顧翔源 張瑞 姜峰 賈睿 王軍 朱穎越

摘要 [目的]研究一種基于銀納米粒子聚集使體系顏色發(fā)生改變的原理，建立新的生物傳感器檢測食品中的雙酚A。[方法]采用檸檬酸還原法合成銀納米粒子并修飾核酸適配體。雙酚A 與核酸適配體結(jié)合發(fā)生變構(gòu)效應(yīng)導(dǎo)致銀納米粒子聚集，其特征峰以及顏色發(fā)生變化，研究體系特定波長吸光度比值與雙酚A濃度的變化關(guān)系。[結(jié)果]在最佳優(yōu)化條件下，該比色法在質(zhì)量濃度為0.50～50.00 ng/mL呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢出限為0.3 ng/mL。將該檢測體系應(yīng)用于BPA類似物的檢測，特異性較好。[結(jié)論]該方法對食品中雙酚A的檢測有一定的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞 銀納米粒子;鹽誘導(dǎo);核酸適配體;雙酚A

中圖分類號 TB487文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 0517-6611（2018）34-0179-02

雙酚A（BPA），是一種重要的化工有機(jī)原料，苯酚和丙酮的衍生物，用于合成環(huán)氧樹脂、聚砜樹脂、聚碳酸酯等高分子材料，也用于增塑劑、抗氧化劑、熱穩(wěn)定劑等化工產(chǎn)品。然而最受關(guān)注的是雙酚A對于人類的影響[1-2]，它可通過各類食品包裝材料、奶瓶、水杯、餐具，甚至是最常見的水滲入人體，作為一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物造成人中樞、生殖、心血管系統(tǒng)的癌變[3-4]。為了保證食品及水樣的安全，對其中BPA殘留檢測方法的研究具有重大意義。

目前，環(huán)境水樣中BPA的檢測方法主要有高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法[5-7]、酶聯(lián)免疫法[8]、分光光度法、熒光法、電化學(xué)法等[9-12]。這些方法在準(zhǔn)確度上雖然有一定優(yōu)勢，但由于樣品前處理時間長、對儀器要求高、操作復(fù)雜、經(jīng)濟(jì)成本高，一種新型快速有效的雙酚A檢測方法亟待被開發(fā)。

自從BPA對應(yīng)的核酸適配子被篩選出來后，相較于免疫學(xué)測定方法，核酸配子具有抗體的特異性和敏感性，合成方法比抗體更加簡單，在許多相關(guān)文獻(xiàn)中已有利用BPA核酸適配子檢測BPA的記錄[13-15]。筆者利用鹽對銀納米粒子的誘導(dǎo)聚集效應(yīng)，利用具有特異性的單鏈DNA、鹽、BPA之間的相互作用，構(gòu)建一種新型生物傳感器，靈敏高效地檢測食品及水樣中雙酚A的含量。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑 硝酸銀（AgNO3）、二水合檸檬酸三鈉（C6H5Na3O7·2H2O）、氯化鈉（NaCl）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）均為分析純，購買于江蘇強(qiáng)盛功能化工股份有限公司;BPA及其類似物，分析純，購買于上海百靈威科技;試驗用水均為超純水。BPA核酸適配子ssDNA，其序列為5-CCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGTTCGCACCA-3，購買于上海生工公司。

1.2 試驗儀器 UV-2450型紫外可見分光光度計，日本島津公司;旋渦振蕩器，美國ScientificIndustries公司;密理博超純水儀，北京普析通用公司。

1.3 銀納米粒子溶液的合成

將100 mL超純水配制的0.01% AgNO3溶液裝入錐形瓶中，加入磁力攪拌子，置于恒溫電磁攪拌器上加熱，沸騰持續(xù)2 min后迅速加入2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)攪拌加熱至溶液變?yōu)榈S色，生成銀納米粒子，繼續(xù)加熱10 min后停止加熱，攪拌使其冷卻至室溫，放置在4 ℃環(huán)境中貯存?zhèn)溆谩?/p>

配制過程中所用磁力攪拌子、玻璃器皿等均預(yù)先以王水浸泡過夜。

1.4 試驗原理

銀納米粒子在鹽誘導(dǎo)下會發(fā)生聚集，引起明顯體系吸光度的改變。具有負(fù)電性磷酸骨架的特定結(jié)構(gòu)的ssDNA可以通過靜電吸引結(jié)合在銀納米粒子表面，使銀納米粒子分散，而且ssDNA與雙酚A反應(yīng)形成變構(gòu)效應(yīng)，其間結(jié)合力大于DNA與銀納米表面的電荷吸附效應(yīng)。當(dāng)體系中NaCl與ssDNA比例恰好維持銀納米平衡時，其吸光度保持不變，在加入BPA后，ssDNA從銀納米粒子上剝離下來與BPA結(jié)合，使銀納米粒子暴露在鹽環(huán)境中，繼而在鹽誘導(dǎo)下，銀納米粒子發(fā)生不同程度聚集，溶液顏色改變，由黃色變?yōu)榛疑?，吸光度隨著BPA濃度改變而改變，銀納米粒子特征峰位置和強(qiáng)度發(fā)生變化?；谶@個原理，設(shè)計出一種新型生物傳感器應(yīng)用于BPA的檢測。

1.5 試驗方法 向2 mL離心管中加入150 μL用緩沖液（20? mmol/L ThrisHCl，pH 7.4）配制的ssDNA溶液（終濃度為8 nmol/L），再加入1 200 μL銀納米粒子溶液混勻，室溫放置過夜后，加入NaCl溶液（終濃度為40? mmol/L），混勻后加入100 μL不同濃度的BPA，總定容為1 500 μL，室溫放置3 min，在波長300～700 nm掃描其吸光光譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗條件的優(yōu)化

影響試驗結(jié)果的因素包括NaCl濃度和ssDNA濃度，確定兩者最適濃度可以確定檢測方法的最佳結(jié)果。在銀納米溶液中加入不同濃度的NaCl溶液，引起銀納米粒子的聚集，使得A608/A418值不同。由圖1可知，當(dāng)控制NaCl體系濃度在40 mmol/L時，A608/A418值最大，銀納米粒子聚集程度最大。繼續(xù)增加濃度，比值幾乎不變。在此基礎(chǔ)上，同理，可測得ssDNA體系濃度為8 nmol/L時，A608/A418值最小，銀納米粒子分散程度最大。由此可知，NaCl和ssDNA最佳濃度分別為40 mmol/L和8 nmol/L。

2.2 BPA標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

在試驗條件最優(yōu)的情況下，利用建立的傳感器檢測不同濃度梯度的BPA溶液（0.01、0.50、1.00、5.00、10.00、20.00、50.00、100.00 ng/mL），利用分光光度計對體系吸光度進(jìn)行測量。從圖2～3可看出，隨雙酚A濃度變化，溶液A608/A418值呈現(xiàn)上升趨勢，且在BPA濃度為0.50～50.00 ng/mL呈現(xiàn)出線性變化，線性方程為 Y =0.146+0.013 4 X，線性相關(guān)系數(shù)為0.998 ?檢測限可達(dá)0.30 ng/mL。

2.3 特異性分析

為了排除其他類似物對雙酚A檢測的干擾，取BPA類似物雙酚B（BPB）、雙酚C（BPC）、己烯雌酚（DES），利用建立的傳感器進(jìn)行測量。在4種物質(zhì)濃度都為相同濃度（50 ng/mL）時掃描吸光度，結(jié)果如圖4，通過比較分析，除了雙酚A體系顏色由黃色變?yōu)榛疑椅舛缺戎底兓^大，其他體系幾乎沒有變化。

2.4 實際樣品的檢測

為測試建立的傳感器的實際應(yīng)用效果，利用純凈水加入不同量的雙酚A標(biāo)準(zhǔn)品制成不同濃度的樣品，用此法檢測樣品中BPA含量。由表1可知，測量的回收率為96%～106%，表明該方法可以用于水中雙酚A的檢測。

3 結(jié)論

基于一定鹽濃度導(dǎo)致銀納米粒子聚合而使得吸光度發(fā)生較大變化和具有優(yōu)異特性的核酸適配子，建立一種能快靈敏地檢測水樣中雙酚A的比色傳感器。在優(yōu)化條件下，定量定性檢測結(jié)果較好，并具有高選擇性和特異性。與傳統(tǒng)檢測方法相比，此方法快速、靈敏、操作方便，有較好的應(yīng)用前景。

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