鐘文文 劉婷婷 趙志龍

摘要 對臨沂市蘭陵縣蒼山大蒜貯藏期病害情況進行了調(diào)查，采用柯赫氏法則和病斑顯微觀察法對病原菌株lyu20170012進行了驗證，并通過形態(tài)學特征和rDNA ITS序列分析對其進行了鑒定。結(jié)果表明，從病斑上分離得到4種真菌和1種細菌，經(jīng)致病性檢測發(fā)現(xiàn)菌株lyu20170012具有致病性，將lyu20170012菌株鑒定為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。

關(guān)鍵詞 尖孢鐮刀菌；大蒜鱗莖病害；柯赫氏法則；病原菌

中圖分類號 S432.4+2 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）21-0140-05

Abstract The investigation on Cangshan garlic storage diseases in Lanling County of Linyi City was carried out. The pathogenity of pathogenic strain lyu20170012 was detected and verified by the Koch and the microscopic observation. Results showed as followed： four kinds of fungi and one kind of bacteria were isolated from the Cangshan garlic lesion；the lyu20170012 strain was identified as Fusarium oxysporum by morphological characteristics and rDNA ITS sequence analysis.

Key words Fusarium oxysporum；Garlic diseases；Koch；Pathogenic fungi

大蒜（Allium sativum），是著名的兼有藥效的蔬菜，屬百合科多年生草本植物，以鱗莖入藥，具止痢、止咳、健胃、殺菌、驅(qū)蟲之功效，南、北各省均有栽植，原產(chǎn)中亞，栽培歷史悠久[1]。蒼山大蒜也稱作“蘭陵大蒜”，亦稱“葫”或“葫蒜”，產(chǎn)于“中國蒜鄉(xiāng)”山東省臨沂市蘭陵縣。蒼山大蒜歷史悠久，是在蘭陵縣特定的生態(tài)環(huán)境條件下，經(jīng)過長期的自然選擇和人為定向培育而形成的蘭陵特有品種，為山東省傳統(tǒng)名特蔬菜之一，是中國出口的優(yōu)質(zhì)大蒜。

蒼山大蒜隨著種植面積的逐年擴大，大蒜有害生物亦呈快速增加趨勢，危害越來越大。在大蒜生長期間和倉儲期間，有害生物的危害造成蒜薹、蒜頭減產(chǎn)和霉爛[2]。蒜頭（大蒜鱗莖）在貯藏調(diào)運期間可發(fā)生多種病害，引起蒜頭腐爛和污損，嚴重降低其商品價值和種用價值。大蒜鱗莖（蒜頭）是重要的市場和產(chǎn)地檢疫農(nóng)產(chǎn)品，蒜頭病害還是出境植物檢疫的重要對象，鱗莖腐爛是引起大蒜減產(chǎn)的主要因素[3]。因此，進一步加強大蒜貯藏期鱗莖病害的研究有著重要意義。

目前國內(nèi)外有很多關(guān)于大蒜病害的研究報道。Matuo等[4]報道尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f.sp.cepae）可以導致大蒜鱗莖基腐病。Kwon[5]研究報道，齒梗孢屬真菌（Sclerotium rolfsii）可以引起大蒜莖腐爛病。Lee等[6]研究報道，埃里格孢（Embellisia allii）可引起大蒜鱗莖潰瘍病和黑斑病，而且常常與病原菌（Fusarium oxysporum f.sp.cepae）混合互作、共同為害。群體效應是近來日益受到廣泛關(guān)注的一種細菌群體行為調(diào)控機制，是一種信號介導的細胞-細胞的通訊系統(tǒng)。QQ效應化合物和酶可在胡蘿卜、大豆、豌豆苗、辣椒、大蒜等植物中天然存在[7]。Pontin等[8]研究表明，大蒜感染白腐病Sclerotium cepivorum病原后，可產(chǎn)生萜烯類抗真菌物質(zhì)。Chand等[9]研究表明，miRNA394可調(diào)控大蒜病原菌[F.oxysporum f.sp.cepae（FOC）]的感染機制。Gálvez等[10]報道引起西班牙貯藏期大蒜鱗莖腐爛病的病原是層生鐮刀菌（F.proliferatum），它是一種世界性廣泛分布種，還可為害其他一些作物。葛蕓英等[3]報道了尖孢鐮刀菌是引起江蘇太倉及南京周邊大蒜鱗莖腐爛病的病原之一。張軍高等[11]報道了甘肅省大蒜干腐病病原菌是尖孢鐮刀菌、輪枝鐮刀菌和茄病鐮刀菌。商鴻生等[12]對大蒜鱗莖病害進行了系統(tǒng)調(diào)查，包括灰霉病、曲霉病、青霉病、紅腐病、炭疽病、白腐病（黑腐小核菌?。⒓t粉病、黑斑病、軟腐病、病毒病害11種病害。盛紅梅等[13]報道甘肅省大蒜主要產(chǎn)區(qū)的病害調(diào)查和病原鑒定，共發(fā)現(xiàn)大蒜病害14種，其中真菌性病害9種，細菌性病害1種，主要包括白腐病、白斑病、紫斑病、花葉病、黑頭病、葉霉病、青霉病、煤斑病、銹病、軟腐病等[14]。有關(guān)蒼山大蒜鱗莖病害的致病菌鮮見報道。筆者對山東省蒼山大蒜鱗莖病原菌進行了調(diào)查與研究，旨在為大蒜的防控提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 病害調(diào)查

2016年1月至2017年11月對臨沂市蘭陵縣大蒜貯藏期病害情況進行了調(diào)查，調(diào)查發(fā)現(xiàn)蒼山大蒜在貯藏期間發(fā)生較為嚴重的病害，對感病情況、病原種類及發(fā)生癥狀進行了觀察、記錄和拍照。

1.2 病原菌的鑒定

1.2.1 病原菌的分離和純化。

采用常規(guī)的組織分離方法，將病原菌置于PDA培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)7～14 d。在體視鏡下挑取適量孢子和菌絲，制成臨時玻片，在顯微鏡下觀察，待菌絲和孢子形態(tài)特征完全一致時，即可利用單孢分離法再次轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，得到的菌株為純菌株。

1.2.2

致病性測定。

分別以病原菌的菌絲塊作為接種體對其在蒜瓣上的致病性進行測定。選擇健康的蒜瓣進行接種，蒜瓣先用75%乙醇進行表面消毒，再分有傷口（用無菌毛筆在葉片表面刷3次）接種和無傷口接種，以有傷口不接種和無傷口不接種為對照，接種后保濕24 h，每隔1～2 d觀察癥狀。發(fā)病后，從病斑再次分離病原菌，并與原接種菌進行比較。

1.2.3 病原菌的確認。

1.2.3.1 柯赫氏法則驗證。

將純化后的菌株重新接種到健康的大蒜蒜瓣上，回接7～9 d，接種菌絲塊觀察有刺傷的和無刺傷的蒜瓣發(fā)病癥狀與田間觀察到的是否相同，并設置不接種作為對照。用發(fā)病的病斑進行常規(guī)分離，證明發(fā)病菌是否為大蒜病原菌。

1.2.3.2

蒜瓣組織解剖觀察驗證。

選取含有病斑的大蒜蒜瓣，用清水沖洗干凈，然后再用無菌水洗1～3次，保證蒜瓣表面未附著其他微生物和塵土顆粒。利用徒手切法，切取病斑及其周圍的組織，選取合適材料制成玻片，進行病原菌的顯微觀察和驗證。

1.2.4 病原菌形態(tài)學的特征觀察。

1.2.4.1 病原菌的培養(yǎng)性狀觀察。將病原菌移接于PDA平板上，25 ℃培養(yǎng)7～8 d，記錄菌落形態(tài)和顏色，觀察分生孢子的形狀和大小等形態(tài)學特征。

1.2.4.2

病原菌的顯微特征觀察。在培養(yǎng)后的樣品菌落上，挑取菌絲和孢子，制片觀察其顯微特征，同時參照有關(guān)資料進行菌種的形態(tài)學鑒定。

1.2.5 病原菌rDNA-ITS的擴增與序列分析。

1.2.5.1

病原菌總DNA的提取。選擇試驗菌株，采用馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB），28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)3～4 d，離心收集菌絲體，經(jīng)冷凍干燥后置于-20 ℃冰箱保存。利用OMEGA公司試劑盒提取DNA。

1.2.5.2

rDNA-ITS的擴增與序列測定。采用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）擴增該病原菌的ITS和5.8S rDNA。PCR反應采用50 μL反應體系，包括2 μL（約10 ng）模板DNA溶液、5.0 μL 10×PCR buffer、4.0 μL 2.5 mmol/L dNTP、7.5 pmol/μL ITS1和ITS4引物各1.5 μL、0.5 μL 5 U/μL Taq酶（含MgCl2），加ddH2O至50 μL。擴增反應程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性1 min、55 ℃退火1 min、72 ℃延伸1.5 min，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測以后，直接委托山東省農(nóng)業(yè)科學院測序中心進行純化和序列測定。

1.2.5.3

病原菌rDNA ITS序列同源性比較。將供試菌株的rDNA ITS序列在NCBI網(wǎng)站上用Blast軟件與GenBank中已知種屬的rDNA進行序列比對和同源性分析，再結(jié)合DNAMAN和mega 6.0軟件進行同源性比較分析，從而對供試菌株進行分子鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒜瓣的危害與癥狀特點

對蒼山縣采收的新鮮大蒜、市售大蒜和倉儲大蒜進行了抽樣調(diào)查。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，蒜頭病害種類復雜，其發(fā)生規(guī)律不盡相同。初侵染菌源有的來自田間，有的來自貯藏處所。有些病害在田間已經(jīng)發(fā)生，在貯運期間進一步發(fā)展。有些病原菌在田間侵害蒜株部，造成根部腐爛，在貯運期間由根部蔓延到蒜頭基部，蒜瓣變黃褐色，干枯。調(diào)查表明，蒜頭內(nèi)在質(zhì)量較差、生活力降低或收獲貯運期間受到機械損傷，是貯運病害發(fā)生的主要內(nèi)在因素。大部分貯蒜病害的病原菌腐生性較強，分布很廣，蒜頭不論在田間還是在貯運過程中都要被病原菌污染。貯藏期間通風不暢，蒜頭受潮發(fā)熱，則是主要的外部條件。做好田間病害防治，保持貯運環(huán)境衛(wèi)生，盡量減少菌原很重要。貯運條件對蒜頭病害的發(fā)生起著關(guān)鍵作用。在隨機抽樣調(diào)查的蒜頭中，蒜瓣感病率達6%～10%，表明大蒜倉儲期病害發(fā)生較嚴重，嚴重影響大蒜的質(zhì)量和蒜農(nóng)的收益。

大蒜鱗莖受害后，感病蒜瓣，病斑顏色呈褐色、黑色或青色，凹陷，變硬或者變軟、收縮或者濕潤狀，有時可見表面長出黑色粉狀物、青色粉狀物或者白色絨毛，有時呈半透明淡褐色等?？傊?，大蒜鱗莖受害后的癥狀因病原物的不同而各有不同。

2.2 病原菌的鑒定

2.2.1 病原菌的分離和純化。

從蘭陵縣蒼山大蒜基地采集樣品500份，從中選取代表性感病蒜瓣，于PDA培養(yǎng)基平板上分離病原菌，25 ℃下培養(yǎng)，各標樣均長出不同的菌落，通過菌落特征和顯微特征觀察，參照有關(guān)資料，將大蒜蒜瓣病斑分離物初步鑒定為以下5種：A曲霉（Aspergilus sp.），B青霉（Penicillium sp.），C枯草芽孢桿菌（Bacillus sp.），D、E鐮刀菌（Fusarium sp.）。以上分離物的屬種歸屬和致病性需要進一步驗證，其菌落形態(tài)見圖1。該研究只對致病較強的鐮刀菌進行了深入研究，其他分分離物的致病性尚未研究。

2.2.2 病原菌的確認。

采用柯赫氏法則驗證，將分離得到的菌株重新接種到健康的大蒜蒜瓣上，回接7～9 d，接種菌絲塊的大蒜蒜瓣全部發(fā)病，有刺傷的葉片發(fā)病比無刺傷的葉片早1～2 d，癥狀與田間觀察

到的相同，對照不發(fā)??；用發(fā)病的病斑進行常規(guī)分離，再次獲得與原分離菌基本一致的病原菌，根據(jù)柯赫氏法則，證明接種菌即為大蒜蒜瓣的病原菌。經(jīng)驗證5種分離物中，致病性為尖孢鐮刀菌>枯草芽孢桿菌>變紅鐮刀菌>曲霉>青霉。該研究只對尖孢鐮刀菌進行了測序和鑒定等。大蒜病原菌尖孢鐮刀菌驗證性試驗結(jié)果見圖2。

2.2.3 病原菌的形態(tài)特征。

2.2.3.1

分離物的培養(yǎng)性狀觀察。將大蒜蒜瓣的病斑分離物培養(yǎng)后，其菌落形態(tài)特征見圖3。在PDA培養(yǎng)基平板上，25 ℃培養(yǎng)7 d，直徑達9 mm，菌落平展，絨毛狀，灰白色，背觀淡褐色。培養(yǎng)14 d后菌落為粉色。

2.2.3.2 顯微特征觀察及形態(tài)學鑒定。

（1）自然基質(zhì)上的顯微特征觀察。選取含有病斑的大蒜蒜瓣，用清水沖洗干凈，再用70%乙醇浸泡1～3 min，無菌水洗1～3次，保證葉片表面未附著其他微生物和塵土顆粒。利用徒手切法，采用縱向和橫向的方法切取病斑及其周圍的葉片組織，選取合適材料制成玻片，用于病原菌的顯微觀察和驗證。由圖4可知，大蒜蒜瓣內(nèi)部未見病原菌的菌絲分布等，只能觀察到大蒜變褐部分有病原孢和菌絲孢子的存在，孢子和菌絲在蒜瓣表面分布多聚集在傷口周圍，其他部分偶有零星分布；菌絲淡褐色，有分枝，偶見膨大厚垣細胞和褐色細胞的集合體，菌絲體整體與分離培養(yǎng)物的狀態(tài)較為一致，菌絲寬度2～10 μm，膨大端部細胞寬度達18 μm。病斑上發(fā)現(xiàn)的其他真菌在病原深層組織中分布較少，表明其他真菌可能是空氣中的污染菌。

（2）PDA培養(yǎng)基上的顯微特征。在25 ℃PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d，形成圓形菌落。菌落平展，生長速度快，菌落灰白色，菌絲部分埋生，部分表生。背面淡褐色。菌絲淡色，有分枝，表面光滑，有隔膜，菌絲寬度3～13 μm（圖5-B）。產(chǎn)孢梗多對生，偶見輪生和其他著生方式，柱狀或者倒棒狀，有時為產(chǎn)包瓶體直接側(cè)生于菌絲上或者端生。分生孢子卵形、梭形，大小不等，（3～12）μm×（1～3）μm，極少見彎曲鐮刀型孢子，表面光滑，淡褐色，無隔膜，兩端尖細，產(chǎn)孢量較大（圖5-A和圖5-C）。

2.2.4 病原菌rDNA-ITS的序列分析及同源性。

因為真菌形態(tài)學特征受培養(yǎng)基和基質(zhì)的影響較大，所以單純進行形態(tài)學分類還缺乏一定的科學性。為保證病原菌鑒定的準確性，該研究對分離得到的幾種病原物進行了分子生物學輔助鑒定。對1～5號菌分別進行了rDNA-ITS序列分析，對7號細菌進行了16S rRNA序列測定。其中，5號菌株lyu20170012的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖6），得到1個約507 bp的片段基因序列。

將菌株lyu20170012的rDNA ITS基因序列與GenBank中已有的DNA序列進行同源性比較，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，與其同源性100%的菌株種類均為Fusarium oxysporum，這些同源性菌株登錄號為MF435932.1、MF435931.1、KY090780.1、KY090783.1、KX343149.1、KX343146.1、MF355380.1、MF355379.1、MF305836.1、LT841236.1、LT841222.1、MF136593.1、KX276606.1。再結(jié)合其形態(tài)學特征，最終將該病原菌為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。

3 結(jié)論與討論

通過對蒼山大蒜貯藏期鱗莖感病情況調(diào)查，發(fā)現(xiàn)蒜瓣感病率在10%以上。對病斑菌群進行了分析，發(fā)現(xiàn)了5種微生物，其中1種為枯草芽孢桿菌，其他為真菌，它們分別為青霉、曲霉、根霉、變紅鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、匐柄霉。根據(jù)致病性測定，發(fā)病最嚴重的是尖孢鐮刀菌，其次為解淀粉芽孢桿菌，其他依次為變紅鐮刀菌、黑曲霉、青霉和匐柄霉。該研究只對尖孢鐮刀菌進行了詳細研究。結(jié)合形態(tài)學特征和分子生物學技術(shù)，最后確定病原為尖孢鐮刀菌，該菌在蒼山大蒜上首次發(fā)現(xiàn)。其他真菌的致病性正在陸續(xù)研究之中。由此看出，倉儲期大蒜蒜瓣病害的病原菌不是單一的，有時是混合菌群，而且每個蒜瓣的病原菌群可能有所差別。

大蒜真菌類疾病，主要為害近地面假莖基部或貯存的鱗莖，嚴重時影響大蒜的產(chǎn)量和質(zhì)量。大蒜病害主要有大蒜葉枯病、大蒜莖腐病、大蒜紫斑病、大蒜細菌性軟腐病、大蒜灰霉病、大蒜銹病及大蒜病毒病等[7]。該研究首次報道蒼山大蒜鱗莖病原物為尖孢鐮刀菌。

大蒜為百合科蔥屬多年生草本植物，是各國人民喜愛的香辛類蔬菜，在世界各地普遍種植。大蒜不僅是人們常用的安全無毒、無公害、無殘留的調(diào)味品，而且是成本低、無毒、無副作用、具有獨特的藥理和營養(yǎng)保健功能。大蒜由于具有較高的營養(yǎng)保健和藥用價值而成為國際研究的熱點[15]。摸清蒼山大蒜倉儲期病害種類，開發(fā)研制防控貯藏期大蒜病害新技術(shù)具有廣闊的前景。

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