功能基因?qū)π←溍缙诓煌姿较赂敌誀畹挠绊?/h1>
2018-05-14 08:59:49于海濤宋順趙春華
安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年21期 關(guān)鍵詞：小麥
于海濤 宋順 趙春華
摘要 [目的]研究功能基因?qū)π←溍缙诓煌姿较赂敌誀钣绊?。[方法]以科農(nóng)9204與京411構(gòu)建的KJ-RIL群體為材料，進(jìn)行苗期低氮、低磷及對(duì)照水培。對(duì)苗期根系性狀結(jié)合10個(gè)功能標(biāo)記進(jìn)行基因型分類匯總分析。[結(jié)果]高分子量麥谷蛋白Glu-A1、Glu-B1，小麥細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶基因TaCwi-A1，小麥黃色素含量基因Psy-B1等顯著影響對(duì)照、低條件小麥苗期根系的主根長(zhǎng)、根體積、根面積、根尖數(shù)以及總根長(zhǎng)，且影響不完全一致；小麥多酚氧化酶基因PPO-A1對(duì)低磷條件下根系性狀影響較大；矮稈基因Rht-B1b、Rht-B1a僅影響苗期株高，低分子量麥谷蛋白Glu-A3、小麥蔗糖合成酶基因TaSus2、籽粒硬度相關(guān)基因Pinb等對(duì)根系性狀無明顯效應(yīng)。[結(jié)論]該研究為小麥合理施肥提供理論依據(jù)。
關(guān)鍵詞 小麥；根系性狀；功能基因
中圖分類號(hào) S512.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）21-0055-06
Abstract [Objective] To research the effects of functional genes on root traits of wheat at different nitrogen and phosphorus levels at seedling stage. [Method]With a recombinant inbred line （RIL） population derived from two Chinese winter wheat varieties Kenong9204 and Jing411 as the research mateirals， we studied the root morphology at seedling stage under normal nitrogen （CK） condition， low nitrogen （LN） condition， and low phosphorus condition. Genetic effects of ten known genes on root related traits were studied using the corresponding functional markers. [Result] GluA1， GluB1， TaCwiA1 and PsyB1 were significantly correlated with root morphology including main root length， root volume， root area， tip number and the total root length under CK and LN conditions. These effects were distinct to some extent under different nutrition conditions. PPOA1 are significantly correlated with root morphology under LP condition. RhtB1b and RhtB1a were significantly correlated with the height in seedling stage. GluA3， TaSus2 and Pinb did not have any effects on root morphology at seedling stage. [Conclusion] This research provided theoretical foundation for the rational fertilization of wheat.
Key words Wheat；Root traits；Functional gene
根系是小麥吸收水分和營(yíng)養(yǎng)的主要器官，根系的生長(zhǎng)、根群分布、根系構(gòu)型、不同發(fā)育時(shí)期的根系吸收水分和養(yǎng)分的活力以及不同環(huán)境條件下根系的變化，都會(huì)影響小麥的生物發(fā)育及最終產(chǎn)量[1]。小麥為異源六倍體，基因組巨大，80%以上為重復(fù)序列。根系作為數(shù)量性狀極易受環(huán)境的影響，給小麥根系的科學(xué)研究帶來阻礙[2-4]。目前，對(duì)于小麥根系的研究較少，大多限于表型或正向遺傳學(xué)的研究方法。
功能標(biāo)記是與表型相關(guān)的功能基因基序中功能性單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)開發(fā)而成的新型分子標(biāo)記[5]。由于不需要進(jìn)一步驗(yàn)證就可以在不同的遺傳背景下確定目標(biāo)等位基因的有無，目前功能標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于品種的鑒定和分子輔助育種[6-8]。Ellis等[9]開發(fā)了矮稈基因Rht1、Rht2 和Rht8 的分子標(biāo)記；He等[10]開發(fā)的多酚氧化酶（PPO）活性等位基因[10]；He等[11-12]開發(fā)了八氫番茄紅素合成酶（PSY）等位變異基因；Jiang等[13]和Ma等[14]分別開發(fā)了TaSus2、TaCwi-A1等產(chǎn)量相關(guān)基因標(biāo)記；科研人員還研究了高低分子麥谷蛋白[15-17]、籽粒硬度[18]等品質(zhì)相關(guān)性狀功能標(biāo)記在以科農(nóng)9204和京411構(gòu)建的KJ-RIL群體中的分離情況。在此基礎(chǔ)上，筆者以科農(nóng)9204與京411構(gòu)建的KJ-RIL群體為材料，進(jìn)行苗期低氮、低磷及對(duì)照水培；對(duì)苗期根系性狀結(jié)合10個(gè)功能標(biāo)記進(jìn)行基因型分類匯總分析，研究不同氮磷條件下各功能基因?qū)π←湼档挠绊憽?/p>
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料
試驗(yàn)所用材料為科農(nóng)9204、京411及以兩者為親本構(gòu)建的188個(gè)F6：7代重組近交系群體（簡(jiǎn)稱KJ-RIL群體）。
1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)
試驗(yàn)共設(shè)3個(gè)處理：處理T1于2012年11月在北京（116.46° E；39.92° N）進(jìn)行，共21 d，對(duì)188個(gè)KJ-RIL群體的前1-94家系（KJ-RIL1-94）分別進(jìn)行正常對(duì)照（CK）、低氮（LN）和低磷（LP）處理；處理T2于2012年12月在北京（116.46° E；39.92° N）進(jìn)行，共28 d，對(duì)188個(gè)KJ-RIL群體的前1-94家系（KJ-RIL98-188）分別進(jìn)行正常對(duì)照（CK）、低氮（LN）和低磷（LP）處理；處理T3于2014年11月在石家莊（114.51° E；38.04° N）進(jìn)行，共16 d，對(duì)188個(gè)KJ-RIL群體的1-188家系（KJ-RIL1-188 ）分別進(jìn)行正常對(duì)照（CK）和低氮（LN）處理。
1.3 苗期根系性狀的表型測(cè)定
共設(shè)置對(duì)照（CK：2 mmol/L NO3-+0.2 mmol/L PO43-）、低氮（LN：0 mmol/L NO3-+0.2 mmol/L PO43-）和低磷（LP：2 mmol/L NO3-+0 mmol/L PO43-）共3個(gè)處理。營(yíng)養(yǎng)液配方參考An等[3]對(duì)小麥苗期氮吸收研究中所用方法。選種時(shí)挑選飽滿、均勻的小麥種子于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，5‰ H2O2浸泡處理24 h，然后用去離子水清洗3次并用適量去離子水浸泡放置于常溫，待其露白后置于4 ℃環(huán)境下2 d，取出置于常溫。7 d后長(zhǎng)至一葉一心期選擇生長(zhǎng)一致的健壯幼苗去胚乳移至1/2營(yíng)養(yǎng)液中緩苗3 d，再換為完全培養(yǎng)液培養(yǎng)液（pH=6.0）。培養(yǎng)箱放置于溫室內(nèi)，由吹氧機(jī)補(bǔ)氧（1 h/1 d），并隨機(jī)調(diào)換擺放位置。保持溫度夜間（125 ℃）、日間（225 ℃），相對(duì)濕度50%～70%，每日光照12 h，移栽后第n天取樣，測(cè)其株高（PH）、最大根長(zhǎng)（RL）、胚芽鞘長(zhǎng)度（CL）；將莖葉部和根部分開，利用ScanMaker i800 plus掃描儀（300 DPI分辨率）對(duì)根部掃描后應(yīng)用萬深LA-S根系分析系統(tǒng)批量處理分析根系圖片并逐一進(jìn)行精確修正獲得總長(zhǎng)（RL）、根表面積（RS）、根體積（RV）、根直徑（RD）和根尖數(shù)（RT）等參數(shù)。然后把幼苗放在烘箱里100 ℃殺青20 min，80 ℃烘干至恒重，稱量株干重（PDW）、根干重（RDW）、莖葉干重（SLDW）。
1.4 DNA的提取和PCR分析
采用CTAB法[19]提取供試材料的基因組DNA，略作調(diào)整。擴(kuò)增反應(yīng)在TakaRa PCR thermal cycler上進(jìn)行，25 μL體系中加入DNA（30 ng/μL）2 μL，10×Buffer 2 μL，Mg2+（25 mmol/L）1.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）1.5 μL，TaqE（5 U/μL）0.2 μL，Primer（25 μmol/L）1.5 μL + 1.5 μL；所有引物均使用降落PCR（Touchdown PCR），即94 ℃變性4 min，接著15個(gè)循環(huán)的復(fù)性溫度降落程序，每個(gè)循環(huán) 94 ℃變性45 s，65 ℃復(fù)性50 s（-1 ℃/循環(huán)）和72 ℃延伸55 s；最后30 個(gè)循環(huán)的普通PCR程序即：94 ℃ 變性40 s，50 ℃復(fù)性 40 s，72 ℃延伸40 s；最后72 ℃ 延伸5 min；擴(kuò)增結(jié)束后10 ℃保存。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用6%的聚丙烯酰胺非變性凝膠（39∶1）電泳進(jìn)行檢測(cè)，硝酸銀染色后，觀察并拍照。
1.5 分子標(biāo)記
該研究所用15個(gè)功能分子標(biāo)記信息見表1。其中小麥品質(zhì)相關(guān)功基因的能標(biāo)記包括Glu-B1、Ax2*、Glu-A3 、Psy-B1和 PPO[10-12，15-17]；產(chǎn)量相關(guān)功基因的能標(biāo)記包括TaCwi-A1和TaSus2-2B[13-14]；株高相關(guān)功基因的能標(biāo)記包括Rht-B1a和Rht-B1B[9] 。
2 結(jié)果與分析
2.1 科農(nóng)9204和京411的基因型分析
15個(gè)功能標(biāo)記在科農(nóng)9204和京411中的擴(kuò)增結(jié)果見圖1。擴(kuò)增結(jié)果顯示，高分子量麥谷蛋白亞基Glu-B1功能標(biāo)記ZSBy9aF1/R3在科農(nóng)9204中擴(kuò)增出662 bp目的片段，在京411中擴(kuò)增出707 bp的片段，結(jié)合高分子量麥谷蛋白SDS-PAGE結(jié)果，科農(nóng)9204在Glu-B1的等位基因是7+9，京411在Glu-B1的等位基因?yàn)?+12。同理，科農(nóng)9204在Glu-A3的等位基因是Glu-A3b或者Glu-A3d，京411在Glu-A3的等位基因是Glu-A3a或者Glu-A3c?？妻r(nóng)9204在TaCwi-A1具有降低粒重的TaCwi-A1b等位基因，京411在TaCwi-A1具有增加粒重的TaCwi-A1a等位基因。科農(nóng)9204在TaSus2-2B具有增加千粒重的優(yōu)異等位基因，而京411在TaSus2-2B具有降低粒重的非優(yōu)異等位基因?？妻r(nóng)9204在小麥籽粒硬度的關(guān)鍵基因位點(diǎn)Pinb-D1等位基因?yàn)镻inb-D1b，京411在該位點(diǎn)的等位基因?yàn)镻inb-D1a。科農(nóng)9204、京411在小麥黃色素含量基因Psy-B1的等位基因分別是Psy-B1b和Psy-B1c。而高分子谷蛋白Glu-A1亞基AX2、多酚氧化酶基因PPO等位基因PPO33僅在京411中檢測(cè)到1250和380 bp的目的片段，表明京411中含有高分子谷蛋白Glu-A1亞基AX2和多酚氧化酶基因PPO等位基因PPO33，科農(nóng)9204不含兩等位基因。矮稈基因功能標(biāo)記Rht-B1b和Rht-B1a分別在科農(nóng)9204和京411中檢測(cè)到237和237 bp的目的片段，表明科農(nóng)9204和京411在Rht-B1位點(diǎn)的等位基因分別是Rht-B1b和Rht-B1a。
2.2 功能標(biāo)記在188個(gè)KJ-RIL家系的基因型分析
由于同一基因的多個(gè)功能標(biāo)記表現(xiàn)為共分離，以10個(gè)基因位點(diǎn)對(duì)其在188個(gè)KJ-RIL家系中基因型值分離情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。由表2可知，Glu-B1、Ax2*、Glu-A3 、TaCwi-A1和TaSus2-2B位點(diǎn)在188個(gè)KJ-RIL家系中均符合1∶1分離比例；Psy-B1和 PPO共2個(gè)位點(diǎn)在188個(gè)KJ-RIL家系中不符合1∶1分離比例，遺傳比例均偏向京411。
2.3 不同處理功能基因?qū)Ω敌誀畹挠绊?/p>
2.3.1
高分子量麥谷蛋白Glu-A1。 由圖2可知，T3處理CK條件下，來自科農(nóng)9204 Glu-A1的等位基因AX2顯著增加小麥根系體積、根面積，LN條件下顯著增加小麥根系體積；T1、T2處理兩表基因型間雖未達(dá)顯著差異，但整體趨勢(shì)一致。因此，來自科農(nóng)9204 高分子量麥谷蛋白基因Glu-A1的等位基因AX2增加CK和LN條件下根體積以及LN條件下的根面積。
2.3.2
高分子量麥谷蛋白Glu-B1。由圖3可知，T1和T3處理CK條件下，來自于科農(nóng)9204 Glu-B1的等位基因7+9相對(duì)于京411的2+12 顯著降低小麥根系的總根長(zhǎng)、根面積、根體積；另外，CK條件下的根尖數(shù)，LN條件下苗期株高、總根長(zhǎng)、根面積雖僅在T1處理兩基因型表型間差異顯著，但在T2和T3處理中整體趨勢(shì)一致。因此，高分子量麥谷蛋白Glu-B1的等位基因7+9相對(duì)2+12顯著降低CK條件下小麥根系總根長(zhǎng)、根面積、根體積，以及LN條件下根系根尖數(shù)以及苗期株高。
2.3.3 細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶TaCwi-A1。由圖4可知，T3處理中CK和LN條件下，相對(duì)于京411增加粒重的TaCwi-A1a等位基因，來自于科農(nóng)9204具有降低粒重效應(yīng)的TaCwi-A1等位基因TaCwi-A1b可顯著提高小麥根系根尖數(shù)和主根長(zhǎng)，其中根尖數(shù)在T1和T2處理中整體趨勢(shì)一致，但主根長(zhǎng)在低氮低磷環(huán)境下表型復(fù)雜多變。T2處理中LN條件下，TaCwi-A1b相對(duì)于TaCwi-A1a可提高總根長(zhǎng)、根尖數(shù)。因此，相對(duì)于TaCwi-A1a，細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶TaCwi-A1等位基因TaCwi-A1b顯著增加CK條件下的小麥根系主根長(zhǎng)、根尖數(shù)，以及LN條件下的總根長(zhǎng)、根尖數(shù)。
2.3.4
黃色素含量基因Psy-B1。由圖5可知，T2和T3處理中CK和LN條件下，相對(duì)于來自京411的Psy-B1c，來自于科農(nóng)9204 Psy-B1的等位基因Psy-B1b顯著增加小麥根系主根長(zhǎng)。
2.3.5 多酚氧化酶PPO。 由圖6可知，CK條件下，T1處理中相對(duì)于來自于京411的等位基因Ppo-A1b，來自于科農(nóng)9204 PPO的等位基因Ppo-A1a顯著降低根體積，但與T3處理的整體趨勢(shì)不一致；LN條件下，無明顯效應(yīng)；LP條件下，相對(duì)于來自于京411的等位基因Ppo-A1b，T1處理中來自于科農(nóng)9204 PPO的等位基因Ppo-A1a顯著降低小麥根系總根長(zhǎng)、根面積、根尖數(shù)，與T2處理趨勢(shì)一致。
因此，在CK和LN氮條件下，PPO33對(duì)根系影響復(fù)雜，且易受環(huán)境影響；LP條件下PPO的等位基因Ppo-A1a相對(duì)于Ppo-A1b可顯著降低小麥根系總根長(zhǎng)、根面積和根尖數(shù)。
2.3.6
矮稈基因Rht-B1b和Rht-B1a。由圖7可知，T1、T2處理中CK、LN、LP條件下，來自于科農(nóng)9204的突變型Rht-B1a和來自于京411的野生型Rht-B1b均顯著降低小麥苗期株高。
2.3.7 低分子量麥谷蛋白基因GluA3。與來自京411等位基因Glu-A3a/Glu-A3c相比，CK條件下T1處理中來自科農(nóng)9204的等位基因Glu-A3b/Glu-A3d顯著增加小麥苗期株高、根系總根長(zhǎng)、根面積、根體積；T2處理雖未達(dá)顯著水平，但基本一致；T3處理的一致性較差； LN條件下，T1處理增加苗期株高，但T2處理降低株高； LP條件下，T1、T2、T3處理各根系性狀基因型間無顯著差異。由此可見，低分子量麥谷蛋白基因GluA3對(duì)根系影響復(fù)雜，且在不同環(huán)境中表達(dá)不穩(wěn)定。
2.3.8
蔗糖合成酶基因TaSus2。相對(duì)于來自于京411無此標(biāo)記的家系，在CK條件下T3處理中含來自科農(nóng)9204的高千粒重單倍型功能標(biāo)記Sus2-SNP-185/589H2的家系主根長(zhǎng)顯著增大，與T2、T1處理的整體趨勢(shì)不一致；相對(duì)于來自于京411無此標(biāo)記的家系，在LN和LP條件下T2處理中含來自科農(nóng)9204的高千粒重單倍型功能標(biāo)記Sus2-SNP-185/589H2的家系小麥根系面積、根體積、總根長(zhǎng)、根尖數(shù)顯著降低，T2、T1處理的整體趨勢(shì)不一致。因此，蔗糖合成酶基因TaSus2對(duì)根系影響復(fù)雜，且在不同環(huán)境中表達(dá)不穩(wěn)定。
2.3.9
籽粒硬度Pinb。在CK、LN、LP條件下，T1、T2、T3處理中根系各性狀中均未檢測(cè)到顯著差異。因此，籽粒硬度相關(guān)基因Pinb對(duì)根系無顯著性影響。
3 結(jié)論與討論
功能基因組學(xué)和生物信息學(xué)的飛速發(fā)展、基因功能標(biāo)記的開發(fā)與應(yīng)用為小麥等重要農(nóng)作物分子育種以及品種鑒定帶來了新思路、新發(fā)展。該研究基于功能基因的“一因多效”，將標(biāo)記檢測(cè)信息和小麥根系性狀緊密聯(lián)系起來，建立一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，分析已知功能基因?qū)π←溍缙诟抵鞲L(zhǎng)、根體積、根面積、根尖數(shù)以及總根長(zhǎng)的遺傳效應(yīng)。
高分子谷蛋白Glu-B1以及Glu-A1亞基AX2不同等位基因在對(duì)照、低氮處理中顯著影響小麥根系總根長(zhǎng)、根體積和根面積；多酚氧化酶PPO等位基因PPO33在低磷處理中顯著影響小麥根系的總根長(zhǎng)、根面積和根尖數(shù)；黃色素含量基因Psy-B1不同等位基因在正常和低氮條件下顯著影響小麥根系的主根長(zhǎng)。這表明高分子谷蛋白Glu-B1、Glu-A1，多酚氧化酶PPO，黃色素含量基因Psy-B1等除影響小麥高分子谷蛋白含量、多酚氧化酶活性、黃色素含量外，對(duì)小麥根系的生長(zhǎng)也有一定的影響。
前人有研究表明，小麥株高與根系呈正相關(guān)，而該試驗(yàn)顯示多環(huán)境多處理下Rht-B1b和Rht-B1a對(duì)苗期株高均有顯著影響，但對(duì)根系一系列性狀無明顯遺傳效應(yīng)，表明小麥根系不受矮稈基因Rht-1影響。
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于海濤 宋順 趙春華
摘要 [目的]研究功能基因?qū)π←溍缙诓煌姿较赂敌誀钣绊?。[方法]以科農(nóng)9204與京411構(gòu)建的KJ-RIL群體為材料，進(jìn)行苗期低氮、低磷及對(duì)照水培。對(duì)苗期根系性狀結(jié)合10個(gè)功能標(biāo)記進(jìn)行基因型分類匯總分析。[結(jié)果]高分子量麥谷蛋白Glu-A1、Glu-B1，小麥細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶基因TaCwi-A1，小麥黃色素含量基因Psy-B1等顯著影響對(duì)照、低條件小麥苗期根系的主根長(zhǎng)、根體積、根面積、根尖數(shù)以及總根長(zhǎng)，且影響不完全一致；小麥多酚氧化酶基因PPO-A1對(duì)低磷條件下根系性狀影響較大；矮稈基因Rht-B1b、Rht-B1a僅影響苗期株高，低分子量麥谷蛋白Glu-A3、小麥蔗糖合成酶基因TaSus2、籽粒硬度相關(guān)基因Pinb等對(duì)根系性狀無明顯效應(yīng)。[結(jié)論]該研究為小麥合理施肥提供理論依據(jù)。
關(guān)鍵詞 小麥；根系性狀；功能基因
中圖分類號(hào) S512.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）21-0055-06
Abstract [Objective] To research the effects of functional genes on root traits of wheat at different nitrogen and phosphorus levels at seedling stage. [Method]With a recombinant inbred line （RIL） population derived from two Chinese winter wheat varieties Kenong9204 and Jing411 as the research mateirals， we studied the root morphology at seedling stage under normal nitrogen （CK） condition， low nitrogen （LN） condition， and low phosphorus condition. Genetic effects of ten known genes on root related traits were studied using the corresponding functional markers. [Result] GluA1， GluB1， TaCwiA1 and PsyB1 were significantly correlated with root morphology including main root length， root volume， root area， tip number and the total root length under CK and LN conditions. These effects were distinct to some extent under different nutrition conditions. PPOA1 are significantly correlated with root morphology under LP condition. RhtB1b and RhtB1a were significantly correlated with the height in seedling stage. GluA3， TaSus2 and Pinb did not have any effects on root morphology at seedling stage. [Conclusion] This research provided theoretical foundation for the rational fertilization of wheat.
Key words Wheat；Root traits；Functional gene
根系是小麥吸收水分和營(yíng)養(yǎng)的主要器官，根系的生長(zhǎng)、根群分布、根系構(gòu)型、不同發(fā)育時(shí)期的根系吸收水分和養(yǎng)分的活力以及不同環(huán)境條件下根系的變化，都會(huì)影響小麥的生物發(fā)育及最終產(chǎn)量[1]。小麥為異源六倍體，基因組巨大，80%以上為重復(fù)序列。根系作為數(shù)量性狀極易受環(huán)境的影響，給小麥根系的科學(xué)研究帶來阻礙[2-4]。目前，對(duì)于小麥根系的研究較少，大多限于表型或正向遺傳學(xué)的研究方法。
功能標(biāo)記是與表型相關(guān)的功能基因基序中功能性單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)開發(fā)而成的新型分子標(biāo)記[5]。由于不需要進(jìn)一步驗(yàn)證就可以在不同的遺傳背景下確定目標(biāo)等位基因的有無，目前功能標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于品種的鑒定和分子輔助育種[6-8]。Ellis等[9]開發(fā)了矮稈基因Rht1、Rht2 和Rht8 的分子標(biāo)記；He等[10]開發(fā)的多酚氧化酶（PPO）活性等位基因[10]；He等[11-12]開發(fā)了八氫番茄紅素合成酶（PSY）等位變異基因；Jiang等[13]和Ma等[14]分別開發(fā)了TaSus2、TaCwi-A1等產(chǎn)量相關(guān)基因標(biāo)記；科研人員還研究了高低分子麥谷蛋白[15-17]、籽粒硬度[18]等品質(zhì)相關(guān)性狀功能標(biāo)記在以科農(nóng)9204和京411構(gòu)建的KJ-RIL群體中的分離情況。在此基礎(chǔ)上，筆者以科農(nóng)9204與京411構(gòu)建的KJ-RIL群體為材料，進(jìn)行苗期低氮、低磷及對(duì)照水培；對(duì)苗期根系性狀結(jié)合10個(gè)功能標(biāo)記進(jìn)行基因型分類匯總分析，研究不同氮磷條件下各功能基因?qū)π←湼档挠绊憽?/p>
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料
試驗(yàn)所用材料為科農(nóng)9204、京411及以兩者為親本構(gòu)建的188個(gè)F6：7代重組近交系群體（簡(jiǎn)稱KJ-RIL群體）。
1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)
試驗(yàn)共設(shè)3個(gè)處理：處理T1于2012年11月在北京（116.46° E；39.92° N）進(jìn)行，共21 d，對(duì)188個(gè)KJ-RIL群體的前1-94家系（KJ-RIL1-94）分別進(jìn)行正常對(duì)照（CK）、低氮（LN）和低磷（LP）處理；處理T2于2012年12月在北京（116.46° E；39.92° N）進(jìn)行，共28 d，對(duì)188個(gè)KJ-RIL群體的前1-94家系（KJ-RIL98-188）分別進(jìn)行正常對(duì)照（CK）、低氮（LN）和低磷（LP）處理；處理T3于2014年11月在石家莊（114.51° E；38.04° N）進(jìn)行，共16 d，對(duì)188個(gè)KJ-RIL群體的1-188家系（KJ-RIL1-188 ）分別進(jìn)行正常對(duì)照（CK）和低氮（LN）處理。
1.3 苗期根系性狀的表型測(cè)定
共設(shè)置對(duì)照（CK：2 mmol/L NO3-+0.2 mmol/L PO43-）、低氮（LN：0 mmol/L NO3-+0.2 mmol/L PO43-）和低磷（LP：2 mmol/L NO3-+0 mmol/L PO43-）共3個(gè)處理。營(yíng)養(yǎng)液配方參考An等[3]對(duì)小麥苗期氮吸收研究中所用方法。選種時(shí)挑選飽滿、均勻的小麥種子于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，5‰ H2O2浸泡處理24 h，然后用去離子水清洗3次并用適量去離子水浸泡放置于常溫，待其露白后置于4 ℃環(huán)境下2 d，取出置于常溫。7 d后長(zhǎng)至一葉一心期選擇生長(zhǎng)一致的健壯幼苗去胚乳移至1/2營(yíng)養(yǎng)液中緩苗3 d，再換為完全培養(yǎng)液培養(yǎng)液（pH=6.0）。培養(yǎng)箱放置于溫室內(nèi)，由吹氧機(jī)補(bǔ)氧（1 h/1 d），并隨機(jī)調(diào)換擺放位置。保持溫度夜間（125 ℃）、日間（225 ℃），相對(duì)濕度50%～70%，每日光照12 h，移栽后第n天取樣，測(cè)其株高（PH）、最大根長(zhǎng)（RL）、胚芽鞘長(zhǎng)度（CL）；將莖葉部和根部分開，利用ScanMaker i800 plus掃描儀（300 DPI分辨率）對(duì)根部掃描后應(yīng)用萬深LA-S根系分析系統(tǒng)批量處理分析根系圖片并逐一進(jìn)行精確修正獲得總長(zhǎng)（RL）、根表面積（RS）、根體積（RV）、根直徑（RD）和根尖數(shù)（RT）等參數(shù)。然后把幼苗放在烘箱里100 ℃殺青20 min，80 ℃烘干至恒重，稱量株干重（PDW）、根干重（RDW）、莖葉干重（SLDW）。
1.4 DNA的提取和PCR分析
采用CTAB法[19]提取供試材料的基因組DNA，略作調(diào)整。擴(kuò)增反應(yīng)在TakaRa PCR thermal cycler上進(jìn)行，25 μL體系中加入DNA（30 ng/μL）2 μL，10×Buffer 2 μL，Mg2+（25 mmol/L）1.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）1.5 μL，TaqE（5 U/μL）0.2 μL，Primer（25 μmol/L）1.5 μL + 1.5 μL；所有引物均使用降落PCR（Touchdown PCR），即94 ℃變性4 min，接著15個(gè)循環(huán)的復(fù)性溫度降落程序，每個(gè)循環(huán) 94 ℃變性45 s，65 ℃復(fù)性50 s（-1 ℃/循環(huán)）和72 ℃延伸55 s；最后30 個(gè)循環(huán)的普通PCR程序即：94 ℃ 變性40 s，50 ℃復(fù)性 40 s，72 ℃延伸40 s；最后72 ℃ 延伸5 min；擴(kuò)增結(jié)束后10 ℃保存。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用6%的聚丙烯酰胺非變性凝膠（39∶1）電泳進(jìn)行檢測(cè)，硝酸銀染色后，觀察并拍照。
1.5 分子標(biāo)記
該研究所用15個(gè)功能分子標(biāo)記信息見表1。其中小麥品質(zhì)相關(guān)功基因的能標(biāo)記包括Glu-B1、Ax2*、Glu-A3 、Psy-B1和 PPO[10-12，15-17]；產(chǎn)量相關(guān)功基因的能標(biāo)記包括TaCwi-A1和TaSus2-2B[13-14]；株高相關(guān)功基因的能標(biāo)記包括Rht-B1a和Rht-B1B[9] 。
2 結(jié)果與分析
2.1 科農(nóng)9204和京411的基因型分析
15個(gè)功能標(biāo)記在科農(nóng)9204和京411中的擴(kuò)增結(jié)果見圖1。擴(kuò)增結(jié)果顯示，高分子量麥谷蛋白亞基Glu-B1功能標(biāo)記ZSBy9aF1/R3在科農(nóng)9204中擴(kuò)增出662 bp目的片段，在京411中擴(kuò)增出707 bp的片段，結(jié)合高分子量麥谷蛋白SDS-PAGE結(jié)果，科農(nóng)9204在Glu-B1的等位基因是7+9，京411在Glu-B1的等位基因?yàn)?+12。同理，科農(nóng)9204在Glu-A3的等位基因是Glu-A3b或者Glu-A3d，京411在Glu-A3的等位基因是Glu-A3a或者Glu-A3c?？妻r(nóng)9204在TaCwi-A1具有降低粒重的TaCwi-A1b等位基因，京411在TaCwi-A1具有增加粒重的TaCwi-A1a等位基因。科農(nóng)9204在TaSus2-2B具有增加千粒重的優(yōu)異等位基因，而京411在TaSus2-2B具有降低粒重的非優(yōu)異等位基因?？妻r(nóng)9204在小麥籽粒硬度的關(guān)鍵基因位點(diǎn)Pinb-D1等位基因?yàn)镻inb-D1b，京411在該位點(diǎn)的等位基因?yàn)镻inb-D1a。科農(nóng)9204、京411在小麥黃色素含量基因Psy-B1的等位基因分別是Psy-B1b和Psy-B1c。而高分子谷蛋白Glu-A1亞基AX2、多酚氧化酶基因PPO等位基因PPO33僅在京411中檢測(cè)到1250和380 bp的目的片段，表明京411中含有高分子谷蛋白Glu-A1亞基AX2和多酚氧化酶基因PPO等位基因PPO33，科農(nóng)9204不含兩等位基因。矮稈基因功能標(biāo)記Rht-B1b和Rht-B1a分別在科農(nóng)9204和京411中檢測(cè)到237和237 bp的目的片段，表明科農(nóng)9204和京411在Rht-B1位點(diǎn)的等位基因分別是Rht-B1b和Rht-B1a。
2.2 功能標(biāo)記在188個(gè)KJ-RIL家系的基因型分析
由于同一基因的多個(gè)功能標(biāo)記表現(xiàn)為共分離，以10個(gè)基因位點(diǎn)對(duì)其在188個(gè)KJ-RIL家系中基因型值分離情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。由表2可知，Glu-B1、Ax2*、Glu-A3 、TaCwi-A1和TaSus2-2B位點(diǎn)在188個(gè)KJ-RIL家系中均符合1∶1分離比例；Psy-B1和 PPO共2個(gè)位點(diǎn)在188個(gè)KJ-RIL家系中不符合1∶1分離比例，遺傳比例均偏向京411。
2.3 不同處理功能基因?qū)Ω敌誀畹挠绊?/p>
2.3.1
高分子量麥谷蛋白Glu-A1。 由圖2可知，T3處理CK條件下，來自科農(nóng)9204 Glu-A1的等位基因AX2顯著增加小麥根系體積、根面積，LN條件下顯著增加小麥根系體積；T1、T2處理兩表基因型間雖未達(dá)顯著差異，但整體趨勢(shì)一致。因此，來自科農(nóng)9204 高分子量麥谷蛋白基因Glu-A1的等位基因AX2增加CK和LN條件下根體積以及LN條件下的根面積。
2.3.2
高分子量麥谷蛋白Glu-B1。由圖3可知，T1和T3處理CK條件下，來自于科農(nóng)9204 Glu-B1的等位基因7+9相對(duì)于京411的2+12 顯著降低小麥根系的總根長(zhǎng)、根面積、根體積；另外，CK條件下的根尖數(shù)，LN條件下苗期株高、總根長(zhǎng)、根面積雖僅在T1處理兩基因型表型間差異顯著，但在T2和T3處理中整體趨勢(shì)一致。因此，高分子量麥谷蛋白Glu-B1的等位基因7+9相對(duì)2+12顯著降低CK條件下小麥根系總根長(zhǎng)、根面積、根體積，以及LN條件下根系根尖數(shù)以及苗期株高。
2.3.3 細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶TaCwi-A1。由圖4可知，T3處理中CK和LN條件下，相對(duì)于京411增加粒重的TaCwi-A1a等位基因，來自于科農(nóng)9204具有降低粒重效應(yīng)的TaCwi-A1等位基因TaCwi-A1b可顯著提高小麥根系根尖數(shù)和主根長(zhǎng)，其中根尖數(shù)在T1和T2處理中整體趨勢(shì)一致，但主根長(zhǎng)在低氮低磷環(huán)境下表型復(fù)雜多變。T2處理中LN條件下，TaCwi-A1b相對(duì)于TaCwi-A1a可提高總根長(zhǎng)、根尖數(shù)。因此，相對(duì)于TaCwi-A1a，細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶TaCwi-A1等位基因TaCwi-A1b顯著增加CK條件下的小麥根系主根長(zhǎng)、根尖數(shù)，以及LN條件下的總根長(zhǎng)、根尖數(shù)。
2.3.4
黃色素含量基因Psy-B1。由圖5可知，T2和T3處理中CK和LN條件下，相對(duì)于來自京411的Psy-B1c，來自于科農(nóng)9204 Psy-B1的等位基因Psy-B1b顯著增加小麥根系主根長(zhǎng)。
2.3.5 多酚氧化酶PPO。 由圖6可知，CK條件下，T1處理中相對(duì)于來自于京411的等位基因Ppo-A1b，來自于科農(nóng)9204 PPO的等位基因Ppo-A1a顯著降低根體積，但與T3處理的整體趨勢(shì)不一致；LN條件下，無明顯效應(yīng)；LP條件下，相對(duì)于來自于京411的等位基因Ppo-A1b，T1處理中來自于科農(nóng)9204 PPO的等位基因Ppo-A1a顯著降低小麥根系總根長(zhǎng)、根面積、根尖數(shù)，與T2處理趨勢(shì)一致。
因此，在CK和LN氮條件下，PPO33對(duì)根系影響復(fù)雜，且易受環(huán)境影響；LP條件下PPO的等位基因Ppo-A1a相對(duì)于Ppo-A1b可顯著降低小麥根系總根長(zhǎng)、根面積和根尖數(shù)。
2.3.6
矮稈基因Rht-B1b和Rht-B1a。由圖7可知，T1、T2處理中CK、LN、LP條件下，來自于科農(nóng)9204的突變型Rht-B1a和來自于京411的野生型Rht-B1b均顯著降低小麥苗期株高。
2.3.7 低分子量麥谷蛋白基因GluA3。與來自京411等位基因Glu-A3a/Glu-A3c相比，CK條件下T1處理中來自科農(nóng)9204的等位基因Glu-A3b/Glu-A3d顯著增加小麥苗期株高、根系總根長(zhǎng)、根面積、根體積；T2處理雖未達(dá)顯著水平，但基本一致；T3處理的一致性較差； LN條件下，T1處理增加苗期株高，但T2處理降低株高； LP條件下，T1、T2、T3處理各根系性狀基因型間無顯著差異。由此可見，低分子量麥谷蛋白基因GluA3對(duì)根系影響復(fù)雜，且在不同環(huán)境中表達(dá)不穩(wěn)定。
2.3.8
蔗糖合成酶基因TaSus2。相對(duì)于來自于京411無此標(biāo)記的家系，在CK條件下T3處理中含來自科農(nóng)9204的高千粒重單倍型功能標(biāo)記Sus2-SNP-185/589H2的家系主根長(zhǎng)顯著增大，與T2、T1處理的整體趨勢(shì)不一致；相對(duì)于來自于京411無此標(biāo)記的家系，在LN和LP條件下T2處理中含來自科農(nóng)9204的高千粒重單倍型功能標(biāo)記Sus2-SNP-185/589H2的家系小麥根系面積、根體積、總根長(zhǎng)、根尖數(shù)顯著降低，T2、T1處理的整體趨勢(shì)不一致。因此，蔗糖合成酶基因TaSus2對(duì)根系影響復(fù)雜，且在不同環(huán)境中表達(dá)不穩(wěn)定。
2.3.9
籽粒硬度Pinb。在CK、LN、LP條件下，T1、T2、T3處理中根系各性狀中均未檢測(cè)到顯著差異。因此，籽粒硬度相關(guān)基因Pinb對(duì)根系無顯著性影響。
3 結(jié)論與討論
功能基因組學(xué)和生物信息學(xué)的飛速發(fā)展、基因功能標(biāo)記的開發(fā)與應(yīng)用為小麥等重要農(nóng)作物分子育種以及品種鑒定帶來了新思路、新發(fā)展。該研究基于功能基因的“一因多效”，將標(biāo)記檢測(cè)信息和小麥根系性狀緊密聯(lián)系起來，建立一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，分析已知功能基因?qū)π←溍缙诟抵鞲L(zhǎng)、根體積、根面積、根尖數(shù)以及總根長(zhǎng)的遺傳效應(yīng)。
高分子谷蛋白Glu-B1以及Glu-A1亞基AX2不同等位基因在對(duì)照、低氮處理中顯著影響小麥根系總根長(zhǎng)、根體積和根面積；多酚氧化酶PPO等位基因PPO33在低磷處理中顯著影響小麥根系的總根長(zhǎng)、根面積和根尖數(shù)；黃色素含量基因Psy-B1不同等位基因在正常和低氮條件下顯著影響小麥根系的主根長(zhǎng)。這表明高分子谷蛋白Glu-B1、Glu-A1，多酚氧化酶PPO，黃色素含量基因Psy-B1等除影響小麥高分子谷蛋白含量、多酚氧化酶活性、黃色素含量外，對(duì)小麥根系的生長(zhǎng)也有一定的影響。
前人有研究表明，小麥株高與根系呈正相關(guān)，而該試驗(yàn)顯示多環(huán)境多處理下Rht-B1b和Rht-B1a對(duì)苗期株高均有顯著影響，但對(duì)根系一系列性狀無明顯遺傳效應(yīng)，表明小麥根系不受矮稈基因Rht-1影響。
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