張玉晴 汪天杰 許曉升
摘要 [目的]設(shè)計和表達OmpK蛋白的多表位串聯(lián)肽,綜合評價其免疫效應(yīng)。[方法]構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-32a-repis并進行原核表達,使用Ni-NTA純化介質(zhì)對表達產(chǎn)物進行純化得到重組多表位串聯(lián)肽(rEPIS),以rEPIS為免疫原免疫昆明小鼠,對rEPIS進行免疫原性和免疫保護性研究,Western-blot分析rEPIS的免疫反應(yīng)性。[結(jié)果]rEPIS具有良好的免疫原性,能夠刺激機體產(chǎn)生較高水平抗體,并且能夠保護90%的昆明小鼠抵抗10LD50副溶血性弧菌的感染,具有良好的免疫保護效應(yīng),Western-blot結(jié)果顯示重組rEPIS能夠與免疫后鼠血清進行特異性結(jié)合,具有良好的免疫反應(yīng)性。[結(jié)論]該研究制備的重組rEPIS具有良好的免疫特性,為副溶血弧菌多表位疫苗的研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。
關(guān)鍵詞 副溶血性弧菌;多表位串聯(lián)肽;免疫特性
中圖分類號 R378.3 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611(2018)23-0061-04
Abstract [Objective]The multiepitope tandem peptide of OmpK protein was designed and expressed, and its immunological effect was evaluated synthetically. [Method]The recombinant expression plasmid pET-32a-repis was constructed and expressed in prokaryotic cells. The recombinant polyepitope tandem peptide rEPISN was purified by using Ni-NTA purification medium. Kunming mice were immunized with rEPIS. The immunogenicity and immunogenicity of rEPIS were studied. Western-blot was used to analyze the immunoreactivity of rEPIS. [Result]rEPIS has good immunogenicity, which can stimulate the body to produce a higher level of antibodies, and protect 90% of Kunming mice against Vibrio parahaemolyticus 10LD50 infection. The results of Western-blot showed that the recombinant rEPIS could specifically bind to the serum of immunized mice and had good immunoreactivity. [Conclusion]The recombinant rEPIS prepared in this study has good immune characteristics, which lays a material foundation for the study of polyepitope vaccine of V. parahaemolyticus.
Key words Vibrio parahaemolyticus;Multiepitope tandem peptide;Immune characteristics
近年來,人工海水養(yǎng)殖規(guī)模迅速擴大,生產(chǎn)集約化程度不斷提高,病害已經(jīng)成為制約水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的關(guān)鍵因素。在眾多的細菌性病害中,弧菌病被公認(rèn)為是魚類養(yǎng)殖中最為嚴(yán)重的病害之一,其中副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)是威脅海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的重要病原菌之一,給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失[1]。該菌侵染48種海水魚類之多,發(fā)病率高,流行范圍廣,危害嚴(yán)重,是限制我國海洋魚類、貝類等海洋經(jīng)濟動物養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的最主要因素之一。
隨著人們生活水平的提高,其對水產(chǎn)品質(zhì)量安全和環(huán)境污染問題日益關(guān)注,傳統(tǒng)的水產(chǎn)養(yǎng)殖方式如采用各種化學(xué)藥物防治病害的方式越來越受到質(zhì)疑。接種疫苗能有效預(yù)防水產(chǎn)動物疫病發(fā)生[2],且不污染環(huán)境、無藥物殘留,針對水生動物的疫苗領(lǐng)域研究逐漸成為熱門,而接種疫苗也已成為國際現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)范性生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)。其中抗原表位是誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的最基本結(jié)構(gòu)和功能單位。表位疫苗將抗原表位作為疫苗的免疫原,去除免疫無關(guān)、免疫抑制及免疫病理等序列,可有效調(diào)控免疫應(yīng)答類型,大大降低副作用,增強對機體的免疫保護效力[3]。該研究前期篩選了副溶血弧菌的保護性抗原外膜蛋白(outer membrane protein,omp)K的6個B細胞線性表位,在此工作基礎(chǔ)上,設(shè)計OmpK的多表位串聯(lián)體,并進行原核表達,對其進行免疫特性研究,為漁用新型多表位疫苗的開發(fā)研究奠定一定的基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材料
副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株 ATCC17802、E.coli Rosetta(DE3)由汕頭出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心實驗室保存;原核表達載體pET-32a(+)購自Novagen;副溶血性弧菌陽性血清、陰性血清、重組OmpK蛋白和His-Taq標(biāo)簽蛋白均由筆者所在實驗室制備。
1.2 主要試劑
核酸限制性內(nèi)切酶(BamH Ⅰ、Hind Ⅲ)、ExTaq聚合酶和T4連接酶購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司;細菌基因組DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒純化試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;未預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)蛋白和預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)蛋白為北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品;Ni-NTA純化介質(zhì)購自南京金斯瑞生物科技有限公司;過硫酸銨、TEMED、β-巰基乙醇等購自美國BBI公司;基因序列合成由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司完成;引物合成和測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
1.3 方法
1.3.1 OmpK蛋白多表位串聯(lián)肽的設(shè)計。
實驗室前期通過應(yīng)用DNAStar Protean軟件預(yù)測副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株 ATCC17802的OmpK蛋白的6個B細胞線性表位,將該6個表位序列用GGGS(甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸)接頭連接后,轉(zhuǎn)化為核苷酸序列(命名為repis),并在序列5′加上BamH Ⅰ酶切位點、保護性堿基(CGC)和起始密碼子(ATG),在3′端加上Hind Ⅲ酶切位點,保護性堿基(GGG),且經(jīng)密碼子優(yōu)化后,將最終設(shè)計的核苷酸序列送至通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成并克隆至質(zhì)粒pET-32a(+),形成重組質(zhì)粒pET-32a-repis。
1.3.2 pET-32a-repis的原核表達及純化。
將重組質(zhì)粒pET-32a-repis轉(zhuǎn)化至E.coli Rosetta(DE3)中,按照質(zhì)粒純化試劑盒說明書提取重組表達質(zhì)粒pET-32a-repis進行PCR鑒定。上游引物P1為5′-ATGGATATCCACAAAAACGAT-3′;下游引物P2為5′-AGATTCTGGTTTGTGACCAGAACC-3′。PCR反應(yīng)體系(50.0 μL)包括10×PCR buffer 5.0 μL,dNTP 4.0 μL,P1/P2各1 μL,ExTaq酶0.2 μL,ddH2O 37.8 μL,質(zhì)粒模板1.0 μL。 PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 預(yù)變性4 min;94 ℃變性1 min,50 ℃退火30 s,72 ℃復(fù)性30 s,共25個循環(huán);72 ℃ 后延伸 10 min。將PCR陽性質(zhì)粒送至上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序鑒定。
挑取鑒定陽性的重組菌pET-32a-repis/Rosetta(DE3)單菌落于5 mL 含100 μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12~14 h后,取2 mL菌液加入到200 mL LB培養(yǎng)基(Amp+Cl抗性)中擴大振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4~0.5時,加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為1 mmol/L,轉(zhuǎn)16 ℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)16 h。離心收集菌體沉淀,用PBS重懸沉淀,加入PMSF(工作濃度為1 mmol/L)和溶菌酶,反復(fù)凍融3次后進行超聲裂解(采用300 W,超聲4 s,停8 s,總計20 min),使菌體充分破碎。將超聲后的樣本離心分離沉淀與上清,上清即為可溶性部分,沉淀為包涵體部分,用同樣體積20 mL的PBS重懸。沉淀和上清各取8 μL進行SDS-PAGE檢測,進行表達產(chǎn)物的鑒定及表達形式分析。使用Ni-His resin親合層析柱對表達產(chǎn)物進行親和純化。
1.3.3 OmpK多表位串聯(lián)肽rEPIS的免疫保護性。
將昆明小鼠隨機分為5組,第1~4組分別為rEPIS組、重組OmpK蛋白組、滅活副溶血性弧菌菌苗組和標(biāo)簽蛋白組,第5組為PBS對照組,每組20只。3種蛋白的免疫劑量為2 μg/g體重,首次免疫時,滅活菌苗的免疫劑量為1×10.8 CFU/只,免疫途徑為腹腔注射,蛋白與弗氏不完全佐劑按照1∶1混合乳化。14 d后加強免疫1次,加強免疫時,蛋白與弗氏完全佐劑按照1∶1混合乳化,劑量同一免,對照組注射等量PBS。分別于免疫前和免疫后14 d和28 d,對各實驗組小鼠進行眼眶采血,采用間接Elisa檢測血清中抗體水平。免疫30 d后人工感染副溶血弧菌,感染劑量為10LD50。記錄實驗小鼠14 d的存活情況,計算免疫保護率=(1-免疫組死亡率/對照組死亡率)×100%。
1.3.4 重組多表位肽rEPIS的免疫反應(yīng)性。
純化重組rEPIS蛋白先進行SDS-PAGE,電泳結(jié)束后進行Western-blot 分析。以重組rEPIS蛋白免疫組首次免疫后28 d小鼠眼眶采血分離的抗血清為一抗,對純化重組rEPIS蛋白進行Western-blot分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 OmpK蛋白多表位串聯(lián)肽的設(shè)計
將6個表位(氨基酸序列為DIHKNDY、NEKGYAESSHDY、PGSDKAG、YDGNKKDW、DDDKGNK、GHKPES)用GGGS連接后,轉(zhuǎn)化為核苷酸序列(圖1)。
2.2 pET-32a-repis的原核表達及純化
將重組質(zhì)粒pET-32a-repis轉(zhuǎn)化至E.coli Rosetta(DE3)后進行PCR鑒定,瓊脂糖凝膠電泳顯示在216 bp附近有1條特異性的DNA條帶(圖2),表明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功。重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)后,對表達蛋白進行了SDS-PAGE電泳鑒定和表達形式的檢測,結(jié)果如圖3所示,誘導(dǎo)后的pET-32a-repis/Rosetta(DE3)上清液中,在30 kD左右位置出現(xiàn)濃染蛋白條帶(泳道5),符合預(yù)期的rEPIS蛋白分子量,沉淀中沒有該濃染蛋白條帶(泳道6),說明該誘導(dǎo)條件下重組rEPIS的表達形式為可溶性蛋白。
2.3 OmpK多表位串聯(lián)肽rEPIS的免疫特性研究
首次免疫后第14天和第28天,從各組免疫鼠眼眶采血分離血清,分別以純化的重組rEPIS蛋白、重組OmpK蛋白及標(biāo)簽蛋白His-Taq為包被抗原,采用間接Elisa方法測定特異性抗體水平。結(jié)果如表1所示,重組rEPIS蛋白和重組OmpK蛋白均能很好地刺激機體產(chǎn)生較高水平的抗體,標(biāo)簽蛋白也能刺激機體產(chǎn)生相應(yīng)抗體,但是其抗體水平遠遠低于抗重組rEPIS蛋白和重組OmpK蛋白抗體水平,即2組免疫血清中的抗體以抗重組rEPIS蛋白、重組OmpK蛋白為主。
各實驗組小鼠在免疫后第30天,分別用10LD50副溶血性弧菌ATCC17802株進行攻毒實驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)標(biāo)簽蛋白組和PBS對照組20只小鼠全部死亡,重組rEPIS組小鼠存活18只,相對保護率為90%;重組OmpK組小鼠存活17只,相對保護率為85%;滅活菌組小鼠存活18只,相對保護率為90%(表2)。死亡小鼠腹部腫脹,剖檢后可見肝臟腫大且顏色變黃,腸道內(nèi)有黃色積液,用肝臟切面涂抹平板,四區(qū)劃線分離細菌,經(jīng)生化鑒定為副溶血性弧菌。
2.4 重組多表位肽rEPIS的免疫反應(yīng)性
Western-blot結(jié)果顯示,純化的rEPIS蛋白能與鼠抗重組rEPIS抗體發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng),在30 kD處出現(xiàn)1條特異性免疫反應(yīng)條帶(圖4),表明該重組蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性。
3 討論
傳統(tǒng)疫苗包括減毒活疫苗和滅活疫苗。減毒活疫苗免疫效果雖好,但減毒不充分,存在臨床感染的風(fēng)險。滅活疫苗雖然比較安全,但也有一定的毒副作用。近年來,隨著分子生物學(xué)與分子免疫學(xué)的發(fā)展,出現(xiàn)了多種替代傳統(tǒng)疫苗的新形式分子疫苗,如基因工程亞單位疫苗、多表位疫苗、核酸疫苗以及基因缺失疫苗等。多表位疫苗由多個保護性抗原表位制成,是一種新型亞單位疫苗,與傳統(tǒng)疫苗相比,其具有安全無毒、穩(wěn)定可控等優(yōu)勢。我國水產(chǎn)疫苗研究開發(fā)起步較晚,全國現(xiàn)有近30 家科研單位開展水產(chǎn)疫苗相關(guān)研究,涉及病毒、細菌和寄生蟲等病原27 種(類)[4]。到目前為止,只有4個漁用疫苗獲得國家新獸藥證書,漁用疫苗的研究開發(fā)前景比較開闊。
OmpK是一種潛在的弧菌共同抗原,以O(shè)mpK為抗原基因的弧菌漁用疫苗可能具有較高的免疫保護效率[5-8]。該研究選取副溶血弧菌保護性抗原OmpK為靶標(biāo),將預(yù)測得到的OmpK蛋白的6個B細胞線性表位用氨基酸接頭連接,設(shè)計多表位串聯(lián)體。在進行表位串聯(lián)設(shè)計時,相鄰表位氨基酸的首尾部分結(jié)合可能會產(chǎn)生新的接合表位,會抑制原有表位誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答,因此需要在相鄰表位間引入合適的間隔序列。以甘氨酸接頭為代表的柔性接頭伸展性好,自身結(jié)構(gòu)簡單,連接2個大分子蛋白時往往不影響各自蛋白的天然構(gòu)象。2007年,Wang等[9]將雞傳染性囊病病毒的5個抗原表位用GGGS連接后進行原核表達,得到的重組蛋白r5EPIS可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生較高水平的特異性抗體,并具有良好的免疫保護性。2013年,Tian等[10]使用接頭GGSSGG將豬瘟病毒包膜糖蛋白的B細胞表位進行串聯(lián)表達,獲得重組多表位蛋白GST-BT22,能夠與抗豬瘟的血清抗體特異性結(jié)合,且有很強的親和力。該研究串聯(lián)表位的接頭選用的是GGGS,經(jīng)原核表達得到的重組蛋白rEPIS免疫小鼠后28 d,ELISA檢測抗體效價高達1∶1 638 400,并且可保護90%的昆明小鼠抵抗10LD50副溶血性弧菌的感染,具有良好的免疫保護效應(yīng)。
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