田振鋒 馬麗伊 孔俊

摘要 [目的]提取煙草中的香味成分，并用LC-MS/MS方法對其進(jìn)行測定和分析。[方法]煙草樣品經(jīng)甲醇溶液超聲萃取后，取上清液直接進(jìn)樣LC-MS/MS分析，采用電噴霧正離子多反應(yīng)監(jiān)測方式檢測，并采用柱后預(yù)分離糖基體，消除其對香味成分離子化的影響。[結(jié)果]各香味成分線性關(guān)系良好（R2≥ 0.982 2），加標(biāo)回收率為82.43% ～ 95.77%，平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.00%～ 4.58%。[結(jié)論]該方法靈敏、準(zhǔn)確，分析速度快，適合煙草中香味成分檢測。

關(guān)鍵詞 煙草；香味成分；LC-MS/MS；超聲提取

中圖分類號 TS424 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）21-0178-04

Abstract [Objective]Aroma components in tobacco were extracted and assayed and analyzed by LCMS/MS method.[Method]After the tobacco sample was extracted by the methanol solution， the supernatant was directly analyzed by LCMS/MS. Electrospray positive ion multiple reaction monitoring was used to detect and use the postcolumn preseparation of the sugar matrix to eliminate its effect on the ionization of aroma components.[Result]The linear relationship of the flavor components was good （R2≥0.982 2）， the spike recovery was 82.43%-95.77%， and the average relative standard deviation （RSD） was 2.00%-4.58%.[Conclusion]The method is sensitive， accurate and analysis speed fast，which is suitable for the detection of aroma components in tobacco.

Key words Tobacco；Aroma components；LCMS/MS；Ultrasound extraction

香味成分對煙葉品質(zhì)具有決定性作用，是衡量煙葉質(zhì)量的重要指標(biāo)[1]。煙草中香味物質(zhì)種類多、含量少，需要采用合適的前處理方法和靈敏的分析測試手段[2]。常用測定方法是樣品經(jīng)預(yù)處理后，GC-MS定性定量分析[3-4]。主要預(yù)處理方法有溶劑萃?。⊿E）[5]和同時蒸餾萃?。⊿DE）[6]等方法。SE 法是一種常用提取煙草香味物質(zhì)的方法，但共存基體成分復(fù)雜，影響香味成分的準(zhǔn)確定量。SDE法集提取、蒸餾和萃取于一身，是目前煙草香味成分測定的常用預(yù)處理方法，但由于該方法需高溫蒸餾，易引起煙草中糖類和氨基酸發(fā)生梅拉德（Maillard）反應(yīng)，生成香味成分，影響煙草中的糠醛、呋喃類等焦甜香香味成分的測定，使得測定結(jié)果與煙草實際含量存在偏差。LC-MS/MS法[7-8]可直接分析樣品提取液中香味成分。但樣品提取液中含有大量糖基體，影響香味成分的質(zhì)譜定量。

筆者利用糖基體的色譜保留時間小于香味成分，在柱后分離糖基體，避免其進(jìn)入質(zhì)譜儀，消除糖基體對香味成分離子化的影響，旨在建立LC-MS/MS方法定量測定煙草中香味成分。

1 材料與方法

1.1 試材

烤煙（云煙100）；二氯甲烷、甲醇、乙酸銨、乙腈（色譜純，美國Tedia試劑公司）；一次性針頭過濾器（0.22 μm有機(jī)系，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。5種香味物質(zhì)標(biāo)樣：β-紫羅蘭酮、甲基環(huán)戊烯醇酮、γ-丁內(nèi)酯、2-乙酰呋喃、4-羥基-2，5-二甲基呋喃酮（純度均大于98%，英國Alfa Aesar 公司）。

1.2 儀器

Waters Acquity 高效液相色譜儀（美國Waters公司）；AL204-IC型電子分析天平（感量0.000 1 g，瑞士 Mettler Toledo 公司）；API 4000 QTRAP質(zhì)譜儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取香味物質(zhì)標(biāo)樣各0.2 g，用甲醇配制成20 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，逐步稀釋成不同濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4 樣品處理與分析

使用0.3 μg/mL各物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液對色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，方法優(yōu)化完成后，再對樣品前處理過程進(jìn)行優(yōu)化（超聲輔助溫度和時間、萃取溶劑），最后采用基體柱切換技術(shù)進(jìn)樣分析。

準(zhǔn)確稱取1 g煙末于50 mL錐形瓶中，加入20 mL甲醇，在室溫下超聲萃取30 min，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，3 000 r/min下離心5 min，取上清液經(jīng)0.22 μm有機(jī)系濾膜過濾后LC-MS/MS分析。

1.5 色譜質(zhì)譜分析條件

色譜柱：Nova-Pak C18色譜柱（4 μm，3.9 mm×150 mm，美國Waters公司）；流動相：A相為0.1%乙酸銨水溶液，B相為甲醇；流速0.4 mL/min。梯度洗脫條件：0 min，100% A；8 min，70% A；16 min，40% A；24 min，20% A；30 min，0% A；35 min，100% A；40 min，100% A。柱溫20 ℃，進(jìn)樣量5 μL。

質(zhì)譜電噴霧正離子模式（ESI+），電噴霧電壓4 500 V，離子源溫度500 ℃；離子源輔助氣1：275.79 kPa，離子源輔助氣2：275.79 kPa。

2 結(jié)果與分析

2.1 LC-MS/MS方法優(yōu)化

2.1.1 色譜條件優(yōu)化。

分別以水或0.1%乙酸銨水溶液為流動相A，以乙腈或甲醇為流動相B，研究在不同洗脫梯度下測定2 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)樣品的分離效果。結(jié)果表明，當(dāng)流動相A為0.1%乙酸銨水溶液，流動相B為甲醇，洗脫條件為0 min，100% A；8 min，70% A；16 min，40% A；24 min，20% A；30 min，0% A；35 min，100% A；40 min，100% A時各化合物可完全分離。

2.1.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化。

采用ESI源自動注射泵進(jìn)樣手動優(yōu)化多反應(yīng)監(jiān)測掃描（MRM）定量方法。連續(xù)注射300 ng/mL各種物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行Q1全掃描確定母離子，采用Q2碎片離子掃描確定子離子，然后依次優(yōu)化去簇電壓（DP）和碰撞能量（CE），以提高靈敏度使得信號穩(wěn)定。最終選定定量離子對和最佳質(zhì)譜檢測條件見表1。

2.2 前處理條件優(yōu)化

2.2.1 萃取溶劑的選擇。

分別研究甲醇、乙醇、乙腈作為提取試劑對香味物質(zhì)提取效率的影響，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，乙醇提取效率最低，乙腈次之，甲醇提取效率最高，因此選擇甲醇作為香味成分的提取試劑。

2.2.2 萃取條件的選擇。

以甲醇為提取劑，考察了超聲輔助萃取的溫度和時間對提取效率的影響。結(jié)果表明，萃取溫度（20～50 ℃）對提取效果影響不大，且溫度過高對香味物質(zhì)會產(chǎn)生影響。提取效率隨著時間延長而增加（圖2），當(dāng)萃取時間到達(dá)30 min時，提取效率最高，之后無明顯變化。因此，選擇萃取溫度和時間分別為20 ℃和30 min。

2.3 工作曲線、檢測限和定量限

準(zhǔn)確配制系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“2.1”優(yōu)化后的條件進(jìn)行定量分析，以各標(biāo)樣成分峰面積（y）對相應(yīng)的濃度（x，ng/L）進(jìn)行線性回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、線性范圍及決定系數(shù)（表2）。由表2可知，各目標(biāo)化合物相關(guān)性良好，適合定量分析。

2.4 樣品分析

在上述優(yōu)化條件下對同一煙草樣品平行測定6次，結(jié)果見表3。將一定量的混合標(biāo)樣加到煙草樣品中，加標(biāo)樣品和未加標(biāo)樣品平行進(jìn)行前處理和定量分析。由表3可知，加標(biāo)回收率為82.43%～95.77%，RSD為2.00%～4.58%。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

采用甲醇提取煙草中香味物質(zhì)成分LC-MS/MS定量，具有操作簡便、環(huán)境友好等優(yōu)點，但此法一個顯著缺點是存在基體干擾，基體中的干擾組分在電噴霧液滴表面離子化過程中與待測組分產(chǎn)生競爭，從而影響了電噴霧的離子化效率，即待測組分離子化效率與進(jìn)入電噴霧離子源的基體有密切關(guān)系。如圖3可見，香味物質(zhì)信號隨葡萄糖增加而顯著下降。

從葡萄糖和各香味物質(zhì)選擇離子流色譜圖（圖4）可以看出，葡萄糖保留時間在5 min之前，而各香味成分保留時間在10 min之后，因此可以利用保留時間的不同，對干擾成分和目標(biāo)成分進(jìn)行分離處理。

圖5所示的是樣品經(jīng)甲醇超聲提取后直接進(jìn)樣分析結(jié)果，葡萄糖對待測組分信號產(chǎn)生極大的干擾，γ-丁內(nèi)酯和4-羥基-2，5-二甲基呋喃酮基線升高，β-紫羅蘭酮、2-乙酰呋喃、甲基環(huán)戊烯醇酮信號較弱且雜峰較多。該研究根據(jù)葡萄糖和香味成分保留時間差值較大，采用基體柱后分離技術(shù)，在2 min時使用切換閥把糖分切入廢液瓶，向質(zhì)譜里通入甲醇溶劑，5 min時把切換閥切回至原來位置，使香味成分進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行測定，這樣可消除糖引起的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果如圖6所示，待測組分信號顯著增強。

3 結(jié)論

該研究利用糖基體的色譜保留時間小于香味成分，建立了基體柱切換-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法直接測定煙草中弱極性香味成分方法。該方法可以有效消除香味成分測定過程中的假陽性問題，消除了基質(zhì)抑制的現(xiàn)象，并免除了樣品衍生化處理過程，具有前處理過程簡單、省時和重復(fù)性好且靈敏度高等優(yōu)點，適用于煙草中香味成分的快速、準(zhǔn)確測定。

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