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        懸鉤子屬野生種和栽培種資源SSR引物篩選與評價

        2018-05-14 08:59:42耿佳麒,王宇航,雷蕾,孫海悅,周強,唐雪東,梁英海
        安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年6期
        關(guān)鍵詞:篩選評價

        耿佳麒,王宇航,雷蕾,孫海悅,周強,唐雪東,梁英海

        摘要 [目的]分析懸鉤子屬植物的遺傳多樣性,研究現(xiàn)存懸鉤子SSR引物的通用性。[方法]通過簡單重復(fù)序列標(biāo)記(SSR)用12份懸鉤子屬野生和栽培種類資源對40對引物進行篩選。[結(jié)果]共篩選出8對引物對全部12個樣品擴增良好,多態(tài)性比率為100%,可用于遺傳多樣性的分析。[結(jié)論]該試驗篩選的8對引物可為下一步研究提供依據(jù)。

        關(guān)鍵詞 懸鉤子;SSR引物;篩選;評價

        中圖分類號 S663.2 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611(2018)06-0083-04

        Screening and Evaluation of SSR Primers in Wild and Cultivated Species of Rubus L.

        GENG Jiaqi,WANG Yuhang,LEI Lei et al (Jilin Agricultural University, Changchun, Jilin 130118)

        Abstract [Objective]To analyze the genetic diversity of Rubus L. and study the universality of the existing SSR primers of Rubus L.. [Method]Forty pairs of primers were screened from 12 wild and cultivated species of Rubus L.by simple repeated sequence marker (SSR). [Result]8 pairs of primers were screened and amplified all 12 samples with a polymorphism ratio of 100%, which could be used for genetic diversity analysis. [Conclusion]The 8 pairs of primers in this experiment can provide the basis for further study.

        Key words Rubus L.;SSR primers;Screening;Evaluation

        懸鉤子(Rubus L.)是多年生落葉灌木植物[1],種類豐富,雜合度高,在寒帶及溫帶地區(qū)均有分布。在我國,懸鉤子屬植物有150個種以上[2]。懸鉤子屬栽培品種具有較高的經(jīng)濟價值和藥用價值,其果實可用于鮮食、加工和醫(yī)用[3-4]。

        隨著果樹分子生物技術(shù)快速發(fā)展,國內(nèi)外學(xué)者在形態(tài)學(xué)、孢粉學(xué)、細胞學(xué)以及同工酶鑒定研究基礎(chǔ)上,加大了對懸鉤子屬植物資源分子水平的研究[4],應(yīng)用分子標(biāo)記分析了懸鉤子屬植物的遺傳多樣性[5]。目前,已有利用SSR和RAPD分子標(biāo)記分析懸鉤子栽培種資源遺傳多樣性的報道[6],但對懸鉤子野生種資源的研究較少。

        懸鉤子屬樹莓屬于第三代新興小漿果[7]。在農(nóng)業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革和生態(tài)建設(shè)背景下,有必要對我國蘊藏的大量懸鉤子野生資源進行有效收集評價和開發(fā)利用,其遺傳多樣性研究是重要的基礎(chǔ)工作。由于懸鉤子屬植物類型多樣,雜合度高,可應(yīng)用SSR分子標(biāo)記開展相關(guān)研究。目前,懸鉤子屬植物SSR引物主要為蘇格蘭詹姆斯·赫頓研究所(http://www.hutton.ac.uk/)以及Graham等[8]所開發(fā)引物,這些引物是否適用于我國野生懸鉤子資源鮮見報道。該研究旨在篩選評價Graham等所開發(fā)引物,以供國內(nèi)相關(guān)研究參考,并考察相同SSR引物在不同地緣分布資源間的通用性問題,以提出懸鉤子屬植物分子水平資源研究建議。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 植物材料。植物材料有茅莓懸鉤子、庫頁懸鉤子、牛迭肚、綠葉懸鉤子、黃樹莓、黑樹莓、歐洲莓、奧瑞斯8份資源,以及于2016年于蛟河采集的野生資源牛迭肚(J-1-3)、牛迭肚(J-1-4)、牛迭肚(J-2-1)、牛迭肚(J-2-2)4份,共12份材料(表1)。取上述材料嫩葉,供提取基因組DNA。

        1.1.2 藥品。CTAB、Tris堿、氯化鈉、氫氧化鈉、β-巰基乙醇、無水乙醇、三氯甲烷、異戊醇、瓊脂糖、甲叉丙烯酰胺、過硫酸銨、TEMED、rTaq預(yù)混酶、超純水。試驗藥品購于TaKaRa公司。

        1.1.3 引物。SSR引物為Graham等[8]開發(fā)的30對引物和詹姆斯·赫頓研究所開發(fā)的10對引物,SSR引物由金唯智公司合成。

        1.2 方法

        1.2.1 DNA提取與檢測。供試材料在液氮中研磨至粉末狀,加入離心管中,采用CTAB法[9]提取12份樣品的DNA,并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其DNA質(zhì)量,用超微量分光光度計檢測DNA濃度與純度,將條帶清晰、質(zhì)量良好的DNA稀釋至20 ng/μL,-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2.2 SSR-PCR擴增。PCR所采用的體系是經(jīng)過優(yōu)化的最適體系,退火溫度為55 ℃。采用20 μL反應(yīng)體系:ddH2O 11.2 μL,上游引物0.8 μL,下游引物0.8 μL,模板DNA(DNA濃度為20 ng/μL)3 μL,TaqDNA聚合酶(5 U/L)0.2 μL,dNTP(10 mmol/L)1.2 μL,10×Buffer(含Mg2+)2 μL。95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,共30個循環(huán);72 ℃延伸5 min;4 ℃保存。

        1.2.3 PCR產(chǎn)物檢測。

        1.2.3.1 瓊脂糖凝膠電泳。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測其擴增結(jié)果,將擴增出的條帶清晰且多態(tài)性好的引物進行下一步聚丙烯酰氨凝膠電泳檢測。

        1.2.3.2 6%聚丙烯酰胺凝膠電泳。①清洗,用洗滌劑清洗玻璃板后蒸餾水沖洗干凈,用無水乙醇清潔后晾干備用;②注膠,安裝好玻璃板后,將1%瓊脂糖凝膠注入玻璃板底部,密封玻璃板,注意不要有氣泡;待膠凝固后,將配制好的聚丙烯酰胺凝膠定點緩慢注入玻璃板空隙(注入過程應(yīng)盡量避免氣泡的產(chǎn)生),插入齒梳,避免齒梳周圍產(chǎn)生氣泡,靜置50~60 min待凝膠凝固;③預(yù)電泳,凝膠凝固后,小心拔出齒梳,用電泳液沖洗膠孔;玻璃板內(nèi)槽加滿1×TBE緩沖液,外槽緩沖液加至1/3體積即可,設(shè)置電壓350 V,電流500 mA,預(yù)電泳60 min;④上樣,按照樣品∶上樣緩沖液=10∶3比例混合,待預(yù)電泳結(jié)束后進行上樣,電壓240 V,電流500 mA,電泳90 min。

        1.2.3.3 銀染。電泳結(jié)束后,取下凹型玻璃板,將凝膠留在平板玻璃上。①清洗,清水沖洗膠面30 s,蒸餾水沖洗膠面30 s;②固定,固定液沒過膠面,搖10~20 min;③洗膠,蒸餾水沖洗膠面2 min,沖洗2次,傾斜玻璃板瀝水;④染色,硝酸銀染色液沒過膠面,搖6 min;⑤洗膠,蒸餾水沖洗凝膠10 s左右,沖洗2次,取出膠板,瀝干;⑥顯色,將膠板浸于提前預(yù)冷的500 mL顯色液中,搖床搖至所有條帶出現(xiàn),即停止顯色;⑦洗膠,蒸餾水沖洗膠板2 min;⑧固定,膠板完全浸于固定液,固定10 min,清洗干凈后,瀝干水再進行拍照和后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

        1.3 統(tǒng)計分析 根據(jù)聚丙烯酰氨凝膠電泳條帶片段大小和SSR特異性條帶特點,使用GEL-PRO軟件,將同一引物相同片段大小SSR特異條帶計為1,無條帶記為0,擴增不良或非特異性條帶不計入其中,形成0-1矩陣,并用Popgene 32軟件,分析多態(tài)性位點百分比(PPB)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Neis指數(shù)(h)、Shannon指數(shù)(I)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 SSR引物篩選結(jié)果 利用40對(表2)SSR引物對12份供試材料進行SSR-PCR擴增,經(jīng)電泳檢測,共有8對SSR引物在12份資源中擴增出差異性強和多態(tài)性良好的產(chǎn)物(表2、圖1、圖2),分別為Rubus25a、Rubus110a、Rubus117a、Rubus119a、Rubus166b、Rubus167a、Rubus233a、Neb1G02,占總引物數(shù)的20%,多態(tài)性百分率為100%,這些引物可以在野生種和栽培種中擴增出條帶。Rubus123a、Rubus194h、Neb1A10、Neb1J15、Neb1k24引物,僅在茅莓懸鉤子、庫頁懸鉤子、綠葉懸鉤子中成功擴增出條帶,但是對于牛迭肚懸鉤子擴增效果較差(圖3、4)。

        2.2 引物多態(tài)性分析 所篩選出的8對引物共擴增出142條帶,平均每個引物擴增出17.75條帶。根據(jù)目的條帶大小統(tǒng)計,每個引物最多擴增出2個位點,引物Rubus110a檢測出的條帶最多為18條,Rubus25a檢測出的條帶最少為12條。全部引物的目的片段均為100~250 bp,所統(tǒng)計的條帶數(shù)目均在目的條帶上下,片段大小差異不大。

        2.3 SSR位點分析 應(yīng)用Popgene32軟件分析8對SSR引物擴增獲得的0-1矩陣數(shù)據(jù),表明每個位點的有效等位基因數(shù)(Ne)在1.600 0~1.976 7,平均等位基因數(shù)為1.766 6。Neis基因多樣性指數(shù)(h)分布在0.267 2~0.494 0,平均每個位點的Neis指數(shù)為0.399 8。所得到的Shannon指數(shù)(I)為0.417 0~0.687 1,平均值為0.579 1(表3)。

        3 討論與結(jié)論

        3.1 懸鉤子屬植物資源有待評價開發(fā)利用 我國大小興安嶺、長白山等地區(qū)蘊藏豐富的懸鉤子屬資源,但由于全球氣候變化和人為活動頻繁,樹莓資源正在嚴重流失,需要有針對性開展資源收集評價與開發(fā)利用工作,而利用分子標(biāo)記技術(shù)開展分子水平資源研究具有重要意義。Graham 所開發(fā)的SSR引物在國內(nèi)外相關(guān)研究中應(yīng)用廣泛,用于遺傳多樣性[10]、親緣關(guān)系[11]、遺傳圖譜構(gòu)建[8,12],但國外多數(shù)研究集中于栽培品種(品系),甚至只給出引物出處,未明確指明引物名稱或序列,給相關(guān)研究帶來被動局面;國內(nèi)學(xué)者也應(yīng)用這些引物開展相關(guān)分子標(biāo)記研究[13],亦主要研究樹莓栽培資源。該研究針對上述情況,評價篩選出8對SSR引物用于茅莓懸鉤子、庫頁懸鉤子、綠葉懸鉤子、牛迭肚等資源SSR-PCR擴增,可為相關(guān)資源分子水平評價提供重要數(shù)據(jù)參考。

        3.2 懸鉤子屬植物SSR引物通用性及開發(fā)利用 該研究考察了Graham等利用國外資源開發(fā)的引物在我國野生和栽培種中的通用性問題,在選用的40對SSR引物中僅篩選出8對引物用于全部供試材料,表明了不同地理分布栽培資源間,尤其栽培與野生資源間存在引物通用性,也表明了懸鉤子屬植物SSR序列進化保守性。

        目前,SSR分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛用于果樹遺傳多樣性、親緣關(guān)系和遺傳圖譜構(gòu)建研究[14-17],應(yīng)用價值較高。由于該研究僅在7個栽培和野生種共計12份資源上評價了供試引物,且僅獲得8對可在全部材料成功擴增的引物,在引物數(shù)量和資源針對性上,不能滿足未來對豐富懸鉤子屬資源收集保存評價利用工作的需要。在組學(xué)和大數(shù)據(jù)時代[2,18-20],可利用新方法新技術(shù),針對我國懸鉤子屬植物資源,開發(fā)利用分子標(biāo)記,尤其是功能分子標(biāo)記[20],支撐和促進樹莓等小漿果產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

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