趙統(tǒng)超 張宇 王麗紅

摘要[目的]采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化沙棘果油的索氏提取工藝，并測定其抗氧化活性。[方法]在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法考察料液比、提取時間、離心轉(zhuǎn)速對索氏提取沙棘果油得油率的影響；通過測定對·OH，O2·-以及DPPH·的清除能力，探討沙棘果油的抗氧化能力。[結(jié)果]最優(yōu)提取工藝條件：料液比1∶8，提取時間3.5 h，離心轉(zhuǎn)速9 350 r/min，得油率為21.9%；沙棘油對·OH、O2·-、DPPH·自由基均有較好的清除作用，且清除率與濃度呈一定量效關(guān)系。[結(jié)論]通過響應(yīng)面法優(yōu)選的沙棘果油索式提取工藝提取率高，簡單可行，易于工業(yè)化大生產(chǎn)；沙棘果油具有較強的抗氧化作用。

關(guān)鍵詞 沙棘果油；索氏提??；響應(yīng)面法；抗氧化

中圖分類號 S-3 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）22-0145-04

Abstract[Objective]Response surface analysis methodology （RSM） was used for optimizing the Soxhlet extraction technology of seabuckthorn fruit oil and determining the antioxidant activity.[Method]On the basis of single factor experiments，response surface methodology （RSM） was used to investigate the effects of solidliquid ratio，extraction time and rotational speed on the yield of seabuckthorn fruit oil obtained by Soxhlet extraction.The antioxidant capacity of seabuckthorn fruit oil was evaluated by measuring the scavenging capacity of ·OH，O2·- and DPPH·.[Result]The optimum conditions were solidliquid ratio 1∶8，extraction time 3.5 h，rotational speed 9350 r/min and extraction yield 21.9%.The seabuckthorn fruit oil had a good scavenging effect on ·OH，O2·- and ·DPPH，and existed concentrationeffect relationships in some extent.[Conclusion]This optimum Soxhlet extraction process of seabuckthorn fruit oil is simple and feasible with high extraction rate，and it is suitable for industrial production.The seabuckthorn fruit oil showed strong antioxidant activities.

Key words Seabuckthorn fruit oil；Soxhlet extraction；Response surface methodology；Antioxidation

沙棘（Hippophae L.）為胡頹子科沙棘屬植物，沙棘果富含豐富的維生素及黃酮、三萜、甾體、酚類化合物、脂肪酸等生物活性成分[1]，具有抗心肌缺氧、增強免疫力、抗腫瘤、保肝、抗炎、抗輻射等作用[2]。近幾年，對沙棘果的化學(xué)成分、活性進行初篩，發(fā)現(xiàn)沙棘果油含量豐富，具有顯著的收斂、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等活性。目前沙棘果油的提取方法多見超臨界流體萃取法、水代法和水酶法等[3-4]，但這些方法均存在出油效率低的缺點，未將這一重要活性物質(zhì)充分提取和利用。采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化沙棘果油索氏提取工藝[5-6]，并對其抗氧化活性進行研究，旨在尋找適合沙棘果油提取的最優(yōu)方法及工藝，為深入開展其結(jié)構(gòu)特征、活性機理、臨床應(yīng)用的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 沙棘鮮果由哈爾濱裕嘉源農(nóng)業(yè)有限公司提供，經(jīng)佳木斯大學(xué)藥學(xué)院張宇教授鑒定； DPPH（美國Sigma公司）；鄰苯三酚（中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)劑公司）；石油醚（60～90 ℃）、無水乙醇、水楊酸、VC、過氧化氫、硫酸亞鐵、乙酸乙酯均購于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司（AR）。

FW177粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）； RE-52A系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；765型紫外可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）；TGL-16M臺式高速冷凍離心機（長沙平凡儀器儀表有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 單因素試驗

1.2.1.1 料液比。

將沙棘果清洗除雜后在65 ℃烘制8 h取出，冷卻，粉碎過篩得沙棘果干粉。取10.00 g沙棘果干粉各5份，用石油醚（60～90 ℃）按照料液比為1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12 g/mL，水浴溫度80 ℃，索式提取3 h，經(jīng)抽濾、減壓蒸餾、9 000 r/min離心得沙棘果油。按下式計算得油率：

得油率=M1/M2×100%

式中，M1為沙棘果油的質(zhì)量（g）；M2為沙棘果干粉質(zhì)量（g）。

1.2.1.2 提取時間。取10.00 g沙棘果干粉各5份，用石油醚（60～90 ℃）按照料液比為1∶10，水浴溫度80 ℃，分別索式提取1、2、3、4、5 h，經(jīng)抽濾、減壓蒸餾、9 000 r/min離心得沙棘果油，計算得油率。

1.2.1.3 離心轉(zhuǎn)速。取10.00 g沙棘果干粉各5份，用石油醚（60～90 ℃）按照料液比為1∶10 g/mL，水浴溫度80 ℃，索式提取3 h，經(jīng)抽濾、減壓蒸餾，分別按照離心轉(zhuǎn)速3 000、5 000、7 000、9 000、11 000 r/min離心得沙棘果油，計算得油率。

1.2.2 響應(yīng)面試驗。在單因素試驗基礎(chǔ)上，以A（料液比）、B（提取時間）、C（離心轉(zhuǎn)速）為因素，利用Design-Expert.V8.0.6軟件，以得油率為響應(yīng)值，進行三因素三水平響應(yīng)面分析試驗，試驗因素與水平設(shè)計見表1。

1.2.3 沙棘果油的體外抗氧化試驗。用乙酸乙酯將沙棘果油配制成2、4、6、8、10 g/L的溶液，DPPH配制成濃度為0.2 mmol/L DPPH標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別取樣品3 mL于試管并加入2 mL DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻，避光，靜置30 min，于517 nm 波長處測定吸光度Ai。按上述方法以VC為陽性對照，均做3次平行試驗，根據(jù)下式計算清除率：

清除率=[1- （Ai-Aj） /Ac]×100%

式中，Aj 為乙酸乙酯代替DPPH溶液測得的吸光度；Ac為無水乙醇代替樣品溶液測得的吸光度。

將沙棘果油用無水乙醇分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L的沙棘果油溶液，分別向試管中移取1 mL，依次加入 6 mmol/L FeSO4溶液1 mL、6 mmol/L水楊酸乙醇溶液1 mL，最后加入8 mmol/L H2O2溶液1 mL以啟動反應(yīng)，靜置30 min后終止反應(yīng)，于波長510 nm處測定吸光度Ai。按上述方法以VC為陽性對照，做3次平行試驗，根據(jù)下式計算清除率：

清除率=[1- （Ai-Aj）/Ac]×100%

式中，Aj 為無水乙醇代替H2O2溶液測得的吸光度；Ac為蒸餾水代替樣品溶液所測得的吸光度。

將沙棘果油用無水乙醇分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g/L的沙棘果油溶液，分別向試管中移取1 mL，加入50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH=8.2）4.5 mL和3 mmol/L的鄰苯三酚溶液0.1 mL，于25 ℃恒溫水浴反應(yīng)5 min后加入1 mL 8 mmol/LHCl溶液終止反應(yīng)，于波長299 nm處測定樣品溶液的吸光度Ai。按上述方法以VC為陽性對照，均做3次平行試驗，根據(jù)下式計算清除率：

清除率=[1- （Ai-Aj） /Ac]×100%

式中，Aj為無水乙醇代替鄰苯三酚溶液測得的吸光度；Ac為蒸餾水代替樣品溶液測得的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1單因素試驗

2.1.1 料液比。

得油率隨料液比增大呈逐漸增加的趨勢，說明溶劑用量越大顆粒內(nèi)外濃度差越大，當(dāng)濃度差趨于平衡時得油率則趨于相對穩(wěn)定。當(dāng)料液比為1∶10 g/mL時，最大得油率為 21.96%，結(jié)果見圖1A。

2.1.2 提取時間。

得油率隨提取時間延長呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢。說明顆粒與溶劑接觸的時間越長，油脂越容易滲出，當(dāng)溶解度接近飽和時得油率不再有明顯變化。當(dāng)提取時間為3 h時，最大得油率為20.68%（圖1B）。

2.1.3 離心轉(zhuǎn)速。

得油率隨離心轉(zhuǎn)速的增加而增大，說明增大離心轉(zhuǎn)速有助于不溶性物質(zhì)的析出。當(dāng)離心轉(zhuǎn)速為11 000 r/min時，最大得油率為21.59%（圖1C）。

2.2 響應(yīng)面試驗

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果。試驗結(jié)果見表2。

2.2.2 模型評價。利用Design-Expert進行二次多項式回歸擬合，得到的數(shù)學(xué)模型為：

Y=22.08+2.15A+1.39B+0.66C-0.47AB-0.50 AC-0.35 BC-4.88A2-1.60B2-1.22C2

響應(yīng)面的方差分析和顯著性檢驗結(jié)果見表3?？梢钥闯龃四Ｐ偷腜值為0.000 1<0.01，失擬項P值為0.214 4>0.05 ，說明二次模型很顯著?；貧w系數(shù)R2為0.973 3，變異系數(shù)為4.60%，說明擬合程度良好，該模型無失擬因素存在，可用此模型代替試驗分析結(jié)果。由方差分析可知，各個因素對得油率影響大小的順序為A>C>B，其中對得油率影響最顯著的是料液比，這與前期單因素試驗得到的結(jié)果相符合。

2.2.3 響應(yīng)面分析。

由圖2可知，AB、AC響應(yīng)面曲線較

陡，等高線密集，其交互作用較顯著，其他條件都固定時，當(dāng)料液比發(fā)生變化時得油率變化幅度最大，因此判斷料液比對得油率的影響最顯著。通過最優(yōu)化分析得最佳的提取條件：料液比為1∶8.39，提取時間為3.39 h，離心轉(zhuǎn)速為9 354.21 r/min，此時理論最大得油率為 22.61%。

2.2.4 驗證試驗。根據(jù)響應(yīng)面所得索氏提取最佳工藝條件，考慮操作的可行性，將提取條件修正為料液比1∶8，提取時間3.5 h，離心轉(zhuǎn)速為9 350 r/min ，在此條件下平行進行3次驗證試驗，得油率的平均值為21.9%， RSD值為1.2 %，與理論預(yù)測值的相對偏差為3.1%，說明優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可靠，重復(fù)性良好。

2.3 沙棘果油的體外抗氧化試驗

2.3.1 對DPPH·的清除作用。

沙棘果油清除DPPH·試驗結(jié)果見表4，其對DPPH·具有較強的清除作用，在2～10 g/L內(nèi)幾乎呈線性增加，沙棘果油濃度越大，清除效果越好，呈一定濃度依賴性，當(dāng)樣品濃度為10 g/L時，最高清除率達80.30%（表4）。

2.3.2 對·OH的清除作用。

沙棘果油清除·OH試驗結(jié)果見表5，其具有很強的·OH的清除能力，在濃度為0.2～1.0 g/L 時，對·OH的清除能力隨著濃度的增大而提高，但濃度超過0.8 g/L后，清除率的增長趨勢變緩，當(dāng)樣品濃度為1.0 g/L時最大清除率為91.54%，與VC的清除率接近。

2.3.3 對O2·-的清除作用。

沙棘果油清除O2·-試驗結(jié)果見表6，其對O2·-有較強的清除作用，各濃度下清除率甚至高于陽性對照組VC，且清除作用隨著濃度的升高而增強，具有明顯的劑量依賴性，當(dāng)樣品濃度為0.1 g/L時最大清除率為91.23%。

3 結(jié)論與討論

在前期試驗中在提取溶劑乙酸乙酯、正己烷、石油醚（30～60 ℃）、石油醚（60～90 ℃）中進行最佳溶劑篩選，結(jié)果表明以石油醚（60～90 ℃）做溶劑得油率最高，且其價格低廉，故選用石油醚（60～90 ℃）做溶劑更符合該試驗研究需要。通過響應(yīng)面分析方法對索氏提取沙棘油的最佳工藝進行優(yōu)化，得到最佳提取條件：料液比1∶8，提取時間3.5 h，離心轉(zhuǎn)速9 350 r/min，最大得油率為 21.9%。索式提取沙棘果油操作簡單，條件溫和，低成本，高效率，更適合工業(yè)化生產(chǎn)，由于索式提取需要溶劑達到沸點，該方法不考慮溫度對提取率的影響。

人體在生長過程中不斷地產(chǎn)生自由基，而內(nèi)分泌失調(diào)、癌癥、衰老或其他疾病大都與過量自由基的產(chǎn)生有關(guān)[7-8]，自由基成為人類健康潛在的威脅，因此體外抗氧化需要考慮自由基的清除率。課題組前期已經(jīng)對不同濃度沙棘油的體外抗氧化作用進行考察，其中該研究所選濃度為沙棘果油對各自由基清除能力最強的濃度，該試驗再次確定沙棘果油對·OH、O2·-、DPPH·均有良好的清除作用，其中對O2·-的清除作用超過VC，可能是由于沙棘油中含有大量的不飽和脂肪酸，其中的π鍵的電子團暴露于鍵的外圍，容易吸引親電體，而鄰苯三酚自氧化中間體為多元醌類化合物，沙棘油中含有大量微量元素可能與其形成螯合物而改變吸光度，進而表現(xiàn)為超強的抗氧化能力。作為藥食兩用的傳統(tǒng)中藥，沙棘資源豐富，安全有效，作為保健品和藥品開發(fā)的重要物質(zhì)具有一定的優(yōu)勢。物質(zhì)結(jié)構(gòu)差異會導(dǎo)致活性機制的差異，因此，該研究將深入開展沙棘油這一活性物質(zhì)基礎(chǔ)的結(jié)構(gòu)特征、與氧化相關(guān)疾病的活性及機制研究，確定量效關(guān)系，為沙棘果的藥用價值利用與開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

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