張玉晴 汪天杰 許曉升

摘要 [目的]設(shè)計(jì)和表達(dá)OmpK蛋白的多表位串聯(lián)肽，綜合評(píng)價(jià)其免疫效應(yīng)。[方法]構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-repis并進(jìn)行原核表達(dá)，使用Ni-NTA純化介質(zhì)對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化得到重組多表位串聯(lián)肽（rEPIS），以rEPIS為免疫原免疫昆明小鼠，對(duì)rEPIS進(jìn)行免疫原性和免疫保護(hù)性研究，Western-blot分析rEPIS的免疫反應(yīng)性。[結(jié)果]rEPIS具有良好的免疫原性，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生較高水平抗體，并且能夠保護(hù)90%的昆明小鼠抵抗10LD50副溶血性弧菌的感染，具有良好的免疫保護(hù)效應(yīng)，Western-blot結(jié)果顯示重組rEPIS能夠與免疫后鼠血清進(jìn)行特異性結(jié)合，具有良好的免疫反應(yīng)性。[結(jié)論]該研究制備的重組rEPIS具有良好的免疫特性，為副溶血弧菌多表位疫苗的研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 副溶血性弧菌；多表位串聯(lián)肽；免疫特性

中圖分類號(hào) R378.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）23-0061-04

Abstract [Objective]The multiepitope tandem peptide of OmpK protein was designed and expressed， and its immunological effect was evaluated synthetically. [Method]The recombinant expression plasmid pET-32a-repis was constructed and expressed in prokaryotic cells. The recombinant polyepitope tandem peptide rEPISN was purified by using Ni-NTA purification medium. Kunming mice were immunized with rEPIS. The immunogenicity and immunogenicity of rEPIS were studied. Western-blot was used to analyze the immunoreactivity of rEPIS. [Result]rEPIS has good immunogenicity， which can stimulate the body to produce a higher level of antibodies， and protect 90% of Kunming mice against Vibrio parahaemolyticus 10LD50 infection. The results of Western-blot showed that the recombinant rEPIS could specifically bind to the serum of immunized mice and had good immunoreactivity. [Conclusion]The recombinant rEPIS prepared in this study has good immune characteristics， which lays a material foundation for the study of polyepitope vaccine of V. parahaemolyticus.

Key words Vibrio parahaemolyticus；Multiepitope tandem peptide；Immune characteristics

近年來，人工海水養(yǎng)殖規(guī)模迅速擴(kuò)大，生產(chǎn)集約化程度不斷提高，病害已經(jīng)成為制約水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的關(guān)鍵因素。在眾多的細(xì)菌性病害中，弧菌病被公認(rèn)為是魚類養(yǎng)殖中最為嚴(yán)重的病害之一，其中副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）是威脅海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的重要病原菌之一，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。該菌侵染48種海水魚類之多，發(fā)病率高，流行范圍廣，危害嚴(yán)重，是限制我國海洋魚類、貝類等海洋經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的最主要因素之一。

隨著人們生活水平的提高，其對(duì)水產(chǎn)品質(zhì)量安全和環(huán)境污染問題日益關(guān)注，傳統(tǒng)的水產(chǎn)養(yǎng)殖方式如采用各種化學(xué)藥物防治病害的方式越來越受到質(zhì)疑。接種疫苗能有效預(yù)防水產(chǎn)動(dòng)物疫病發(fā)生[2]，且不污染環(huán)境、無藥物殘留，針對(duì)水生動(dòng)物的疫苗領(lǐng)域研究逐漸成為熱門，而接種疫苗也已成為國際現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)范性生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)。其中抗原表位是誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的最基本結(jié)構(gòu)和功能單位。表位疫苗將抗原表位作為疫苗的免疫原，去除免疫無關(guān)、免疫抑制及免疫病理等序列，可有效調(diào)控免疫應(yīng)答類型，大大降低副作用，增強(qiáng)對(duì)機(jī)體的免疫保護(hù)效力[3]。該研究前期篩選了副溶血弧菌的保護(hù)性抗原外膜蛋白（outer membrane protein，omp）K的6個(gè)B細(xì)胞線性表位，在此工作基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)OmpK的多表位串聯(lián)體，并進(jìn)行原核表達(dá)，對(duì)其進(jìn)行免疫特性研究，為漁用新型多表位疫苗的開發(fā)研究奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株 ATCC17802、E.coli Rosetta（DE3）由汕頭出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室保存；原核表達(dá)載體pET-32a（+）購自Novagen；副溶血性弧菌陽性血清、陰性血清、重組OmpK蛋白和His-Taq標(biāo)簽蛋白均由筆者所在實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 主要試劑

核酸限制性內(nèi)切酶（BamH Ⅰ、Hind Ⅲ）、ExTaq聚合酶和T4連接酶購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒純化試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；未預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)蛋白和預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)蛋白為北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品；Ni-NTA純化介質(zhì)購自南京金斯瑞生物科技有限公司；過硫酸銨、TEMED、β-巰基乙醇等購自美國BBI公司；基因序列合成由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司完成；引物合成和測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.3 方法

1.3.1 OmpK蛋白多表位串聯(lián)肽的設(shè)計(jì)。

實(shí)驗(yàn)室前期通過應(yīng)用DNAStar Protean軟件預(yù)測副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株 ATCC17802的OmpK蛋白的6個(gè)B細(xì)胞線性表位，將該6個(gè)表位序列用GGGS（甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸）接頭連接后，轉(zhuǎn)化為核苷酸序列（命名為repis），并在序列5′加上BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)、保護(hù)性堿基（CGC）和起始密碼子（ATG），在3′端加上Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)，保護(hù)性堿基（GGG），且經(jīng)密碼子優(yōu)化后，將最終設(shè)計(jì)的核苷酸序列送至通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成并克隆至質(zhì)粒pET-32a（+），形成重組質(zhì)粒pET-32a-repis。

1.3.2 pET-32a-repis的原核表達(dá)及純化。

將重組質(zhì)粒pET-32a-repis轉(zhuǎn)化至E.coli Rosetta（DE3）中，按照質(zhì)粒純化試劑盒說明書提取重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-repis進(jìn)行PCR鑒定。上游引物P1為5′-ATGGATATCCACAAAAACGAT-3′；下游引物P2為5′-AGATTCTGGTTTGTGACCAGAACC-3′。PCR反應(yīng)體系（50.0 μL）包括10×PCR buffer 5.0 μL，dNTP 4.0 μL，P1/P2各1 μL，ExTaq酶0.2 μL，ddH2O 37.8 μL，質(zhì)粒模板1.0 μL。 PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火30 s，72 ℃復(fù)性30 s，共25個(gè)循環(huán)；72 ℃ 后延伸 10 min。將PCR陽性質(zhì)粒送至上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序鑒定。

挑取鑒定陽性的重組菌pET-32a-repis/Rosetta（DE3）單菌落于5 mL 含100 μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12～14 h后，取2 mL菌液加入到200 mL LB培養(yǎng)基（Amp+Cl抗性）中擴(kuò)大振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4～0.5時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為1 mmol/L，轉(zhuǎn)16 ℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)16 h。離心收集菌體沉淀，用PBS重懸沉淀，加入PMSF（工作濃度為1 mmol/L）和溶菌酶，反復(fù)凍融3次后進(jìn)行超聲裂解（采用300 W，超聲4 s，停8 s，總計(jì)20 min），使菌體充分破碎。將超聲后的樣本離心分離沉淀與上清，上清即為可溶性部分，沉淀為包涵體部分，用同樣體積20 mL的PBS重懸。沉淀和上清各取8 μL進(jìn)行SDS-PAGE檢測，進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物的鑒定及表達(dá)形式分析。使用Ni-His resin親合層析柱對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行親和純化。

1.3.3 OmpK多表位串聯(lián)肽rEPIS的免疫保護(hù)性。

將昆明小鼠隨機(jī)分為5組，第1～4組分別為rEPIS組、重組OmpK蛋白組、滅活副溶血性弧菌菌苗組和標(biāo)簽蛋白組，第5組為PBS對(duì)照組，每組20只。3種蛋白的免疫劑量為2 μg/g體重，首次免疫時(shí)，滅活菌苗的免疫劑量為1×10.8 CFU/只，免疫途徑為腹腔注射，蛋白與弗氏不完全佐劑按照1∶1混合乳化。14 d后加強(qiáng)免疫1次，加強(qiáng)免疫時(shí)，蛋白與弗氏完全佐劑按照1∶1混合乳化，劑量同一免，對(duì)照組注射等量PBS。分別于免疫前和免疫后14 d和28 d，對(duì)各實(shí)驗(yàn)組小鼠進(jìn)行眼眶采血，采用間接Elisa檢測血清中抗體水平。免疫30 d后人工感染副溶血弧菌，感染劑量為10LD50。記錄實(shí)驗(yàn)小鼠14 d的存活情況，計(jì)算免疫保護(hù)率=（1-免疫組死亡率/對(duì)照組死亡率）×100%。

1.3.4 重組多表位肽rEPIS的免疫反應(yīng)性。

純化重組rEPIS蛋白先進(jìn)行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后進(jìn)行Western-blot 分析。以重組rEPIS蛋白免疫組首次免疫后28 d小鼠眼眶采血分離的抗血清為一抗，對(duì)純化重組rEPIS蛋白進(jìn)行Western-blot分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 OmpK蛋白多表位串聯(lián)肽的設(shè)計(jì)

將6個(gè)表位（氨基酸序列為DIHKNDY、NEKGYAESSHDY、PGSDKAG、YDGNKKDW、DDDKGNK、GHKPES）用GGGS連接后，轉(zhuǎn)化為核苷酸序列（圖1）。

2.2 pET-32a-repis的原核表達(dá)及純化

將重組質(zhì)粒pET-32a-repis轉(zhuǎn)化至E.coli Rosetta（DE3）后進(jìn)行PCR鑒定，瓊脂糖凝膠電泳顯示在216 bp附近有1條特異性的DNA條帶（圖2），表明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功。重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)后，對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行了SDS-PAGE電泳鑒定和表達(dá)形式的檢測，結(jié)果如圖3所示，誘導(dǎo)后的pET-32a-repis/Rosetta（DE3）上清液中，在30 kD左右位置出現(xiàn)濃染蛋白條帶（泳道5），符合預(yù)期的rEPIS蛋白分子量，沉淀中沒有該濃染蛋白條帶（泳道6），說明該誘導(dǎo)條件下重組rEPIS的表達(dá)形式為可溶性蛋白。

2.3 OmpK多表位串聯(lián)肽rEPIS的免疫特性研究

首次免疫后第14天和第28天，從各組免疫鼠眼眶采血分離血清，分別以純化的重組rEPIS蛋白、重組OmpK蛋白及標(biāo)簽蛋白His-Taq為包被抗原，采用間接Elisa方法測定特異性抗體水平。結(jié)果如表1所示，重組rEPIS蛋白和重組OmpK蛋白均能很好地刺激機(jī)體產(chǎn)生較高水平的抗體，標(biāo)簽蛋白也能刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)抗體，但是其抗體水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于抗重組rEPIS蛋白和重組OmpK蛋白抗體水平，即2組免疫血清中的抗體以抗重組rEPIS蛋白、重組OmpK蛋白為主。

各實(shí)驗(yàn)組小鼠在免疫后第30天，分別用10LD50副溶血性弧菌ATCC17802株進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)標(biāo)簽蛋白組和PBS對(duì)照組20只小鼠全部死亡，重組rEPIS組小鼠存活18只，相對(duì)保護(hù)率為90%；重組OmpK組小鼠存活17只，相對(duì)保護(hù)率為85%；滅活菌組小鼠存活18只，相對(duì)保護(hù)率為90%（表2）。死亡小鼠腹部腫脹，剖檢后可見肝臟腫大且顏色變黃，腸道內(nèi)有黃色積液，用肝臟切面涂抹平板，四區(qū)劃線分離細(xì)菌，經(jīng)生化鑒定為副溶血性弧菌。

2.4 重組多表位肽rEPIS的免疫反應(yīng)性

Western-blot結(jié)果顯示，純化的rEPIS蛋白能與鼠抗重組rEPIS抗體發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，在30 kD處出現(xiàn)1條特異性免疫反應(yīng)條帶（圖4），表明該重組蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性。

3 討論

傳統(tǒng)疫苗包括減毒活疫苗和滅活疫苗。減毒活疫苗免疫效果雖好，但減毒不充分，存在臨床感染的風(fēng)險(xiǎn)。滅活疫苗雖然比較安全，但也有一定的毒副作用。近年來，隨著分子生物學(xué)與分子免疫學(xué)的發(fā)展，出現(xiàn)了多種替代傳統(tǒng)疫苗的新形式分子疫苗，如基因工程亞單位疫苗、多表位疫苗、核酸疫苗以及基因缺失疫苗等。多表位疫苗由多個(gè)保護(hù)性抗原表位制成，是一種新型亞單位疫苗，與傳統(tǒng)疫苗相比，其具有安全無毒、穩(wěn)定可控等優(yōu)勢。我國水產(chǎn)疫苗研究開發(fā)起步較晚，全國現(xiàn)有近30 家科研單位開展水產(chǎn)疫苗相關(guān)研究，涉及病毒、細(xì)菌和寄生蟲等病原27 種（類）[4]。到目前為止，只有4個(gè)漁用疫苗獲得國家新獸藥證書，漁用疫苗的研究開發(fā)前景比較開闊。

OmpK是一種潛在的弧菌共同抗原，以O(shè)mpK為抗原基因的弧菌漁用疫苗可能具有較高的免疫保護(hù)效率[5-8]。該研究選取副溶血弧菌保護(hù)性抗原OmpK為靶標(biāo)，將預(yù)測得到的OmpK蛋白的6個(gè)B細(xì)胞線性表位用氨基酸接頭連接，設(shè)計(jì)多表位串聯(lián)體。在進(jìn)行表位串聯(lián)設(shè)計(jì)時(shí)，相鄰表位氨基酸的首尾部分結(jié)合可能會(huì)產(chǎn)生新的接合表位，會(huì)抑制原有表位誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，因此需要在相鄰表位間引入合適的間隔序列。以甘氨酸接頭為代表的柔性接頭伸展性好，自身結(jié)構(gòu)簡單，連接2個(gè)大分子蛋白時(shí)往往不影響各自蛋白的天然構(gòu)象。2007年，Wang等[9]將雞傳染性囊病病毒的5個(gè)抗原表位用GGGS連接后進(jìn)行原核表達(dá)，得到的重組蛋白r5EPIS可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較高水平的特異性抗體，并具有良好的免疫保護(hù)性。2013年，Tian等[10]使用接頭GGSSGG將豬瘟病毒包膜糖蛋白的B細(xì)胞表位進(jìn)行串聯(lián)表達(dá)，獲得重組多表位蛋白GST-BT22，能夠與抗豬瘟的血清抗體特異性結(jié)合，且有很強(qiáng)的親和力。該研究串聯(lián)表位的接頭選用的是GGGS，經(jīng)原核表達(dá)得到的重組蛋白rEPIS免疫小鼠后28 d，ELISA檢測抗體效價(jià)高達(dá)1∶1 638 400，并且可保護(hù)90%的昆明小鼠抵抗10LD50副溶血性弧菌的感染，具有良好的免疫保護(hù)效應(yīng)。

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