儲成群 梁景文 苑婷婷

摘要[目的]測定黃顙魚/桂花魚中麻醉劑3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸鹽（MS-222） 的殘留量。[方法]采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）技術(shù)，建立了一種優(yōu)化的QuEChERS方法，快速測定黃顙魚/桂花魚中麻醉劑 MS-222的殘留。[結(jié)果]該方法簡單、快速、可靠，線性關(guān)系好，檢出限低，靈敏度高。在最優(yōu)的條件下，方法定量線性范圍為1～200 ng/mL，方法回收率為77.8%～95.8%，精密度為3.4%～5.2%。[結(jié)論]該方法為黃顙魚/桂花魚中麻醉劑MS-222殘留測定提供了參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞 HPLC-MS/MS；黃顙魚/桂花魚；MS-222；殘留

中圖分類號 S859.84 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）22-0154-03

Abstract[Objective]The research aimed to determine the residues of the anaesthetic tricaine mesilate （MS222） in Pelteobagrus fulvidraco/Mandarin fish.[Methods]The highperformance liquid chromatography tandem mass spectrometry （HPLCMS/MS） technology and an optimized QuEChERS method were established for the rapid determination of residues of MS222 in fish.[Results]This method was simple，fast，reliable，good linearity，low detection limit and high sensitivity.Under optimized conditions，the linear quantification range of the LCMS/MS method was 1-200 ng/mL.Average recovery rates were 77.8%-95.8%，RSD was 3.4%-5.2%.[Conclusion]This method could provide a reference for the determination of MS222 in fish.

Key words HPLCMS/MS；Pelteobagrus fulvidraco/Mandarin fish；MS222；Residues

黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）又稱黃骨魚、嘎魚，為鲿科黃顙魚屬，是肉食性為主的雜食性小型經(jīng)濟魚類；黃顙魚營養(yǎng)豐富、肉質(zhì)鮮嫩，具有良好的藥理作用[1]。桂花魚（Mandarin fish）又稱季花魚、鱖魚，為鮨科鱖屬，是肉食性為主的名優(yōu)魚類；桂花魚肉性味甘、平，無毒，具有補虛勞、益脾胃的功效[2]。近年來，由于它們良好的藥理功效，黃顙魚/桂花魚的養(yǎng)殖規(guī)模在不斷的擴大。

鮮活水產(chǎn)品在運輸過程中，由于應(yīng)激反應(yīng)過強會使其受到損傷甚至死亡。適當(dāng)使用漁用麻醉劑能夠使鮮活水產(chǎn)品保持安靜，降低新陳代謝，從而減少損傷，提高成活率[3-4]。3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸鹽（MS-222） 是目前廣泛使用的水產(chǎn)品麻醉劑，是美國食品藥物管理局批準(zhǔn)可用于食用魚的麻醉劑[5-7]。雖然這種藥物對人類具有明顯的安全性，但是在許多國家仍沒有允許用作獸藥[8]，這是因為如果水產(chǎn)品被宰殺之前使用了MS-222，其加工后的產(chǎn)品中可能存有殘留，攝入人體后會在人體中蓄積，并造成一定的損害[9-10]。筆者采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）技術(shù)，建立了一種優(yōu)化的QuEChERS方法，快速測定水產(chǎn)品魚體中 MS-222 的殘留，并將開發(fā)的方法用于黃顙魚/桂花魚等實際樣品中MS-222殘留的快速分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象。黃顙魚/桂花魚購自廣東省深圳市布吉水產(chǎn)批發(fā)市場。

1.1.2 主要試劑。3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品（購自Sigma-Aldrich公司，純度>98%）；甲醇（色譜純）；甲酸（色譜純）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 試驗儀器。UltiMate3000高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher公司）；串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀 API 5500 （美國SCIEX公司）；X3R高速冷凍離心機 （美國Thermo公司）；Milli-Q純水儀（美國Millipore公司）；Multi Reax振蕩器 （德國Heidolph公司）。

1.2 方法

1.2.1 對照品溶液的制備。精密稱取10.0 mg的MS-222標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成1.0 mg/mL的對照品儲備液，搖勻，即可。

1.2.2 樣品前處理。準(zhǔn)確稱取2.00 g均勻的魚肉樣品于50 mL 離心管中，加入10 mL乙腈+甲醇+水（50∶25∶25，V/V/V），旋渦振蕩15 min，5 000 r/min離心10 min，離心后吸取1 mL上層清液于自制的固相萃取柱（填料含有50 mg PSA，20 mg C18，100 mg 無水MgSO4），并通過0.22 μm有機濾膜過濾，上機測試。

1.2.3 色譜條件。色譜柱為Acquity BEH C18柱（50.0 mm×2.1 mm，1.7 μm）；進樣量為1.0 μL，流速為0.3 mL/min。柱溫為35 ℃。流動相為甲醇（A）與0.1%甲酸水（B），采用梯度洗脫（表1）。

1.2.4 質(zhì)譜條件。電噴霧離子源（ESI+）；質(zhì)譜掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；電噴霧電壓5.5 kV； 離子源溫度150 ℃，霧化溫度550 ℃，碰撞氣為高純氬氣； 碰撞氣流速9.00 mL/min。MS-222檢測離子對、錐孔電壓、碰撞能量見表2。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。精密量取對照品儲備液相應(yīng)量，然后用甲醇逐級稀釋成為10、20、50、100、200 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液，按照“1.2.3”色譜、“1.2.4”質(zhì)譜條件測定，分別進樣2 μL，記錄測定峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 檢測限和定量限的考察。將MS-222對照品逐步稀釋后進樣測定，以色譜圖中信噪比（S/N）為3時的進樣量為最低檢測限（LOD），信噪比（S/N）為10時的進樣量為最低定量限（LOQ）。

1.2.7 精密度試驗。取按“1.2.1”方法制備的對照品溶液重復(fù)進樣6次，計算峰面積的RSD值。

1.2.8 加樣回收試驗。取同一樣品6份，精密加入分別與樣品中MS-222含量相等的對照品，按“1.2.2”方法制備供試品溶液，再按“1.2.3”色譜、“1.2.4”質(zhì)譜條件測定，進樣量為2 μL，測定峰面積，計算平均回收率。

1.2.9 實際樣品中MS-222的含量測定。隨機從水產(chǎn)批發(fā)市場買來黃顙魚、桂花魚，按照“1.2.2”方法進行處理后，采用“1.2.3”“1.2.4”中HPLC-MS/MS 法進行MS-222 的含量測定，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算實際中MS-222的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系及檢出限 利用空白基質(zhì)中加入MS-222標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.2.2”步驟進行前處理，取上清液上機測試并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），依據(jù)信噪比（S/N）>3得出檢出限為1 μg/kg，信噪比（S/N）>10得出定量限為2.5 μg/kg。其線性方程和相關(guān)系數(shù)為y=7.69×104x （r=0.999 7）。

2.2 有機萃取溶劑的選擇對回收率的影響 MS-222屬于極性化合物，因此有機萃取溶劑選擇極性較強的。在魚樣品中分別添加5、10、50 ng/mL 3個濃度水平的MS-222，分別采用乙腈、甲醇、50%乙腈、50%甲醇、乙腈+甲醇+水（50∶25∶25，V/V/V）作為萃取溶劑提取樣品中的MS-222，每個添加濃度做2個平行，計算MS-222的平均回收率。由表3可知，魚樣品由乙腈+甲醇+水（50∶25∶25，V/V/V）提取時回收率最高，提取效果最好。

2.3 凈化條件對回收率的影響 PSA和C18是QuEChERS方法中凈化過程中最常用的吸附劑。PSA可以除去有機酸、脂肪酸和一些糖類等，而C18則可以吸收弱極性物質(zhì)。為了獲得最佳凈化條件，該試驗研究了不同的PSA、C18組合及配比，如表4所示。由表4可知，MS-222利用50 mg PSA+20 mg C18+100 mg MgSO4作為凈化條件時回收率最高，凈化效果最好。

2.4 洗脫溶液的選擇 選用乙酸銨緩沖液和甲酸等水相溶液為流動相，有機相選擇甲醇及乙腈來試驗比較，采用梯度洗脫優(yōu)化10.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。經(jīng)過試驗比較后，0.1%甲酸水溶液與甲醇的梯度所得靈敏度高、峰形相對較好，基線低，信噪比等都達(dá)到要求。如圖2所示，目標(biāo)峰在2.5 min出峰，分離良好，峰形尖銳且對稱。

2.5 振蕩時間對回收率的影響 在魚樣品中分別添加5.0、10.0、50.0 ng/mL 3個濃度水平的MS-222，分別振蕩5、15、30、60 min提取樣品中的MS-222，每個添加濃度做2個平行，計算MS-222的平均回收率。由表5可知，魚樣品振蕩時間越長，回收率越高，但在振蕩15 min后回收率增加不大。考慮到在實際檢測過程中的檢測效率問題及回收率，試驗前處理振蕩時間建議15 min較為適宜。

2.6 方法的精密度和回收率 由MS-222的精密度和檢出限結(jié)果（表6）可知，通過空白魚樣中加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，測試其回收率均為77.8%～95.8%，說明此前處理方法回收率良好；精密度為3.4%～5.2%，說明此前處理方法精密度良好。結(jié)合二者數(shù)據(jù)可以看出，此方法能很好地應(yīng)用于魚樣中MS-222的檢測。

2.7 黃顙魚/桂花魚實際樣品分析 隨機從水產(chǎn)批發(fā)市場買來黃顙魚、桂花魚進行處理后，采用HPLC-MS/MS法進行MS-222的測定，同時進行了加標(biāo)回收試驗，結(jié)果見表7。從表7可以看出，這2種水產(chǎn)品加標(biāo)回收率差別不大。此外，黃顙魚和桂花魚都檢測出MS-222，黃顙魚為1.278 μg/kg，桂花魚為1.769 μg/kg。這可能是由于水產(chǎn)品在上市前未充分進行MS-222的代謝。

3 結(jié)論

該試驗研究了基于高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定黃顙魚/桂花魚中麻醉劑MS-222的方法，經(jīng)過加標(biāo)回收等試驗證明，優(yōu)化的QuEChERS前處理過程簡便快捷、容易操作，方法靈敏度高，重現(xiàn)性好，能準(zhǔn)確的定性和定量，滿足水產(chǎn)品中MS-222的檢測要求。該方法不僅可以為評估環(huán)境對魚的活力及健康養(yǎng)殖、影響提供依據(jù)，同時也可以在該藥物銷售及使用過程中監(jiān)控其休藥期情況。

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