活性的強(qiáng)弱會(huì)直接影響GSSH還原成GSH的結(jié)果。研究表明細(xì)胞中高濃度的金屬會(huì)抑制GR活性，同時(shí)使GSH含量的降低，結(jié)果導(dǎo)致組織細(xì)胞受到氧化傷害[24]。GR受重金屬的影響會(huì)表現(xiàn)出時(shí)間和濃度效應(yīng)，此外，魚類和重金屬種類的差異會(huì)引起其應(yīng)答反應(yīng)有不同表現(xiàn)。Hg累積會(huì)降低GSH水平和抑制GR活性，使抗氧化防御系統(tǒng)改變，引起組織氧化損傷[24-25]。Eroglu 等[23]研究了羅非魚在5種重金屬（Cd、Cu、Cr、Pb、Zn）暴露下，肝組織中GR活性隨著暴露時(shí)間表現(xiàn)出先升后降低的趨勢(shì)。研究者認(rèn)為GR活性降低會(huì)引起GSSG水平升高[24]，GSH應(yīng)對(duì)ROS清除是一個(gè)完整的系統(tǒng)，如果魚體酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)的調(diào)節(jié)平衡被打破，機(jī)體清除自由基和蛋白質(zhì)親和重金屬的能力就會(huì)降低，使機(jī)體清除ROS下降，造成機(jī)體氧化損傷。

GPx是由硒半胱氨酸構(gòu)成其活性中心的一種過氧化物酶，在機(jī)體內(nèi)有廣泛的分布，由GSH提供H+，以H2O2為底物，把具有氧化能力的過氧化物（有機(jī)氫過氧化物（ROOH）還原成為無毒的羥基化合物（醇（ROH）），是防止生物膜脂質(zhì)過氧化重要反應(yīng)，并使H2O2分解成H2O，GSH還原成GSSH，從而對(duì)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能起到保護(hù)作用，免受過氧化物的傷害。眾所周知，CAT也具有清除H2O2的能力，那么，GPx與CAT作用條件有何區(qū)別呢？有研究表明：只有當(dāng)細(xì)胞中H2O2變化程度較小的情況GPx優(yōu)先參與保護(hù)反應(yīng)。GPx活性變化情況與魚類、重金屬的種類以及暴露濃度及時(shí)間密切相關(guān)。矛尾復(fù)鰕虎魚（Synechogobius hasta）受到水體中Cd暴露，肝、鰓、腎組織中的GPx活性隨著暴露濃度呈逐漸降低趨勢(shì)，在0.17和0.29 mg/L兩個(gè)暴露暴露組GPx活性均顯著低于對(duì)照組[26]。食物鉛暴露也降低了羅非魚腎臟中GPx的活性[20]。而Eroglu等[23]發(fā)現(xiàn)羅非魚在Cd在1 mg/L水體暴露1、7、14 d肝組織中GPx活性被誘導(dǎo)；水體中Zn暴露30 d鯽魚（Carassius auratus）肝臟中的GPx活性也表現(xiàn)出誘導(dǎo)升高的趨勢(shì)。

谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）是一種主要在肝臟中分布的酶，具有清除過氧化物和解毒雙重功能，可以使外源或內(nèi)源的毒性分子失去活性轉(zhuǎn)變?yōu)樗苄曰衔?，完成解毒作用，因此是多種生物內(nèi)主要的Ⅱ相代謝反應(yīng)重要轉(zhuǎn)移酶。魚體組織器官GST活性變化有多種方式[2，27]。淡水鱧（C.punctatus）受CdCl2暴露96 h，肝、鰓和腎組織中的GST活性都顯著高于對(duì)照組[27]。青鳉（Japanese flounder）胚胎和仔魚受到48.1和 99.4 μg/L HgCl2短時(shí)間暴露，GST活性顯著低于對(duì)照組，GST活性的降低，認(rèn)為是由于Hg的濃度過高產(chǎn)生的不利影響已經(jīng)超過了自身的調(diào)節(jié)范圍[28]。而尼羅羅非魚3 mg/L Cd暴露在1、5、10、20和40 d肝臟中GST活性先升高后降低，作者認(rèn)為在短期內(nèi)魚體肝組織先表現(xiàn)出應(yīng)激機(jī)制，能夠?qū)d暴露作出快速應(yīng)答反應(yīng)，而長(zhǎng)期的暴露是由應(yīng)激反應(yīng)轉(zhuǎn)化為解毒機(jī)制[29]。

2.4超氧化物歧化酶（SOD）活性變化情況

超氧化物歧化酶（SOD）是清除ROS的主要酶類，在動(dòng)物、植物、微生物體內(nèi)都有廣泛的存在，能夠催化超氧陰離子與氫離子反應(yīng)，生成H2O2和O2，H2O2在CAT或GPx的作用下進(jìn)一步的分解為無毒害作用的O2和H2O[2]。但重金屬等外源因子導(dǎo)致生物體內(nèi)的超氧陰離子升高時(shí)，SOD活性常常被誘導(dǎo)，以保持細(xì)胞內(nèi)ROS清除與產(chǎn)生之間的動(dòng)態(tài)平衡[11]。但是外源因子作用已超過機(jī)體的極限水平，ROS就會(huì)在細(xì)胞內(nèi)累積，會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的氧化應(yīng)激。金魚在低濃度短期暴露時(shí)，SOD活性被誘導(dǎo)，當(dāng)暴露濃度≥0.4 mg/L，SOD活性被抑制[30]。

2.5過氧化氫酶（CAT）活性變化情況

CAT是抗氧化防御系統(tǒng)關(guān)鍵酶之一，能夠把超氧化物歧化酶（SOD）歧化產(chǎn)生超氧陰離子的產(chǎn)物H2O2催化反應(yīng)生成H2O和O2，所以通常認(rèn)為CAT與SOD一起構(gòu)成了生物體抗氧化防御系統(tǒng)的第一道防線[25，31]。機(jī)體在遭受重金屬暴露引起CAT活性變化的情況時(shí)常與SOD活性變化情況一致。水體Cd暴露矛尾復(fù)鰕虎魚肝、鰓和腎組織中CAT活性隨著暴露濃度逐漸降低，其變化趨勢(shì)與SOD的變化趨勢(shì)相同[26]。而虹鱒、鯉魚和銀鯽受銅暴露后鰓組織中CAT和SOD活性分別在3 d、12 h和24 h均表現(xiàn)出誘導(dǎo)升高的趨勢(shì)[32]。

2.6脂質(zhì)過氧化（LPO）

脂質(zhì)過氧化是生物體細(xì)胞受到氧化脅迫和損傷的標(biāo)志，在抗氧化防御系統(tǒng)中的抗氧化物質(zhì)不能夠中和ROS而引起脂膜發(fā)生過氧化[33]?；钚匝酰u基自由基·OH）很容易攻擊生物膜上的磷脂、膜受體和酶相關(guān)多不飽和脂肪酸等大分子物質(zhì)，從而引起脂質(zhì)發(fā)生過氧化生成脂質(zhì)過氧化物，如丙二醛（Malonaldehyde，MDA），影響細(xì)胞膜的通透性和流動(dòng)性，結(jié)果導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變[33]。由于MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，因此MDA含量水平常被用來反映ROS引起機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度的指標(biāo)[26]。多數(shù)研究表明重金屬暴露會(huì)引起魚類MDA含量的升高。水體中0.75 mg/L的鉛暴露會(huì)金頭鯛（Sparus aurata）肝組織中的MDA含量，表明Pb暴露會(huì)使其脂質(zhì)過氧化程度加劇[34]；牙鲆在2、4、8 mg/L 鎘暴露會(huì)引起機(jī)體MDA含量升高趨勢(shì)[22]。然而在牙鲆仔魚（Paralichthys olivaceus）和幼魚受到HgCl2暴露，其變態(tài)仔魚期和底棲仔魚時(shí)期MDA含量與對(duì)照組無明顯差異，只是在幼魚時(shí)期升高[28]。

3結(jié)語

生物體的有氧活動(dòng)中自由基的產(chǎn)生是必不可少的，處于產(chǎn)生和清除是一個(gè)持續(xù)動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。水生生物的多樣性和其生理狀態(tài)可直接反應(yīng)水體質(zhì)量情況，而水體質(zhì)量是決定魚體生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵因素。由于重金屬在魚體含量發(fā)生改變，會(huì)引起魚體ROS的產(chǎn)生提高，或降低了ROS的清除能力，或?qū)@些過程都影響，對(duì)魚體代謝的關(guān)鍵點(diǎn)和關(guān)鍵過程發(fā)生改變，擾亂魚體最初活性氧自由基的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，對(duì)其造成氧化脅迫。因此活性氧自由基的活性情況通常用來作為環(huán)境變化的標(biāo)志物，也可以用于實(shí)驗(yàn)室條件下模擬自然條件，來評(píng)估和預(yù)測(cè)自然水體受重金屬暴露而引起的水體變化情況。在本綜述中，通過概述魚體在收到重金屬暴露而引起各種組織器官的變化情況可以選作為重金屬暴露魚體變化的標(biāo)志物。其實(shí)在關(guān)于重金屬暴露引起氧化脅迫的標(biāo)志物這方面還有很多新的設(shè)想，可以從分子結(jié)構(gòu)來闡述重金屬暴露會(huì)引起活性的變化情況，更深層次的了解重金屬暴露引起魚體氧化脅迫的原因。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2018年

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